מֵידָע

בטיחות ביולוגית Lentivector

בטיחות ביולוגית Lentivector


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

שימוש נרחב ב-Lentivectors בביולוגיה מולקולרית, לרוב כדי להעביר בצורה יציבה גן רצוי. מערכת וקטורית אלו מנצלת את יכולתם של וירוסים להחדיר את הגנום שלהם בתא המארח. כך מעבירים את ה-lentivectors לקו תאי מפיק (בדרך כלל HEK) ושם מיוצרים וירוסים עם התוספת הרצויה. בסופו של דבר וירוסים אלה ייאספו ושורות התאים הרצויות יועברו.

מטעמי בטיחות ביולוגית, מערכת זו מתוכננת באופן שהסיכון הנשקף מ"מערכת הווירוס" מצטמצם. לפיכך הנגיפים המיוצרים על ידי מערכת זו אינם מסוגלים לשכפל, כלומר בכך שלמיטב הבנתי, הווירוסים שנוצרים אינם מסוגלים להיווצר יותר במארח השני מכיוון שהגנים האחראים אינם מגויסים. עם זאת, ככל הנראה הפלסמידים המשמשים יכולים לשלב מחדש ולהוות אפשרות ליצור וירוס בעל יכולת שכפול. אולם עד כמה שמצאתי בספרות זה מעולם לא זוהה ועומד כאפשרות תיאורטית.

השאלה הראשונה שלי, במספרים ממשיים, מה ההסתברות שאירוע כזה יתרחש (מספר הקומבינציות במקומות הספציפיים). במקרה שזה יקרה, מערכת ה-lentivector תהיה עלולה להיות מסוכנת, מכיוון שמערכת זו מבוססת על HIV רוב הפעמים. בנוסף, וקטורים אלה אינם משתמשים בחלבון מעטפת ה-HIV האנדוגני אלא ב-VSV/G מנגיף הסטומטיטיס שלפוחית, על מנת להגביר את הטרופיזם והיציבות.

בנוסף, למרות שמקורו ב-HIV, רוב הגנים של ה-HIV נלקחים מה-lentivectors, אך לדעתי החשובים ביותר נמצאים שם. שאלה שנייה, בהתחשב בכל זה, וירוס "נוצר" תיאורטי זה יוכל בסופו של דבר לגרום לאיידס או כל השפעה שלילית אחרת? ראוי לציין שעכשיו הוא מסוגל להדביק כמעט את כל התאים האנושיים בגלל חלבון VSV, אז האם זה נכון לחשוב שהמחלה תהיה הרבה יותר גרועה, ומדבקת הרבה יותר מה-HIV המקורי? שימו לב שאפילו היציבות מוגברת.

עם זאת, אני יכול גם לחשוב שהנגיף החדש הרקומביננטי הזה אכן עלול להיהרס על ידי המערכת החיסונית, למרות הטרופיזם המוגבר, בשל העובדה שנגיף סטומטיטיס שלפוחית ​​אינו גורם לפתולוגיות בבני אדם, ואולי החלבון הזה פועל כאנטיגן ויכול לגרום לתגובה חיסונית מספיק.

אחרון, האם וירוס רקומביננטי תיאורטי יתגלה בבדיקת HIV סטנדרטית?

כדי לפשט את הדברים, אני מתכוון לדור שלישי למענקים


כמה רקומבינציות נדרשות כדי להשיג וירוס פעיל?

ה-FDA זיהה את הסבירות שניתן להמיר את ה-lentivectors לשכפול פעיל של lentivirus אם הם עוברים רקומבינציה עם HIV מסוג פרא בחולה חיובי ל-HIV. במקרה זה, נדרשים שני אירועי רקומבינציה כדי להעביר את רצף ה-lentivector לרצף ה-HIV (מנגנון ההעברה זהה למקרה של lentivectors מהדור הראשון).

מאמר זה מ-VCU מתאר מנגנון נוסף שדרכו זה יכול להתרחש דור ראשון מערכות lentivector, המורכבות משני אירועי רקומבינציה בין ה-lentivector לפלסמיד המסייע. שימו לב ש-3 הגנים גאג, פול ו env נמצאים על אותו פלסמיד, והפלסמיד הזה מוקף על ידי LTRs. דור שני לנטיווקטורים, כגון מערכת pLKO, אינם סובלים מבעיה זו ודורשים HIV מסוג פראי כדי לייצר lentivirus משכפל פעיל.

כדי להקטין את הסבירות שזה יקרה, מערכות לנטיווקטור מהדור השני והשלישי פיצלו את הגנים למספר פלסמידים, אשר לאחר מכן דורשים יותר אירועי רקומבינציה כדי לייצר וירוסים מוכשרים לשכפול. בנוסף, זנב ה-polyA של ה-3' LTR מוחלף כדי להפחית את הסבירות להתרחשות אירועי רקומבינציה.

לפי המאמר של Addgene על בטיחות ביו-לנטיבקטור, לפלסמיד ההעברה של הגן המעניין (גם דור שני וגם דור שלישי) יש מחיקה באזור 3' LTR שמונעת ממנו להפוך לפעיל באופן רפליקטיבי. לכן, הסבירות היחידה להתרחשות הרקומבינציה היא שקו התאים המבטא את הנגיף יעבור שכפול עם זן HIV פעיל מסוג פראי. דוגמה לכך היא פלסמיד העברת pLKO זה, המכיל LTR קטום 3', המונע מהרצף להשתכפל מחוץ ל אי - קולי, אשר משכפל אותו לא באמצעות LTR אלא באמצעות מקור הפלסמיד של שכפול.

האם הנגיפים הפעילים המיוצרים על ידי רקומבינציות מסוכנים יותר בטבע מאשר HIV מסוג פראי?

קשה לענות על כך, שכן רקומבינציה מאפשרת רק יצירת וירוס פעיל, אך היא אינה מבטיחה שהנגיף יהיה מסוכן. וירוסים מסוכנים אפשריים תיאורטית, אך דורשים הרבה יותר רקומבינציות מה-2 המינימליות ליכולת שכפול במערכות לנטיבקטור דור 2.

לדוגמה, מערכות lentivector בדרך כלל אינן מקודדות לחלבונים הנגיפיים vpr, vif, nef ו vpu. חלבונים אלו נחוצים להגברת הזיהומים של HIV בסוגים שונים של רקמות (אך לא תאים מתורבתים כגון HEK293). היעדר חלבונים אלה במכשיר מוכשר לשכפול היפותטי יעכב משמעותית את התפשטותו בטבע. שילוב של חלבונים אלה הוא סביר אך מאוד לא סביר, שכן יידרשו אירועי רקומבינציה מוצלבים נוספים.

כדי להשתמש בדוגמה שלך, ה env קידוד החלבון למעטפת החלבון VSV נמצא בפלסמיד המעטפת. מכיוון שה-Lentivector המוכשר לשכפול שנוצר על ידי 2 אירועי רקומבינציה יהיה פסאודוטייפ המכיל רק את HIV env חלבונים, הוא יצטרך לרכוש עוד יותר את הגן VSV כדי להחליף אותו env חלבונים, מכיוון שגנים אלה אינם נמצאים באותם אזורים. אין הומולוגיה בין שני גדילי ה-DNA, מה שיקשה באופן משמעותי על הסבירות שהגן VSV ייכלל איכשהו ב-HIV פעיל.

הוספה של חלבונים כימריים ואזורי LTR שונים ב- lentivectors דור 3 רק מסבכת את העניין.

בסך הכל, לא הצלחתי למצוא מקורות כלשהם המשווים את מידת ההדבקות של ה-HIV הטרנסגני התיאורטי האלה לעומת סוג הבר. עם זאת, למרות שבאופן תיאורטי אפשרי שללנטיבטור מוכשר לשכפול טרנסגני יכול להיות טרופיזם טוב יותר מאשר HIV על ידי רכישת הגן VSV, הסבירות שזה יתרחש נמוכה בהרבה מזו של יצירתו מלכתחילה.

האם ניתן לזהות חומר עזר בבדיקת HIV?

לגבי השאלה הסופית האם ניתן לזהות lentivector בבדיקת HIV רגילה, התשובה היא שהגילוי אפשרי אם האדם שנדבק ב- lentivector השיג תגובה חיסונית לחלבוני הגאג של lentivector, ועומסי lentivector הם מספיק גבוה.

בדיקות HIV הן ספציפיות לחלקים שונים של הנגיף, אך רובן מכוונות לחלבון הנגיפי p24, שהוא מרכיב של בְּדִיחָה פוליפרוטאינים.

קיימות גם בדיקות HIV מבוססות PCR, אך בדיקות אלו יהיו תלויות בפריימרים הספציפיים המיוצרים והאם ה-RT-PCR יפיק אמפליקון בהתחשב ברצף הספציפי של הפלסמידים.

מכיוון שמקודדים לגנים של gag ברוב מערכות ה-lentivector, לכן סביר מאוד שכל מי שנדבק ב-lentivector יבטא נוגדנים כלפי p24, ולכן יביא לחיוב עבור ELISA כמו גם לבדיקות Western blot בהנחה שה-p24 ו-p24 כמויות הנוגדנים גבוהות מספיק כדי להגיע לנקודת החיתוך.

לא הצלחתי למצוא רמות חיתוך זמינות לציבור עבור רמות ה-ELISA וה-Western blot, אבל אם (באופן היפותטי) אדם היה מוזרק עם עומס של lentivectors, סביר להניח שהוא ימצא חיובי ל-HIV. עם זאת, מכיוון שה-lentivector אינו מתרבה באופן פעיל, הוא יתנקה במהירות על ידי המערכת החיסונית.


היצמדות ממושכת של חלקיקי וקטורים שמקורם בנגיף כשל חיסוני אנושי לתאי מטרה המטופואטיים מובילה להתמרה משנית במבחנה ובאינבו

וקטורים מסוג lentivirus מסוג 1 של וירוס אנושי הנושאים את גליקופרוטאין מעטפת ה-VSV-G) מדגימים מגוון מארח רחב ויכולים להעביר תאי גזע המטופואטיים שקטים ביציבות. לאור החששות לגבי בטיחות ביולוגית והעברת קו נבט פוטנציאלית, הם שימשו בעיקר עבור אסטרטגיות ex vivo, שנחשבות להבטיח הסרה של עודפי חלקיקים הקשורים לפני השטח ולמנוע הפצה in vivo. מחקרים המוצגים כאן חושפים במקום היצמדות חלקיקים ממושכת לאחר חשיפה לשעבר של vivo, למרות נהלי שטיפה סדרתית, עם התמרה שלאחר מכן של תאי מטרה משניים בתרבויות משניות ישירות ו-transwell. בדקנו את הפרמטרים הקריטיים המשפיעים על שימור והעברה של חלקיקים והראנו שהתקשרות למשטח התא מגינה באופן סלקטיבי על חלקיקי הווירוס מפני אי-אקטיבציה בתיווך סרום. יתרה מזאת, מחקרים עם נמענים של עכברים ללא מיאלואבלציה מראים שהשתלה של תאים המטופואטיים חשופים וקטורים, גורמת להפצה מערכתית של חלקיקי VSV-G/lentivector פונקציונליים. אנו מדגימים סימון גנטי על ידי העברה בשוגג של חלקיקי וקטור וביטוי ממושך של תוצר טרנסגן ברקמות הנמען. לממצאים שלנו יש השלכות על בטיחות ביולוגית, עיצוב וקטור ומחקר ביולוגיה של התא.

דמויות

ביטוי GFP בתאי 293T...

ביטוי GFP בתאי 293T לאחר תרבות משותף עם תאי WBM של עכברים חשופים לווירוס. 293T…

העברה של מדבקה זיהומית ל...

העברה של חומר מדבק מדבק לתאי מטרה משניים אינו מצריך מגע בין תא לתא...

העברת חלקיקים וקטורית ומשני...

העברת חלקיקים וקטורית והתמרה משנית אינם מייצגים פסאודו-טרנסדוקציה ומתרחשות באופן עצמאי...

חלקיקי וקטור המחוברים למטרה...

חלקיקי וקטור המחוברים לתאי מטרה, אך לא אלה בהשעיה, הם במידה רבה...

ביטוי GFP במארח CD45.2...

ביטוי GFP בתת-קבוצות לויקוציטים בדם היקפי מארח CD45.2 גנוטיפ בנציג...

ביטוי GFP ברקמות עכברים...

ביטוי GFP ברקמות עכברים מבעלי חיים 15 שבועות לאחר הזרקת GFP...

התמדה של רצף פרווויראלי ב...

התמדה של רצף פרווויראלי ברקמות מארח. (א) הגברה של רצף GFP על ידי...


פיתוח וקטורים Lentiviral עם ביטוי אפיתל נשימתי מוסדר ב-Vivo

פיתוח וקטורים להעברת גנים עם ביטוי מוסדר וספציפי לריאות יהווה כלי שימושי ללימוד ביולוגיה של הריאות ופיתוח טיפולי גנים. במחקר זה בנינו סדרה של וקטורים לנטי-ויראליים עם אלמנטים רגולטוריים שצפויים לייצר ביטוי טרנסגן ספציפי לריאות: פרומוטור חלבון C של פעיל שטח (SPC) לביטוי תאי אפיתל מסוג II (AECII), חלבון 10-kD של תא קלרה (CC10). ) עבור ביטוי תאי קלרה בדרכי הנשימה, ומקדם ה-Jaagskiete sheep retrovirus (JSRV) לביטוי בשני סוגי התאים. ביטוי טרנסגן מהוקטורים SPC ו-CC10 הוגבל לשורות תאים AECII ו-Clara, בהתאמה, בעוד שביטוי מווקטור JSRV נצפה במספר סוגי תאים נשימתיים ולא נשימתיים. לאחר משלוח תוך קנה הנשימה של supernatant lentivector לעכברים, ביטוי טרנסגן נצפה ב-AECII מה-SPC lentivector, ובתאי קלרה מה-lentivector המקודם CC10. ביטוי טרנסגני לא זוהה ברקמות שאינן נשימתיות לאחר מסירה תוך ורידית של וקטורים lentiviral CC10 ו-SPC למקבלי עכברים. לסיכום, שילוב של אלמנטים רגולטוריים גנומיים מהגנים SPC ו-CC10 הביא לביטוי טרנסגן ספציפי לנשימה בַּמַבחֵנָה ו in vivo. וקטורים אלו יספקו כלי שימושי לחקר ביולוגיה של הריאות ולפיתוח של טיפולים גנטיים להפרעות ריאות.

וקטורים אלה ישפרו את הבטיחות של יישומי ריפוי גנטי בריאות. הם יהיו שימושיים גם למדענים בסיסיים, לכוון ביטוי ספציפי לריאות של גנים ו/או לעקוב אחר צאצאיהם של תאי גזע שעברו התמרה.

וקטורים המבוססים על נגיף הפרבו האנושי הלא-פתוגני, נגיף אדנו-אסוציאציה (AAV), נבדקים גם לגבי מסירת גנים לריאה (5). וקטורים רקומביננטיים של AAV יכולים להשתלב בתאים, אך נשמרים לעתים קרובות יותר כאפיזום המדולל או אובד עם חלוקת התא (5, 6). יתר על כן, גודל ההחדרה הקטן שלהם מקשה על ייצור וקטורים רקומביננטיים עם יחידות שעתוק גדולות כמו פרומוטור ספציפי לאפיתל המבטא את מווסת הטרנסממברנה של סיסטיק פיברוזיס, שאורכו יכול להיות 8 קילובייט או יותר.

מערכות העברת גנים לא נגיפיות באמצעות ליפוזומים או DNA עירום שימשו גם להעברת גנים לאפיתל הנשימה (7, 8). היתרונות של מערכות אלו הם שניתן להעביר קלטות טרנסגניות ללא רצפים ויראליים, וכי ניתן להעביר גנים גדולים או מרובים ללא קשר למצב השגשוג ולפרופיל הקולטן של פני התא של תא המטרה. עם זאת, היעילות הכוללת של העברת גנים נמוכה, גנים ממעטים להשתלב, והווקטורים הולכים לאיבוד בתאים מתרבים, ולכן גישה זו אינה שימושית להשגת טיפול גנטי יציב לטווח ארוך.

עבור טיפולים גנטיים ארוכי טווח או מחקרים ביולוגיים, נדרש וקטור שיכול להשתלב ביעילות בגנום תא המטרה (9). רטרו-וירוס מסוג "C" כגון נגיף לוקמיה עכבר מולוני, או נגיפי לנטי כגון HIV-1, משתלבים ביציבות בגנום של תא המטרה. מחיקת רצפי הקידוד למוצרי גנים ויראליים הופכת את שכפול וקטורי העברת הגנים לבלתי-מוכשרים והופכת 6-8 קילובייט זמין להחדרת הגנים הרצויים (10). וקטורים להעברת גנים Lentiviral יכולים לעבור ולהשתלב בתאים שאינם מתחלקים, עם זאת, הם בדרך כלל מעבירים תאים מתחלקים בצורה יעילה יותר (11-13).

וקטורים להעברת גנים Lentiviral, כגון וקטור CCL שפותח על ידי Zufferey ועמיתיו מכילים ~ 10% מהגנום פראי HIV-1 (14). וקטורים לנטי-ויראליים רקומביננטיים עם פסאודוטיפוס עם חלבון סטומטיטיס G שלפוחית ​​(VSV-G) יכולים להעביר מגוון רחב של תאים שאינם מתחלקים. מספר מחקרים הוכיחו העברה של גנים לנטיויראליים של וקטורים מבוססי HIV-1 או FIV לאפיתל נשימתי בתרביות אפיתל שקטים ומקוטבים בַּמַבחֵנָה (15, 16) או תאי אפיתל באף, דרכי הנשימה, הסימפונות והמכתשית in vivo (16–20). ניתן לזהות תאים שעברו התמרה לפרקי זמן ארוכים in vivo, מה שמציע כי וקטורים אלה יכולים להשתלב בתאים ארוכים, או אבות נשימתיים, התורמים צאצאים לפרקי זמן ארוכים.

דרישה שנייה לטיפול גנטי היא הביטוי הטרנסגן העקבי ומוסדר השושלת. בעוד שביטוי טרנסגן מכונן עשוי להתאים ליישומים של ריפוי גנטי בחסרים של גנים לשמירה על הבית, כגון מחלת אחסון ליזוזומלית או חסרי אנזימים אחרים, הוא לא יהיה מקובל עבור הפרעות אחרות הדורשות ויסות של ביטוי טרנסגן. זה חשוב במיוחד לאחר התפתחות לוקמיה בחולי X-SCID המקבלים תאים המטופואטיים המועברים רטרו-ויראלית עם ה-cDNA של שרשרת γ הנפוצה, עקב חוסר ויסות של פרוטו-אונקוגנים בגנום מהמשפרים הרטרו-ויראליים החזקים מהווקטור המשולב (21).

עבור ביטוי טרנסגן מוגבל של שושלת מוקטורים lentiviral, ניתן להשתמש בעיצוב וקטור מנטרל עצמי שבו האמרגן הנגיפי והמשפר באזור U3 של ה-3′ long terminal repeat (LTR) מוסרים מהפלסמיד הווקטורי. במהלך האינטגרציה, אזור ה-U3 של ה-3'LTR מועתק ל-5'LTR, ובכך גורם לחיסול של מקדם הנגיף 5' בפרו-וירוס המשולב (14, 22). הטרנסגן יכול לבוא לידי ביטוי מפרומוטור/יסודות רגולטוריים פנימיים ספציפיים או מווסתים. וקטורים Lentiviral שימשו לביטוי טרנסגנים מוסדר במגוון שושלות כגון לימפוציטים B (23), לימפוציטים T (24, 25), או אריתרוציטים (26, 27), אולם הם לא תוארו עבור סוגי תאי נשימה.

במחקרים אלה אנו מתארים את הפיתוח וההערכה של סדרה של וקטורים לנטי-ויראליים שבהם טרנסגן של סמן חלבון פלואורסצנטי מוגבר (EGFP) מתבטא ממקדמים ואלמנטים רגולטוריים שצפויים לספק ביטוי ספציפי לאפיתל דרכי הנשימה ו/או המכתשית. המקדמים התאיים שהוערכו במחקר זה הם מהגנים של חלבון פעיל השטח C (SPC) (28) או הגנים הפרשה של תא Clara 10-kD (CC10) (29) כדי לספק אפיתל מכתשית מסוג II (AECII) או ביטוי מוגבל של תאי קלרה, בהתאמה. האמרגן מ- Jaagskiete sheep retrovirus (JSRV), אשר צפוי להתבטא גם בתאי AECII וגם בתאי קלרה (30), הוערך גם כן. פרופיל השושלת של ביטוי טרנסגן מ-lentivectors עם כל אחד מהמקדמים הללו הוערך בשורות תאים בַּמַבחֵנָה ובריאות אחרי in vivo משלוח של סופרנטנט ויראלי לעכברים. מחקר זה מתאר את התפתחותם של וקטורי לנטי-וירוס עם ביטוי טרנסגן ספציפי לאפיתל נשימתי, אשר יקל על פיתוחם של טיפולי גנים ריאות וחקר התפתחות הריאות והביולוגיה.

עמוד השדרה הווקטור ההלנטי-ויראלי ששימש במחקר זה היה הווקטור המשבית את עצמו pCCL שסופק על ידי ד"ר לואיג'י נלדיני (CellGenesys, סן פרנסיסקו, קליפורניה) (14). בעמוד השדרה הזה, המשפרי הנגיפי ותיבת ה-TATA באזור פרומוטור U3 של ה-3'LTR נמחקו. זה גורם לשתק של הפרומוטור בפרו-וירוס המשולב, מכיוון שאזור U3 של ה-3'LTR מועתק ל-5'LTR במהלך האינטגרציה.

עמוד השדרה הווקטור הבסיסי, CCL-X-EGFP, מכיל אתר ריבוי שיבוט (X) במעלה הזרם של גן הכתב EGFP שאליו ניתן היה להחדיר את מקדמי הבדיקה. עמוד השדרה הווקטורי הזה שימש גם בקרה שלילית "ללא מקדם". מקדם ה-SPC האנושי נחקר עבור ביטוי ספציפי ל-AECII (28). מקדם CC10 של חולדה הוערך עבור ביטוי ספציפי לדרכי הנשימה בתאי קלרה (29). מקדמי CC10 ו-SPC היו מד"ר ג'פרי ויטסט (המרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי, סינסינטי, OH). לביטוי הן בתאי AECII והן בתאי קלרה, הערכנו את האמרגן מאזור U3 של ה-JSRV מ-Dr. Hung Fan (אוניברסיטת קליפורניה, Irvine, CA) הוערך. ה-lentivector עם האמרגן המכונן מהמקדם/משפר הרטרו-ויראלי MND LTR (31) סופק על ידי ד"ר דונלד ב. קון (בית החולים לילדים בלוס אנג'לס, לוס אנג'לס, קליפורניה) ושימש כווקטורי בקרה חיוביים במחקרים אלה.

סופרנטנטים לנטיו-ויראליים בצורת פסאודו-טיפוס של VSV-G הופקו על ידי טרנספקציה משולשת של קו התאים של הכליה העוברית האנושית 293T כפי שתואר קודם לכן (23). בקצרה, 5 × 10 6 תאי 293T נזרעו בצלחות תרבית רקמה באורך 10 ס"מ, מטופלות בצלחות תרבית רקמה באורך 10 ס"מ בפולי-L-ליזין (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).למחרת, התאים הועברו טרנסfected עם 10 מיקרוגרם מהפלסמיד הווקטור, 10 מיקרוגרם מהפלסמיד האריזה 8.9 (10) (שאינו מבטא חלבוני עזר של HIV-1), ו-2 מיקרוגרם של פלסמיד pMDG-VSV-G באמצעות טרנספקציה רגילה של סידן פוספט. עבור הכנות סופרנטנט ויראלי גדול יותר, כל הרכיבים של תרבית הטרנספקציה הוגדלו על ידי יומן אחד עבור צלחות תרבית רקמה בגודל 500 ס"מ 2 (Costar, Lowell, MA). 16 שעות לאחר מכן הוסר המדיום, והתאים נשטפו עם PBS ולאחר מכן נחשפו ל-10 mM נתרן בוטיראט (Sigma-Aldrich) למשך 8 שעות. הסופרנטנט נאסף ב-72 עד 96 שעות לאחר ההעברה ורוכז בצנטריפוגה ב-25,000 סל"ד למשך 90 דקות בקולטר בקמן: Optima L-90K Preparative Ultracentrifuge ברוטור דלי מתנדנד (SW32Ti) (Beckman Coulter, Fullerton, CA). מכיוון שהפרומטרים מכל הווקטורים הוויראליים לא יתבטאו בסוג תא בודד, טיטרים גולמיים נקבעו לאחר הוספת דילולים סדרתיים של סופרנטנט ויראלי בתוספת 8 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן (Sigma-Aldrich) לסוג תא המבטא כל פרומטור. הווקטורים SPC ו-JSRV עברו טיטר על תאי MLE-12 או MLE-15 והווקטור CC10 על H441. הטיטרים הגולמיים חושבו על ידי:

מכיוון שיעילות ההמרה לא הייתה שווה ערך בין כל שורות התאים, כל שורת תאים הועברה בו-זמנית עם הביקורת החיובית CCL-MND-EGFP, כדי לנרמל את הטיטר ליעילות העברת הגנים על תאי 293A (Invitrogen, Carlsbad, CA). הטיטרים המנורמלים שימשו לחישוב ריכוז הנגיף ולביצוע דילולים עבור כל ניסוי.

עבור ניסויי התמרה, 1 × 10 5 תאים צופו בכל באר של צלחת שטופלה בתרבית רקמה בעלת 6 בארות. למחרת, המדיום הוחלף בסופרנטנט לנטיויראלי והוסף לו 8 מיקרוגרם/מ"ל של פוליברן. המדיום סופרנטנט הוקטור הוחלף למחרת בבוקר במצע גידול טרי. התאים הועברו לפי הצורך ושיעור התאים המבטאים EGFP נקבע על ידי ציטומטריית זרימה 5 עד 7 ימים לאחר מכן.

לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה של ביטוי טרנסגן של EGFP, תאים עברו טריפסין, נשטפו ב-PBS והוקפאו מחדש בתמיסת מלח (Invitrogen) נטולת אינדיקטורים של הנקס. הדגימות נותחו על FACs Calibur באמצעות תוכנת Cellquest (Becton Dickson, San Jose, CA).

עכברים נקבות C57B6J בהריון מתוזמן נרכשו ממעבדות ג'קסון (בר הארבור, ME), והעירומים האתימיים בני 6 עד 8 שבועות נרכשו מהארלן ספראג דאולי (אינדיאנפוליס, אינדיאנפוליס). כל העכברים נשמרו בבית החולים לילדים בלוס אנג'לס במתקן החיות המרכזי של מכון המחקר סבן למשך כל תקופת המחקר. כל המחקרים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים בבית החולים לילדים בלוס אנג'לס.

בזמן ההרג, עכברים הורדמו על ידי משלוח תוך צפקי של נתרן פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג). חללי בית החזה והבטן נפתחו בניתוח, עורק הכליה חתך, והחיה ספגה לפחות 10 מ"ל של PBS דרך החדר הימני של הלב. הריאות נופחו בתרכובת Tissue-Tek OCT (Fisher Scientific, Tustin, CA) דרך צנתר תוך ורידי בגודל 22 גו' שהוכנס לקנה הנשימה. הריאות, קנה הנשימה, הלב, התימוס, הכליות, המעי, הכבד, הטחול ושרירי השלד נקצרו לצורך ניתוח חיסוני EGFP וניתוח DNA פרובירלי. לניתוח אימונופלואורסצנטי פיסות רקמה הוטבעו במדיום OCT ואוחסנו ב-80 מעלות צלזיוס עד לחיתוך וניתוח אימונופלואורסצנטי לביטוי EGFP כמתואר להלן. מנות רקמות נאספו גם לניתוח DNA פרווויראלי על ידי הקפאה מהירה בחנקן נוזלי ואחסון ב-80 מעלות צלזיוס עד לחילוץ.

כדי להעריך את פרופיל השושלת של ביטוי טרנסגן ברקמות ראשוניות, לעכברים הוזרקו סופרנטנט לנטיויראלי או תוך ורידי או תוך קנה הנשימה. מתן תוך ורידי בוצע כמתואר (32). בקצרה, כל גור ילודים C57B6J ביום 0 קיבל 1 × 10 8 יחידות בינלאומיות (iu) מדוללות ל-50 μl עם תמיסת מלח סטרילית ללא חומרים משמרים ו-8 מיקרוגרם/מ"ל פוליברן שנמסרו דרך וריד הפנים. הגורים שקלו בין 1.3 ל-1.8 גרם בזמן ההזרקה, מה שהביא למינון וקטור של 5.5 עד 7.7 × 10 7 iu/g. לאחר ההזרקות, הגורים הוחזרו לקן שלהם, הונקו ונגמלו לפי פרוטוקולים סטנדרטיים.

עבור משלוח תוך קנה הנשימה של תערובת lentivirus/keratinocyte growth factor (KGF), הרדמה נגרמה עם 5% איזופלואורן ונשמרה עם 2.5% איזופלוארן בעכברים עירומים אתיים בני 6 עד 8 שבועות (Harlan, Indianapolis, IN). הצוואר הורחב ונוקה בתמיסת כלורהקסידין. חתך קטן בקו האמצע נעשה עם אזמל סטרילי כדי לחשוף את קנה הנשימה. נפח כולל של 50 μl המכיל 1 × 10 8 חלקיקי וקטור (המושעים במי מלח 0.9% עם 5 מ"ג/ק"ג אנושי רקומביננטי [rh] KGF) הוזרק לקנה הנשימה באמצעות מזרק אינסולין 0.5 סמ"ק עם מחט 28-Ga (Becton -דיקסון). עכברי הבקרה קיבלו משלוח תוך קנה הנשימה של 50 μl מלוחים מעורבבים עם 5 מ"ג/ק"ג rhKGF. לאחר ההזרקה, הפצע טופל ב-1 עד 2 טיפות של bupivicane (כהרדמה מקומית) ונסגר עם דבק רקמות. לעכברים ניתנו אנטיביוטיקה (Maxim-200 μg/ml במים סטריליים) למשך חודש וקטופרופן תת עורית ביום הניתוח, וביום שלאחר הניתוח. העכברים נהרגו 1 עד 6 שבועות לאחר ההזרקה לצורך ניתוח ביטוי EGFP.

ריאות קפואות נחתכו ב-5 מיקרומטר על קריוסטט CM1900 (Leica, Bannockburn, IL) והונחו על שקף זכוכית פלוס (Fisher Scientific, Tustin, CA). חלקים מיובשים תוקנה עם אצטון 100% מקורר מראש (-20 מעלות צלזיוס) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. החתכים נצבעו כדי לאתר תאי AECII ו-Clara בתוך הרקמות ולהעריך אילו שושלות מבטאים EGFP. המקטעים נחסמו עם 5% סרום חמור של חמור המכיל 1% אלבומין בסרום בקר, 0.1% טריטון X-100 ו-0.05% Tween 20 ב-PBS למשך שעתיים בטמפרטורת החדר לפני מריחת נוגדן ראשוני. דגימות שיצובעו בנוגדנים מכוונים נגד CD45 נחסמו עם אותו חיץ, ללא תוספת של Triton X-100.

כדי לזהות תאי AECII המבטאים EGFP, קטעי ריאות סומנו כפול עם אנטי-GFP של עיזים (1:800 Abcam, Cambridge, MA) ונוגדן פרו-SPC אנטי-אנושי ארנב, המגיב עם פרו-SPC של עכברים (1: 1,000 Chemicon, Temecula, CA) עם דילולים שנעשו במאגר חוסם סרום. בקרות שליליות כללו קטעים שטופלו זהה לדגימות המסומנות למעט הדגירה במאגר חוסם ללא נוגדנים ראשוניים. המקטעים נשטפו ב-0.05% Tween 20 ב-PBS (PBST), ותאים אימונראקטיבים זוהו לאחר דגירה של שעה בטמפרטורת החדר עם חמור אנטי-ארנב-IgG CY3 וחמור אנטי-עז IgG fluorescein isothiocyanate (FITC) (הכל) נוגדנים משניים ממעבדות Jackson ImmunoReseach, West Grove, PA). המקטעים נשטפו שוב עם PBST והגרעין נצבע ב-DAPI (Molecular Probes, Eugene, OR). לאחר כביסה אחרונה עם שינוי אחד של PBST, וכביסה אחת ב-PBS, החלקים כוסו עם ריאגנטים Prolong Gold Antidede (Probes מולקולריים), וניתחו מיד או אוחסנו ב-20 מעלות צלזיוס.

כדי לאפיין עוד יותר את השושלות של תאים חיוביים ל-GFP במקטעי רקמת המכתשית נצבעו באותה טכניקה שתוארה לעיל, אך סומנו עם תווית משולשת עם: עז אנטי-GFP (1:800), אנטי-עכבר CD45 של חולדה (1:100 Caltag) מעבדות, קרלסבאד, קליפורניה), ואנטי-פרו-SPC של ארנבים (1:1,000). חמור נגד עיזים IgG FITC, חמור נגד עכברוש IgG CY3, וחמור נגד ארנב IgG CY5 שימשו כנוגדנים משניים.

לזיהוי תאי קלרה חיוביים ל-EGFP בדרכי הנשימה, קטעי ריאות הודגרו עם נוגדן עז נגד CC10 עבור CC10 (1:1,500 סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, סנטה קרוז, קליפורניה) ועוף אנטי-GFP (1:2,000 Abcam) לילה ב-4 מעלות צלזיוס. תאים אימונראקטיבים זוהו לאחר תיוג עם IgG אנטי-עז לחמור, נוגדן מצומד CY3, ונוגדן מצומד נגד עוף לחמור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

בקרות שליליות שימשו בכל ניסוי, וכללו עכברי ביקורת שלילית שטופלו ב-PBS, כמו גם קטעים מכל ביקורת וחיית ניסוי שהודגרה עם חיץ ללא נוגדן ראשוני. כל הדגימות הוצגו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (Leica DMRXA) ותמונות נלכדו במצלמה דיגיטלית (קוביית Spectra), ונרכשו באמצעות תוכנת EasyFISH (Applied Spectral Imaging, Preston, בריטניה).

ה-DNA הופץ באמצעות ערכת Puregene DNA Isolation (Gentra Systems, Minneapolis, MN) תוך שימוש בפרוטוקולים המומלצים של היצרן. ניתוח PCR סטנדרטי עבור רצפי DNA בקרה גנומיים של EGFP פרווויראלי ו-β-אקטין בוצע על קווי תאים ורקמות שעברו in vivo בעלי חיים שטופלו בסופרנטנט כדי לאשר שהם מכילים רצפים פרובירלים כמתואר (33). מספר העתק הווקטור הממוצע נקבע בדגימות DNA זמינות על ידי ניתוח כמותי בזמן אמת של תגובת שרשרת פולימראז (PCR), בהשוואה לדילול לוגריתמי סדרתי של DNA גנומי משבט Jurkat הנושא עותק בודד לתא כמתואר (33).

נבנו סדרה של וקטורים לנטי-ויראליים שבהם הטרנסגן EGFP בא לידי ביטוי ממקדם SPC פנימי, CC10 או JSRV. ביטוי טרנסגן מוקטורים אלה הושווה עם וקטור בקרה חיובי עם האמרגן המכונן מאזור U3 של ה-MND retrovirus LTR (31). בקרת ללא מקדם שימשה כבקרה שלילית לניסויים בקו תאים. דיאגרמות סכמטיות של כל וקטור מוצגות באיור 1. הווקטורים נארזו לחלקיקים לנטי-ויראליים רקומביננטיים עם חלבון VSV-G כמעטפת להעברה של מגוון רחב של סוגי תאים. מכיוון שלא היה שורת תאים אחת שתבטא את כל המקדמים שהוערכו במחקר זה, טיטר חושבו לאחר התמרה של כל וקטור לקו תאים הידוע כמבטאת אותו כמתואר לעיל.

איור 1. דיאגרמות סכמטיות של פרו-וירוסים משולבים. הוקטורים הם דור שלישי של וקטורים לנטי-ויראליים מנטרלים את עצמם המבוססים על סדרת הוקטורים CCL. חצים מייצגים מקדם תעתיק.

בסט הראשון של ניסויים, ביטוי טרנסגן הוערך מכל אחד מהוקטורי הבדיקה והבקרה בקווי תאים המייצגים מגוון סוגי תאים. מנות מכל שורת תאים נחשפו לחלקיקים נגיפיים בריכוז שווה מכל בדיקה ובקרה. שורות תאים דבקות הועברו עם 3 × 10 4 iu/ml (ריבוי זיהום [MOI]: 0.3) ותאי ההשעיה הועברו עם 1 × 10 4 iu/ml (MOI: 0.1). ריכוזים ויראליים אלה נבחרו כניסויים על ידי המעבדה שלנו, ואחרים (23) הוכיחו שתנאים אלה מזערו את שיעור התאים עם עותקים מרובים של הווקטור, ובכך הקלו על ניתוח ביטוי על תאים הנושאים עותק בודד של הפרובירוס. ניתוח ציטומטריית זרימה מדגם עבור קו תאים AECII (MLE-12) וקו תאים אחד ללא נשימה (293A) מוצג באיור 2. מכיוון שלא לכל קווי התאים יש אותה יעילות התמרה כוללת, הנתונים מוצגים כשיעור היחסי של תאים המבטאים EGFP מווקטור הבדיקה לוקטור הבקרה ה-MND המכונן עבור אותו שורת תאים ספציפית. לדוגמה, וקטור בדיקה המבטא מאותו פרופורציה של תאים כמו הווקטור המקודם של MND בקרה חיובית בקו תאים מסוים יש יחס ביטוי של 1 (איור 3).

איור 2. ניתוח ציטומטריית זרימה עבור ביטוי טרנסגן של EGFP ב-293A (פאנל עליון) ו-MLE-12 (פאנל תחתון) שורות תאים שהועברו עם פאנל של וקטורים lentiviral. תאים הועברו פעם אחת עם supernatant lentiviral והוערכו על ידי ציטומטריית זרימה 5 עד 7 ימים לאחר מכן. המספר באזור 2 (R2) מציין את אחוז התאים החיוביים ל-EGFP.

הביטוי הגבוה ביותר של EGFP ממקדם CC10 נצפה בקווי תאי Clara Mtcc1-2 ו-H441. רמת הביטוי הייתה גבוהה מזו של וקטור הבקרה החיובי CCL-MND-EGFP עם ביטויי EGFP ממוצעים של 1.3 ו-1.5 עבור תאי Mtcc1-2 ו-H441, בהתאמה, ביחס לביטוי מווקטור MND, שנקבע על 1 (נ = 4). ביטוי טרנסגן היה נמוך משמעותית בקווי תאי אפיתל נשימתיים אחרים, שאינם תאי קלרה, MLE-12 (0.09 פ < 0.01), MLE-15 (0.2 פ < 0.01), ו-A549 (0.1 פ < 0.01) באמצעות דו-זנב ט בדיקות (איור 3A). רמת הביטוי של EGFP מהמקדם CC10 בכל שורות התאים הלא-נשימתיות הייתה נמוכה משמעותית, עם טווח של 0.001 עד 0.14 (כולם פ < 0.001 דו-זנב ט מִבְחָן). נתונים אלה מצביעים על כך שביטוי הטרנסגן מהוקטור CCL-CC10-EGFP מוסדר, וספציפי לשושלת לשורות תאים של קלרה.

איור 3. סיכום של ביטוי טרנסגן בפאנל של שורות תאים מה-(א) CCL-CC10-EGFP, (ב) CCL-SPC-EGFP, וכן (ג) וקטורים CCL-JSRV-EGFP. רמות הביטוי מוצגות כמנורמלות לביטוי מווקטור הבקרה החיובי CCL-MND-EGFP ± השגיאה הסטנדרטית של הממוצע. כוכביות מצביעים על רמות שונות של ביטוי מובהקות סטטיסטית בין קבוצות התאים עם פ ערכים של < 0.05 (שני זנבות ט מבחן) עם ספציפי ט בדיקת ערכים סטטיסטיים המוצגים בטקסט.

כצפוי האחוז הגבוה ביותר של תאים המבטאים EGFP ממקדם SPC נצפה בקווי תאים AECII, המבטאים את הגן האנדוגני SPC (איור 3B נ = 4). לדוגמה, רמות הביטוי היחסיות של EGFP בשורות התאים החיוביות ל-SPC MLE-12 ו-MLE-15 היו 1.3 ו-0.9 ביחס לאחוז התאים המבטאים ממקדם MND (מוגדר ב-1.0). האחוז היחסי של תאים המבטאים EGFP בשורות שאינן AECII היה נמוך סטטיסטית מהביטוי בקווי תאים AECII. באופן ספציפי, לשורות תאים של קלרה היו ביטויים יחסיים של 0.6 עבור H441 ו-0.03 עבור Mtcc1-2 בהתאמה, שהיו נמוכים משמעותית מהביטויים הממוצעים של MLE-12 (פ < 0.001 דו-זנב ט מבחן) ו-MLE-15 (פ < 0.001 דו-זנב ט מִבְחָן).

הביטוי היחסי של EGFP מהוקטור CCL-SPC-EGFP בכל שורות תאים אפיתל לא נשימה היה פחות מ-0.10 (איור 3B). ניתוח סטטיסטי הראה שיש הבדל משמעותי בין ביטוי EGFP בקווי תאים AECII MLE-12 ו-MLE-15 בהשוואה לכל שורות התאים הלא נשימתיות (כל פ < 0.002, דו-זנב ט מִבְחָן). ביחד, נתונים אלה מדגימים שביטוי EGFP פרווויראלי ממקדם SPC הוא ספציפי מאוד לשורות תאים AECII חיוביות ל-SPC.

בניגוד לביטוי מ-SPC ו-CC10 lentivectors, רמות בינוניות עד גבוהות של ביטוי טרנסגן נצפו מהוקטור CCL-JSRV-EGFP בכל שורות התאים הנשימתיות והלא-נשימתיות שנבדקו, למעט 293A, שהיה בעל ביטוי נמוך מאוד (איור 3C נ = 4). רמת הביטוי הגבוהה ביותר נצפתה בתאי Jurkat (T-lymphoid) עם יחס ביטוי EGFP של 1.1, כאשר רמות מתונות של ביטוי נצפו בכל שורות תאי האפיתל של הנשימה (טווח: 0.4-0.8). רמות מתונות עד נמוכות של ביטוי זוהו בשורות תאים ממקורות שרירים, עצביים, כליות והמטופואטיים (טווח, 0.03-0.6). לא היה הבדל משמעותי בין ביטוי ה-EGFP בין כל אחד משורות תאים אפיתל נשימתיות לשורות תאים לא נשימתיות (כל פ ערכים > 0.05 דו-זנב ט מבחן), המצביע על כך שהווקטור CCL-JSRV-EGFP לא יצר ביטוי טרנסגן ספציפי לאפיתל נשימתי.

כדי לאשר שחוסר ביטוי טרנסגן ממקדם לא נבע מחוסר בהתמרה פרובירלית בניסויים אלה, כל הדגימות הוערכו על ידי ניתוח PCR עבור רצפי EGFP פרווויראליים. הנתונים מניתוח PCR מייצג מוצג באיור 4, המדגים את נוכחותם של רצפי EGFP פרווויראליים בכל שורות התאים שעברו transduced. זה מאשר שחוסר ביטוי EGFP שנצפה בשורות תאים לא-נשימות ממקדמי SPC ו-CC10 לא נבע מחוסר העברת גנים, אלא בגלל הבדלים בוויסות ביטוי הטרנסגן בסוגי תאים שונים.

איור 4. ניתוח PCR עבור EGFP פרווויראלי (לוח ימין) ובקרה פנימית B-actin (לוח שמאלרצפי גנים ב-DNA המופק מתאיים שהועברו באמצעות פאנל של וקטורים lentiviral. דגימות מדומה לא נחשפו לסופרנטנט לנטי-ויראלי, ואף דגימות מקדם לא נחשפו לסופרנטנט לנטיוירוס בקרה שאינו מכיל פרומטור ל- EGFP cDNA.

כדי להעריך את ביטוי הטרנסגן מה-lentivectors CC10 ו-SPC באפיתל נשימתי ראשוני, סופרנטנטות lentiviral הוזרקו ישירות לקנה הנשימה של עכברים עירומים אטיים. עכברים עירומים שימשו במחקרים אלה כדי להקל על ניקוי אזור הצוואר לניתוח והצגה של קנה הנשימה להזרקה. במחקרים ראשוניים, לעכברים ניתנה סופרנטנט לנטיויראלי תוך קנה הנשימה ללא טיפול ב-KGF, אולם לא נצפתה התמרה (לא הוצגו נתונים). בעוד וקטורים לנטי-ויראליים יכולים להעביר סוגי תאים לא מחלקים, יעילות גבוהה יותר של התמרה הוכחה במספר סוגי תאים, עם השראת מחזור תאים (11-13). בכל ניסויי הלידה תוך קנה הנשימה המוצגים כאן העכברים טופלו ב-KGF לפני, ובזמן, מתן ויראלי כדי להגביר את מחזור תאי קלרה (34) ו-AECII (35). אסטרטגיה זו הוכחה כמגבירה את מחזור התא והעברת גנים רטרו-ויראליים לריאות במחקרים אחרים (36, 37). הריאות ודרכי הנשימה של עכברים המקבלים נקצרו והוערכו ב-6 שבועות לאחר מתן סופרנטנט וקטור לביטוי EGFP על ידי ניתוח אימונופלואורסצנטי.

קטעי רקמה ממקבלי ה-CCL-CC10-EGFP lentiviral וקטור נצבעו חיסוני בנוגדנים אנטי-GFP. תאים EGFP-immunoreactive זוהו בדרכי הנשימה של בעלי חיים שטופלו ב-CCL-CC10-EGFP, עם כמה תאי דרכי אוויר חיוביים עבור אימונופלואורסצנטי EGFP לכל צפייה. תאים חיוביים ל-EGFP לא זוהו בעכברי ביקורת שלילית שקיבלו PBS. כדי לזהות את השושלת של תאים חיוביים ל-EGFP בדרכי הנשימה של עכברי ניסוי, קטעי רקמה סומנו בנוגדנים המכוונים נגד חלבונים CC10 (אדום-Cy3) ו-EGFP (ירוק-FITC conjugate) (איור 5). ניתוח זה הראה שהתאים נצבעו חיסוני עבור EGFP (ירוק) בדרכי הנשימה הוצבעו גם בנוגדנים נגד CC10 (אָדוֹם). צילומי מיקרוסקופ של ניתוח אימונופלואורסצנטי כפול מייצג על קטעי דרכי הנשימה מחיות בקרת CCL-CC10-EGFP ו-PBS מוצגות באיורים 5A ו-5B, בהתאמה. ה לוחות שמאליים הצג תמונות ממוזגות עם EGFP (ירוק), CC10 (אָדוֹם), וגרעינים מוכתמים ב-DAPI (כָּחוֹל). ה לוחות אמצעיים הצג את ה-DAPI וה-EGFP (ירוק) ערוצים, ואת לוח ימין מציג רק את ערוצי ה-DAPI וה-CC10.

איור 5. ניתוח אימונופלואורסצנטי של ריאות לאחר מתן תוך קנה הנשימה של CCL-CC10-EGFP lentiviral supernatant (א ו ג) או PBS (ב ו ד) לעכברים. א ו ב הם חתכים קריו של רקמת דרכי הנשימה שנצבעה חיסונית עבור EGFP (ירוק) ו-CC10 (אָדוֹם) עם גרעינים מוכתמים ב-DAPI (כָּחוֹל). ג ו ד הראה חתכים קריו של רקמה מכתשית שצובעת חיסונית עבור EGFP (ירוק), פרו-SP-C (וָרוֹד), וגרעינים מוכתמים ב-DAPI. התמונות מוצגות עם כל הצבעים (כל הערוצים) משולבים ב- לוח שמאל, ועם כל צבע חיסוני יחיד עם DAPI ל ימין של ה תמונה ממוזגת. חצים מצביעים על תאים חיוביים כפולים. הגדלה מקורית של כל הצילומים: ×200.

לאחר מכן, קבענו את שיעור תאי דרכי הנשימה שהיו חיוביים ל-EGFP על ידי ספירת המספר הכולל של תאי דרכי הנשימה ותאי דרכי הנשימה החיוביים ל-EGFP במקטעי רקמה משני נמענים ב-6 שבועות לאחר ההזרקה. בנמען אחד (IT1-8), 2.4% (10/422) מתאי דרכי הנשימה היו חיוביים ל-EGFP, בעוד שבנמען השני (IT4-11) 3.6% (18/496 תאים) מתאי דרכי הנשימה היו חיוביים ל-EGFP ביטוי (טבלה 1).

שולחן 1. סיכום של שיעור התאים EGFP-positive ברקמות דרכי הנשימה והשכיבים לאחר מתן תוך רחלי של סופרנטנט לנטי-ויראלי

הגדרה של קיצורים: CC10, Clara cell 10-kD חלבון EGFP, חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר GFP, SPC חלבון פלואורסצנטי ירוק, חלבון פעיל שטח C.

* אך ורק תאי דרכי הנשימה נספרו לניתוח זה.

† כל התאים באזור המכתשית נספרו לניתוח זה, ולכן כוללים AECI, AECII, וכן תאים כלי דם והמטופואטיים.

אצל מקבלי ה-CCL-CC10-EGFP lentivirus, זוהו גם תאים מכתשיים שצובעו בצורה חיובית עבור EGFP. כדי לזהות את השושלות של תאי המכתשית המבטאים EGFP בנמענים אלה, חתכים קריו סומנו משולש עם נוגדנים נגד EGFP (מצומד ירוק-FITC), CC10 לתאי קלרה (מצומדים אדום-cy3), ופרו-SPC עבור AECII (ורוד-Cy5) מצומד). תאים מכתשיים שצבעו אימונו עבור EGFP היו גם אימונראקטיביים עבור פרו-SPC, אך שליליים עבור ביטוי CC10, מה שמצביע על כך שהתאים המכתשיים המבטאים מהוקטור CCL-CC10-EGFP היו AECII (איור 5C). זה מצביע על כך שהמקדם CC10 הפרובירלי היה פעיל בתאים פרו-SPC-חיוביים in vivo. תאים immunoreactive עבור EGFP לא זוהו ברקמת המכתשית של עכברי ביקורת שטופלו PBS (איור 5D). מחקרים אלו מוכיחים כי וקטורים לנטי-ויראליים הנושאים את מקדם CC10 מכוונים ביטוי טרנסגן הן ל-AECII ברקמת המכתשית והן לתאי קלרה ברקמת דרכי הנשימה. in vivo.

במקבלים של סופרנטנט וקטור CCL-SPC-EGFP תוך קנה הנשימה, נצפו תאים אימונרטיביים עבור EGFP ופרו-SPC ברקמת המכתשית בכל נקודות הזמן שהוערכו. המורפולוגיה, הלוקליזציה ודפוס הצביעה הנקודתי פרו-SPC של תאים EGFP כפולים ותאים פרו-SPC-חיוביים היו עקביים עם AECII. איור 6 מציג צילום מיקרוסקופ של רקמת מכתשית (איור 6A ×200), ותמונה בהגדלה גבוהה של תא פרו-SPC ו-EGFP חיובי כפול (איור 6B ×640), המצביע על כך שתאי AECII היו מסוגלים לבטא EGFP מהגוף. מקדם SPC של lentiviral. שיעור התאים החיוביים ל-EGFP השתנה בין בעלי חיים, קטעי רקמה ובתוך אזור של כל קטע רקמה, כאשר תאים חיוביים נוטים להתקבץ בתוך אזור. איור 6C מציג אזור עם מספר תאי AECII חיוביים ל-EGFP מקובצים (×200), ואיור 6D מציג צילום מיקרוסקופ בהגדלה גבוהה של אותו אזור (×640). כדי לכמת את יעילות ההמרה הממוצעת, קבענו את השיעור של תאים פרו-SPC-חיוביים ל-EGFP בקטעים משלושה נמענים ב-6 שבועות לאחר ההזרקה. השיעור של כל התאים המכתשיים שהיו חיוביים הן ל-EGFP והן ל-pro-SPC נע בין 2.3% ל-4.6% (טבלה 1). עם זאת, מכיוון שהמספר הכולל של תאים מכתשית כולל מגוון סוגי תאים מכתשיים שאינם צפויים להתבטא ממקדם SPC, אחוזים אלה עשויים לייצג פחות את השיעור האמיתי של AECII מתמרה המבטאים את הטרנסגן EGFP.

איור 6. ניתוח אימונופלואורסצנטי של רקמת ריאה לביטוי טרנסגן של EGFP לאחר מסירה תוך קנה הנשימה של סופרנטנט CCL-SPC-EGFP lentiviral לעכברים. ניתוחי קריוס צוינו חיסוני עבור EGFP (ירוק) ופרו-SPC (אָדוֹם) והגרעינים נצבעו נגדי עם DAPI (כָּחוֹל). ב א, ה חֵץ מראה תא חיובי כפול לצביעה חיסונית פרו-SPC ו-EGFP (×200). ב הוא הגדלה גבוהה יותר (×640) של אזור מקופסא מ א. ג מציג דוגמה לאזור מכתשית שהיה לו רמה גבוהה של התמרה AECII וביטוי EGFP (×200). ד מראה הגדלה גבוהה יותר של אזור מקופסא ב ג (×640). כל התמונות מוצגות עם כל הצבעים משולבים על לוח שמאל (כל הערוצים), ועם כל צבע חיסוני יחיד עם DAPI ל ימין של ה תמונה ממוזגת.

בנקודות זמן מוקדמות בכמה בעלי חיים, זוהתה פעילות חיסונית של EGFP גם בתאים מכתשיים שליליים לצביעת פרו-SPC, מה שמצביע על כך שהם אינם AECII. תאים חיוביים פרו-SPC-שליליים ל-EGFP נצפו רק בנקודות זמן מוקדמות (1 ו-2 שבועות) ולא נצפו בנקודת הזמן המאוחרת יותר (6 שבועות). השושלת של תאים פרו-SPC-שליליים אלה זוהתה כהמטופואטית (חיובית ל-CD45) לאחר צביעה עבור EGFP, פרו-SPC ו-CD45 (נתונים לא מוצגים). תאים המטופואטיים חיוביים ל-EGFP (חיוביים ל-CD45) לא נצפו בנקודת הזמן של 6 שבועות באף נמען. מכיוון שמקרופאגים בולעים פסולת, לא ברור אם המקרופאגים המכתשיים הועברו באמצעות lentivirus ומבטאים EGFP ממקדם ה-SPC, או שהם בולעים EGFP הקיים בתכשיר הנגיפי ו/או נוצרו על ידי תאי AECII שעברו transduced. בהתחשב שלנו בַּמַבחֵנָה נתונים המדגימים כי וקטור CCL-SPC-EGFP אינו מתבטא בקווי תאים המטופואטיים (איור 3), חוסר ביטוי במח עצם מתמרד ראשוני (לא מוצגים נתונים), והעובדה שה-EGFP לא זוהה ב-6- נקודת זמן בשבוע, סביר להניח שהמקרופאגים המכתשיים עלולים לבלוע פסולת בתכשיר הנגיפי. עם זאת, המחקרים הנוכחיים לא יכלו לשלול את האפשרות שמקרופאגים אלוויאולריים מבטאים את הטרנסגן.

בקבוצות הבאות של הניסויים, הגבלת השושלת של הווקטורים ה-lentiviral הוערכה לאחר מתן תוך ורידי של supernatant lentiviral דרך וריד הפנים של עכברי C57B6J ילודים יום 0. לכל עכבר מקבל יילוד הוזרק בערך 1 × 10 8 חלקיקים ויראליים של סופרנטנט CCL-SPC-EGFP או CCL-CC10-EGFP lentiviral. רקמות נקצרו מעכברי נמענים עד גיל 14 חודשים ומנות אוחסנו לצורך מיצוי DNA וניתוח EGFP PCR פרווויראלי, ושימור הקפאה בתרכובת OCT לצורך ניתוח צביעה חיסונית ומיקרוסקופ פלואורסצנטי עבור EGFP. עכברים מהונדסים של GFP ועכברי C57B6J מסוג פרא שימשו כבקרות חיוביות ושליליות עבור מבחני אלה, בהתאמה.

בשבעת המקבלים של הסופרנטנט CCL-CC10-EGFP, זוהו רצפים פרווויראליים בכל הכבדים, ורוב הטחולים, הלבבות והכליות ממקבלי יילודים (טבלה 2). לאחר מכן, רמת ההמרה הוערכה על ידי ניתוח PCR כמותי בזמן אמת על דגימות זמינות. מספר העותקים הפרובירליים ברקמות נע בין 0.060 ל-0.175 עותקים לתא בממוצע בכבד (הגבוה ביותר). נצפו מספרי עותקים נמוכים יותר בלב (טווח, 0.00025-0.09), בטחול (טווח, 0.027-0.030), ובכליות (טווח, 0.00002-0.00006). רמת העברת הגנים שנצפתה במחקרים אלה היא בהתאם לרמות ההמרה שנצפו במחקרים אחרים של הזרקת סופרנטנט לנטיויראלי לילודים (32). כל רקמות הכבד, הלב, הטחול והכליות שהיו חיוביות לרצפים פרווויראליים בכל אחת מהבדיקות היו כפופות לניתוח מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי של EGFP. שני קטעי רקמה מרווחים היטב הוערכו עבור כל רקמה, וביטוי EGFP לא זוהה באף אחד מהחתכים שנותחו (נתונים לא מוצגים). בהינתן מספרי עותק של עד 0.175 (המקבילים לעד 17.5% מהתאים הנושאים גנום פרווויראלי יחיד), נתונים אלה תומכים ב בַּמַבחֵנָה נתוני שורת תאים המדגימים כי ביטוי טרנסגן אינו נצפה במספר רקמות שאינן נשימתיות מהוקטור CCL-CC10-EGFP.

שולחן 2. תקציר של ניתוח PCR פרווויראלי סטנדרטי של EGFP ברקמות מעכברים שהוזרקו לווריד עם סופרנטנט LENTIVIRAL

הגדרה של קיצורים: +, EGFP חיובי —, לא זוהה EGFP CC10, חלבון קלרה 10-kD חלבון NA, מדגם לא זמין SPC, חלבון פעיל שטח C.

בארבעת המקבלים תוך ורידי של וקטור CCL-SPC-EGFP, כל דגימות ה-DNA מהטחול והכבד, שלוש מתוך ארבעת הלב, ואחת מארבע דגימות הכליה היו חיוביות לרצפי EGFP פרווויראליים (טבלה 2). ניתוח PCR כמותי בוצע על דגימות DNA זמינות. מספרי העתקות פרווויראליים ממוצעים נעו בין 0.003 ל-0.09 עבור הלב (שלוש דגימות), 0.01 ו-0.025 עבור הטחול (שלוש דגימות), ו-0.03 עבור הכליה (דגימה אחת). שני קטעי רקמה מכל הרקמות החיוביות לפרו-וירוס הוערכו לביטוי EGFP. כל קטעי הרקמה היו שליליים לביטוי EGFP על ידי ניתוח אימונופלואורסצנטי (נתונים לא מוצגים). נתונים אלה הדגימו שוני ברמת העברת הגנים לרקמות שאינן נשימתיות באמצעות הגישה התוך-ורידית של יילודים. עם זאת, היעדר ביטוי טרנסגן שנצפה בכל רקמה שאינה נשימתית תומך ב בַּמַבחֵנָה נתונים, המצביעים על כך שה-CCL-SPC-EGFP lentivector אינו מתבטא ברקמות שאינן נשימתיות. ביחד, ה בַּמַבחֵנָה ו in vivo הנתונים שהוצגו לעיל מצביעים על כך ש-lentivectors אלה מייצרים ביטוי טרנסגן מוסדר, ספציפי לנשימה.

ביטוי טרנסגן מווסת שושלת יהיה הכרחי לטיפולים גנים יעילים ארוכי טווח להפרעות המשפיעות על הריאה. רוב הניסויים הקליניים של ריפוי גנטי שהופנו לאפיתל נשימתי עד כה השתמשו במקדמים מכוננים כגון הפרומוטור מהציטומגלווירוס (CMV) או הפרומוטור ב-LTR הרטרו-ויראלי. עם זאת, מחקרים ארוכי טווח בבעלי חיים הצביעו על כך שלאורך זמן, ניתן להשתיק ביטוי טרנסגן ממקדמי נגיפים (38, 39), או יכול להפר את הוויסות של גנים תאיים ליד אתר האינטגרציה המוביל לגידולים (21). לפיכך, ויסות ביטוי ספציפי לשושלת יועיל ליישומים רבים של ריפוי גנטי כדי למנוע השתקה וקטורית או רעילות הקשורות לביטוי טרנסגן לא מווסת. וקטורים ספציפיים לשושלת יהיו גם כלי שימושי לחקר ביולוגיה של הריאות, כדי לעקוב ולזהות צאצאים של תאי גזע, לנטר את הפוטנציאל הבידול של תאי גזע ו/או להעביר טרנסגנים בזמנים ספציפיים או לשושלות ספציפיות.

במחקר זה הערכנו את פרופיל ביטוי השושלת של וקטורים לנטי-ויראליים עם סדרה של אלמנטים מווסתים ספציפיים לאפיתל נשימתי. בניסויים בשורות תאים, ה-lentivector מקודם SPC ייצר ביטוי ספציפי ל-AECII בעוד שה-lentivector מקודם CC10 היה בעל רמת הביטוי הגבוהה ביותר בקווי תאים של קלרה. לעומת זאת, ה-lentivector המקודם על ידי JSRV הוכיח רמה גבוהה של ביטוי טרנסגן בסוגי תאים רבים ושונים. תוצאות אלו עומדות בניגוד למחקרים שהעריכו את מקדם JSRV במבנים פלסמידים ורטרו-ויראליים, כאשר הביטוי מוסדר לשושלת תאי AECII ו-Clara. הסיבה להבדלים אלו בפרופיל הביטוי ממקדם JSRV בין וקטורי העברת הגנים השונים אינה ברורה. עם זאת, ראינו גם תופעה דומה עם מקדם CD11b, שיצר ביטוי מווסת מקוקטורי פלסמיד, עכברים טרנסגניים (40, 41) ורטרו-פרו-וירוסים משולבים (42), אך לא הוסדר והתבטא ברוב סוגי התאים מ- lentiprovirus (43, ו-C. Lutzko, נתונים לא פורסמו). יתכן שהאלמנטים הנותרים בעמוד השדרה ה-lentiviral יכולים להשפיע על מבנה הכרומטין המקומי כדי להגביר את הגיוס של מנגנון התעתיק (44). אפשרות נוספת היא שאתרי הקישור הנותרים של גורמי השעתוק ב-LTR המינימלי יכולים לשתף פעולה עם מקדם JSRV כדי לשפר את הביטוי הטרנסגני מנגיפים משולבים של lentiprovirus בסוגי תאים שבהם ה-HIV מסוג פרא פעיל בדרך כלל. לתמיכה בהשערה זו, רמת הביטוי הגבוהה ביותר נצפתה ב-Jurkat, שורת תאים T-לימפואידית שבה מקדם ה-HIV-1 פראי פעיל. עם זאת, נדרשים מחקרים נוספים כדי להבהיר את מנגנון הפרת הוויסות עם מקדם JSRV בעמוד השדרה ההלנטי-ויראלי.

מכיוון שפרופיל ביטוי הגנים של שורות תאים אינו משקף בדיוק תאים ראשוניים נורמליים, הערכנו גם את ביטוי הטרנסגן מ-CC10 ו-SPC lentivectors ברקמות נשימתיות ולא נשימתיות לאחר מסירה תוך קנה הנשימה ותוך ורידי למקבלי עכברים. למרות שישנן מספר מעטפות המספקות רמות גבוהות יותר של העברת גנים לאפיתל האף או דרכי הנשימה כגון baculovirus GP64 (20, 45) או מעטפות filoviral (16, 17, 46), בחרנו להשתמש ב-VSV-G-Psudotyped supernatant lentiviral עבור ה in vivo מחקרים משום שהוא יאפשר ניתוח התמרה וביטוי של מגוון רחב של סוגי תאים, בשל הטרופיזם הסלולרי הרחב שלו. לפיכך, מחקר זה יספק נתונים על הגבלת השושלת של ביטוי טרנסגן מה-lentivectors שלנו. לאחר מתן ה-CCL-CC10-EGFP lentivirus in vivo, ביטוי טרנסגן נצפה אך ורק בריאה, ולא בלב, בכבד, בטחול או בשריר. באופן מפתיע, אפיון של שושלות התאים המבטאות את הטרנסגן EGFP בריאה הוכיח שגם תאי קלרה וגם AECII היו חיוביים ל-EGFP. בעוד שמקדם CC10 משמש בדרך כלל להכוונת ביטוי טרנסגן לתאי קלרה, מחקרים טרנסגניים אחרים של עכברים ראו גם ביטוי טרנסגני בתוך המכתשית (29), אם כי מחברים אלה לא הצליחו לזהות את השושלות המבטאות את הטרנסגן בשל הרזולוציה הנמוכה של המתודולוגיה הזמינה באותה עת. לפיכך, הנתונים שלנו מצביעים על כך ששילוב של מקדם CC10 בוקטורים lentiviral מביא לביטוי ספציפי לנשימה, שעשוי להיות שימושי לחקר ביולוגיה של הנשימה, או מסירה מווסתת של גנים טיפוליים לדרכי הנשימה ולריאות.

ניתוח של פרופיל הביטוי הטרנסגן מהוקטור CCL-SPC-EGFP הראה שהביטוי מוגבל ל-AECII, מכיוון ש-EGFP לא זוהה בשורות תאים לא נשימתיות בַּמַבחֵנָהולא את הטחול, הלב או הכבד לאחר לידה תוך ורידי. בעוד שתאים המטופואטיים חיוביים לחלבון EGFP נצפו במכתשות של עכברים נמענים בנקודות זמן מוקדמות, הם לא היו ניתנים לזיהוי תוך 6 שבועות, וייתכן שהם תוצאה של phagocytosis של חלבון EGFP בתכשיר הנגיפי.

בעוד השיטות של תוך ורידי ו תוך קנה הנשימה in vivo מסירה המשמשת במחקר זה אינה גורמת להעברת גנים לכל הרקמות, הן מספקות נתונים על ניתוח הביטוי הפרויראלי במגוון סוגי רקמות ראשוניות, ללא הזמן וההוצאות של יצירת עכברים מהונדסים. למרות שהעכברים ששימשו למחקרי מסירה תוך קנה הנשימה היו חסרי מערכת חיסונית, סביר להניח שתוצאות אלו יהיו דומות לזני עכברים בעלי יכולת חיסונית כגון C57B6J, שכן ישנם מספר מחקרים המדגימים ביטוי ארוך טווח לאחר in vivo אספקה ​​של מכשירי lentivector המכילים EGFP (47, 48) או EYFP הקשורה קרובה (20).

וקטורים לנטי-ויראליים משתנים בקלות כדי לבטא גנים בעלי עניין ומיוצרים בקלות עם טיטרים גבוהים המתאימים ל in vivo מִנהָל. בעוד שהרמה הכוללת של העברת גנים לדרכי הנשימה והריאות הייתה נמוכה במחקר זה, הרמה הייתה מספיקה כדי להעריך בקפידה את השושלות המבטאות את הטרנסגן EGFP. מספר מחקרים עדכניים תיארו מסירה יעילה של וקטורים לנטי-ויראליים אחרים לריאות של בעלי חיים על ידי שינוי המעטפת הנגיפית (16-18), או הגדלת הצמיגות של הסופרנטנט על ידי השעיית הנגיף מחדש ב-1% מתיל-צלולוזה (49) או LPC (19) כדי להפחית את קצב הפינוי על ידי דרכי הנשימה. צימוד הוקטורים המווסתים על ידי השושלת המתוארים כאן, עם שיטות מסירה יעילות לסוג התא המעניין, יקל על פיתוחם של טיפולים גנים בטוחים ויעילים למחלות בדרכי הנשימה, על ידי ייצור ביטוי טרנסגן מווסת שושלת. וקטורים אלו יעניינו גם ביולוגים דרכי הנשימה, שכן הם יאפשרו מסירה מווסתת של גנים לאפיתל המכתשית ודרכי הנשימה, שניתן לשנות בקלות כדי לבטא גן בעל עניין ספציפית בדרכי הנשימה בתאי קלרה או במכתשית ב-AECII . יתר על כן, וקטורים אלה יכולים לשמש גם ככלי לסימון ומעקב אחר צאצאיהם של תאי גזע שהתמיינו לשושלות נשימתיות ספציפיות בַּמַבחֵנָה אוֹ in vivo. לסיכום, וקטורים לנטי-ויראליים עם פרופילי ביטוי מווסתים, מכתשית ודרכי אוויר ספציפיים יהיו שימושיים לפיתוח של טיפולים גנים בטוחים, וללימוד ביולוגיה של הריאות.

המחברים מודים לד"ר. דונלד B. Kohn, Gay Crooks ו-Paula Cannon על דיונים מתחשבים וסקירת כתב היד. הם מודים לד"ר ג'פרי ויטסט על מקדמי ה-SPC וה-CC10 ועל קו התאים MLE-15, לד"ר האנג פאן עבור מקדם ה-JSRV, לד"ר דונלד ב' קון עבור מקדם ה-MND, וד"ר פרנקו דה מאיו עבור Mtcc1-2 תאים.


Lentivector biosafety - ביולוגיה

העברת גנים יעילה ללימפוציטים מסוג T ו-B שקטים למטרות ריפוי גנטי או אימונותרפיה עשויה לאפשר טיפול במספר ליקויים גנטיים של המערכת ההמטופואטית, כגון ליקויים חיסוניים, ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לסרטן ולמחלות נרכשות. וקטורים Lentiviral (LVs) יכולים להעביר סוגים רבים של תאים שאינם מתרבים, למעט כמה סוגי תאים שקטים מסוימים כגון תאי T ו-B במנוחה. בתאי T, השלמת שעתוק לאחור (RT), ייבוא ​​גרעיני, ואינטגרציה לאחר מכן של גנום LV (VSVG-LV) פסאודוטיפוס של חלבון ה-Vesicular stomatitis virus אינו מתרחש ביעילות אלא אם כן הם מופעלים. באמצעות קולטן תאי T (TCR) או באמצעות ציטוקינים הישרדות הגורמים להם להיכנס לתוך ה-G שלב של מחזור התא. התמרה לנטיויראלית של תאי B היא עניין אחר מכיוון שאפילו גירוי קולטן של תאי B הגורם לשגשוג אינו מספיק כדי לאפשר התמרה יעילה של VSVG-LV. לאחרונה, LV חדש הנושא את הגליקופרוטאין של נגיף החצבת (MV) על פני השטח שלו הצליח להתגבר על הגבלות וקטוריות בתאי T ו-B שקטים. חשוב לציין, תאי T ו-B תמימים כמו גם זיכרון הועברו ביעילות, בעוד שלא זוהה הפעלה נראית לעין, כניסה למחזור התא או מתג פנוטיפי, מה שפותח את הדלת למגוון יישומים של ריפוי גנטי ואימונותרפיה כפי שדווח כאן.


טרנספקציה ויראלית

עבור סוגי תאים שאינם ניתנים לטרנספקציה בתיווך שומנים, לעתים קרובות משתמשים בוקטורים ויראליים. טרנספקציה מתווכת וירוסים, הידועה גם בשם טרנסדוקציה, מציעה אמצעי להגיע לסוגי תאים שקשים להעברה לצורך ביטוי יתר של חלבון או נוק-דאון, וזו השיטה הנפוצה ביותר במחקר קליני (Glover et al., 2005 Pfeifer and Verma, 2001). וקטורים אדנו-ויראליים, אונקורטרו-ויראליים ולנטיו-ויראליים שימשו בהרחבה להעברת גנים בתרבית תאי יונקים ו-in vivo. דוגמאות ידועות אחרות להעברת גנים נגיפיים כוללות וקטורים מבוססי וירוס בקולובירוס ו-vaccinia. למידע נוסף על מערכות מסירה ויראליות שונות, ראה וקטורים ויראליים.

אמנם וירוסים הם המערכת המועדפת לאספקת גנים בניסויים קליניים בשל יעילותם הגבוהה ב-vivotransfection וביטוי גנים מתמשך בשל השתלבותם בגנום המארח, יש להם מספר חסרונות כולל האימונוגניות והציטוטוקסיות שלהם, הליכי ייצור מאתגרים מבחינה טכנית ומייגעים. עבור וקטורים, עלויות גבוהות עקב דרישות בטיחות ביולוגית, קיבולת אריזה נמוכה (

10 kb עבור רוב הווקטורים הוויראליים בהשוואה ל

100 kb עבור וקטורים לא ויראליים), ושונות בזיהומיות של תכשירי וקטור ויראליים (Glover et al., 2005 Kim and Eberwine, 2010 Vorburger and Hunt, 2002).

פרוטוקול טרנסדוקציה טיפוסי כולל הנדסה של הנגיף הרקומביננטי הנושא את הטרנסגן, הגברה של חלקיקים נגיפיים רקומביננטיים בקו תא אריזה, טיהור וטיטרציה של חלקיקים נגיפיים מוגברים, והדבקה לאחר מכן של התאים המעניינים. בעוד שיעילות ההמרה שהושגה בתאים ראשוניים ושורות תאים גבוהה למדי (

90-100%), רק תאים הנושאים את הקולטן הספציפי לנגיף יכולים להידבק בנגיף. כמו כן, חשוב לציין שקו התא האריזה המשמש להגברה ויראלית צריך לעבור טרנספקציה בשיטת טרנספקציה לא ויראלית.


וקטורים לנטי-ויראליים: בסיסיים לתרגום

יותר משני עשורים חלפו מאז שימש HIV מהונדס גנטית להעברת גנים. באמצעות שיפורים מתמשכים, HIV נושאי גנים מוקדמים של סמן מוקדם התפתחו לוקטורים לנטי-ויראליים בטוחים ויעילים יותר. וקטורים לנטי-ויראליים מציעים מספר תכונות אטרקטיביות ככלי מסירת גנים, כולל: (i) אספקת גנים מתמשכת באמצעות אינטגרציה וקטורית יציבה בגנום המארח (ii) היכולת להדביק תאים מתחלקים ותאים שאינם מתחלקים (iii) טרופיזמים של רקמות רחבות, כולל חשובות סוגי תאי מטרה בטיפול גנטי ותאי (iv) ללא ביטוי של חלבונים ויראליים לאחר התמרה וקטורית (v) היכולת לספק אלמנטים גנטיים מורכבים, כגון רצפים פוליציסטרוניים או המכילים אינטרונים (vi) פרופיל אתר אינטגרציה בטוח יותר ו- ( vii) מערכת קלה יחסית למניפולציה וייצור וקטורים. בהתאם, לטכנולוגיות lentivector יש כיום שימוש נרחב במחקרי ביולוגיה ותרגום בסיסיים עבור ביטוי יתר טרנסגני יציב, השתקת גנים מתמשכת, חיסון, in vivo הדמיה, יצירת חיות טרנסגניות, אינדוקציה של תאים פלוריפוטנטיים, שינוי תאי גזע ומעקב שושלת, או עריכת גנים מכוונת אתרים. יתרה מכך, בעידן "-omics" בתפוקה גבוהה הנוכחית, הזמינות המסחרית של וקטורים לנטי-ויראליים מוכנים מראש, אשר מתוכננים לבטא או להשתיק גנים רחבי גנום, מאיצה את ההתרחבות המהירה של טכנולוגיה וקטורית זו. בסקירה הנוכחית, אנו מעריכים את ההתקדמות בטכנולוגיית הווקטור ה-lentiviral, כולל לנטי-וירולוגיה בסיסית, עיצובי וקטורים לשיפור היעילות והבטיחות הביולוגית, פרוטוקולים לייצור וקטור וזיהום, מסירת גנים ממוקדת, יישומים מתקדמים של lentiviral ובעיות הקשורות למערכת הווקטורית.


Lentivector biosafety - ביולוגיה

סקירה ומדריך של וקטורים לנטי-ויראליים ורטרו-ויראליים להעברת חומצות גרעין

בשנים האחרונות, וקטורים רטרו-ויראליים ולנטי-ויראליים הפכו לכלים חיוניים יותר ויותר לאספקת חומצות גרעין לסוגי תאים רבים במגוון מערכות ניסוי. בנוסף להיותם חשובים במסגרות מעבדה לשימוש הן בתרבית רקמות והן במודלים של בעלי חיים, הם יושמו גם בניסויים קליניים לטיפול במחלות גנטיות. Zynteglo מ-Bluebird Bio הוא טיפול גנטי לבטא-תלסמיה תלוית עירוי, בו מועברים תאי גזע המטופואטיים אוטולוגיים. ex vivo עם הגן בטא-גלובין דרך וקטור lentiviral פסאודוטייפ עם vesicular stomatitis virus glycoprotein G. שימוש במערכות lentiviral או retroviral מאפשר שילוב יציב ותורשתי של רצף חומצות גרעין ספציפיות בגנום של תא המטרה. ניצול תכונה זו של וקטורים לנטי-ויראליים ורטרו-ויראליים מאפשר ביטוי קבוע תיאורטית של מבנה גן, כגון רצף קידוד siRNA או חלבון, באוכלוסיית תאים, או ברמה של תא בודד [6].

בני משפחת ה-Retroviridae, הכוללים נגיפי γ-רטרו ולנטי-וירוסים, מאופיינים ביכולתם לבצע רטרו-תעתיק את גנום ה-RNA שלהם לתוך עותק cDNA, אשר לאחר מכן משולב ביציבות בגנום התא המארח. רטרו-וירוסים מתוארים לעתים קרובות כפשוטים (נקראים לפעמים אונקוגניים או γ-רטרו-וירוסים, למשל, וירוס הלוקמיה של עכברים [MLV]) או מורכבים (לדוגמה, lentiviruses). ההבדל העיקרי בין תת-הסוגים הללו הוא נוכחותם של מספר גנים נלווים ומווסתים ברטרו-וירוס מורכבים, אך לא פשוטים (עליהם נדון בהמשך) [4, 7]. החלקיקים הנגיפיים של שתי הקבוצות (איור 1) מכילים שני עותקים של RNA בעל גדילים חיוביים עם תמלול הפוך ויראלי (RT) משויך הממוקם בתוך ליבה פנימית. כמו כן ממוקמים בתוך תא זה חלבונים מבניים ואנזימטיים, כולל הנוקלאוקפסיד (NC), קפסיד (CA), אינטגראז (IN) ופרוטאז (PR). הליבה הפנימית מוקפת בשכבת חלבון חיצונית המורכבת מחלבון המטריצה ​​(MA), אשר בתורה מוקפת על ידי מעטפת הגליקופרוטאין (ENV) משובצת, הנגזרת מממברנת התא המארח [4, 7]. Intasome, טטרמר של אינטגראז (IN) המורכב על קצוות DNA ויראלי, לוכד את הנוקלאוזומים של המארח ומאפשר ריקומבינציה של DNA ויראלי בנקודות חמות ספציפיות [8].

נגיפי רטרו פשוטים ומורכבים מכילים שניהם שני עותקים של RNA ליניארי, לא מפולח, חד-גדילי באורך 7-12 קילו-בייטים המקודדים לגנים gag, pol ו-env. Gag מקודד לפוליפרוטאין שמתורגם מ-mRNA לא מחולק אשר מבוקע לאחר מכן על ידי הפרוטאז הנגיפי (PR) לחלבוני MA, CA ו-NC. הגן Env מקודד גם למבשר פוליפרוטאינים אשר מבוקע על ידי פרוטאז תאי לתוך גליקופרוטאין המעטפת של השטח (SU) gp120 והגליקופרוטאין הטרנסממברני (TM) gp41. בעוד ש-gp120 יוצר אינטראקציה עם הקולטן התא וקורצפטור, gp41 מעגן את קומפלקס gp120/gp41 בממברנה הוויראלית ומזרז היתוך ממברנה עם התא המארח במהלך הכניסה. פול מתבטא כפוליפרוטאין Gag-Pol כתוצאה מהסטת מסגרת ריבוזומלית במהלך תרגום Gag mRNA, ומקודד לחלבונים האנזימטיים RT, PR ו-IN. שלושת החלבונים הללו קשורים לגנום הנגיפי בתוך הנגיף. לחלבון RT יש שלוש פעילויות מובחנות: (א) פעילות DNA פולימראז תלוית RNA, האחראית לתעתוק שני הגנומים של RNA ל-cDNA יחיד (ב) פעילות RNase H ו-(ג) פעילות DNA פולימראז תלויה ב-DNA. PR מבקע את פוליפרוטאינים של gag ו-Gag-Pol, וכתוצאה מכך הבשלה של ויריון וייצור של ויריון מדבק לחלוטין. IN אחראית לשילוב של cDNA ויראלי בגנום התא המארח. לאחר השילוב, הגנום הנגיפי צמוד לכרומוזום התא המארח ומכונה פרו-וירוס [1, 4, 7, 9].

התכונה העיקרית של גנומים רטרו-ויראליים מורכבים המבדילים אותם מאלה של רטרו-וירוסים פשוטים היא נוכחות של קבוצה של גנים נלווים שתוצרים שלהם מעורבים בוויסות של שעתוק, הובלת RNA, ביטוי גנים והרכבה. אלה כוללים את חלבוני Rev ו-Tat וכן את חלבוני העזר Vpu, Vif, Vpr ו-Nef. Rev הוא חלבון קושר RNA המקדם ביטוי גנים בשלב מאוחר. זה חשוב גם להובלה של ה-mRNA הבלתי-מחוברים או החבורים, המקודדים לחלבונים מבניים נגיפיים, מהגרעין לציטופלזמה. Tat הוא חלבון קושר ל-RNA המשפר את השעתוק. חלבון Nef מעכב את הפעלת תאי T. Vpu משפר את שחרור הנגיף משטח התא אל הציטופלזמה במהלך הכניסה [7]. חלבון ה-Vif נחוץ לשכפול של נגי-לנטי בשל יכולתו לווסת את התגובה האנטי-ויראלית של המארח [7, 10].

לגנום הפרוירוס המשולב (איור 2) יש חזרות סופיות באורך 5' ו-3' ארוכות (LTR) שכל אחת מהן מורכבת משלושה אזורים: (א) אזור U3, שמתפקד כמקדם ומכיל אלמנטים משפרי תעתיק ותיבת TATA (ב). ) אזור ה-R, שבו מתחיל השעתוק ו-(ג) אזור U5, המעורב בשעתוק הפוך ונושא אתר קושר ל-tRNA פריימר. מרכיבי רצף חשובים נוספים של הפרובירוס הם אות האריזה (ψ, psi) ומערכת הפוליפורין (ppt), המשמשת כאתר התחלת סינתזת DNA של גדיל חיובי במהלך שעתוק הפוך [4, 7, 9].

למרות ההבדלים בגנום, מחזורי השכפול של רטרו-וירוסים פשוטים ומורכבים דומים מאוד (איור 3). זיהום מתחיל כאשר המעטפת גליקופרוטאין gp120 קושר את הקולטן הסלולרי, וכתוצאה מכך שינוי קונפורמטיבי ב-ENV שחושף את תת-יחידת ה-TM, וכתוצאה מכך היתוך של מעטפת ה-virion והממברנה התאית ולאחר מכן שחרור הליבה לתוך הציטופלזמה [4]. טרופיזם ויראלי נקבע על ידי זיהוי של קולטנים תאיים ספציפיים על ידי גליקופרוטאין המעטפת הנגיפית gp120 [9]. לדוגמה, HIV ו-SIV מזהים CD4 על לימפוציטים T עוזרים ומקרופאגים ואחריהם אינטראקציה עם הקולטפטור, לרוב CXCR4 או CCR5 [1, 9]. בעודם נמצאים בליבה הנגיפית, גנום ה-RNA מועתק על ידי RT ל-DNA דו-גדילי [1, 2, 11].

יש לציין שזו הנקודה בה מחזור השכפול הנגיפי של נגי-לנטי שונה מזה של רטרו-וירוסים פשוטים. ה-dsDNA הנגיפי של רטרו-וירוסים פשוטים אינו מסוגל לעבור דרך קומפלקס הנקבוביות הגרעיניות ודורש פירוק של הממברנה הגרעינית במהלך מיטוזה כדי שהשילוב של ה-cDNA יתרחש [4, 7]. במהלך הדבקה ב- lentivirus, לעומת זאת, קומפלקס הקדם-אינטגרציה מועבר לגרעין, ולכן נגיפים לנטי-וירוס מסוגלים להשתלב בתאים מתחלקים וגם בתאים שאינם מתחלקים [4, 12]. זוהי תכונה חשובה שיש לקחת בחשבון בעת ​​בחירת הווקטור המתאים ליישום ספציפי, שכן וקטורים רטרו-ויראליים לא ישלבו ביעילות את הטרנסגן בתאים שאינם מתחלקים.

האינטגרציה מתווכת על ידי הפעילות האנזימטית של IN. התהליך מתחיל בהסרה של מספר נוקלאוטידים מקצה ה-3' של שני גדילי ה-cDNA. IN גם מבקע את ה-DNA התאי, וה-cDNA הנגיפי מקושר לתליונים אלו. פערים חד-גדיליים ממולאים על ידי מנגנון תיקון ה-DNA הסלולרי [1]. ה-DNA הנגיפי המשולב מכונה "פרו-וירוס" והוא משוכפל ועובר בירושה יחד עם הכרומוזום המארח. במשך זמן רב חשבו שהאינטגרציה לא התרחשה באופן ספציפי לרצף [9]. עם זאת, אינדיקציה מוקדמת לכך שאינטגרציה עשויה להתרחש באופן לא אקראי, נתקלה במהלך ניסוי בריפוי גנטי עבור X-SCID שבו וקטור טיפולי מבוסס MLV השתלב באופן סלקטיבי בסמיכות לפרוטו-אונקוגן במספר נבדקים. זה נראה כגורם תורם להתפתחות לוקמיה אצל חלק מהחולים שקיבלו, והעלה חששות לגבי תופעות הלוואי המוטגניות של החדרה רטרו-ויראלית. מאז הרצף של הגנום כולו, מחקרים עדכניים מראים שלמעשה קיימים דפוסי אינטגרציה ספציפיים לווירוס שעשויים להיות תלויים במבנה הכרומטין ולא ברצף ה-DNA. לדוגמה, לאחרונה הוכח שהשילוב של HIV-1 cDNA מופרע כאשר כרומטין המטרה נדחס [13]. לעומת זאת, נגיף סרקומה של עופות (ASV), למעשה נצפה להשתלב ביעילות רבה יותר לאחר עיבוי של כרומטין המטרה. כמו כן, עבור HIV-1 ו-2, וקטורים מבוססי HIV-1, וקטורים מבוססי וירוס חיסוני סימאן (SIV) ונגיף חסר חיסוני בחתולים (FIV), כ-70% מאירועי האינטגרציה מתרחשים בתוך גנים [13]. נראה כי וקטורים Lentiviral מראים העדפה לאינטגרציה באתרים מרוחקים מאתרי התחלה של תמלול [11, 14]. לעומת זאת, כ-20% מאירועי האינטגרציה במהלך זיהום MLV (נגיף γ-רטרו) מתרחשים בסמוך לקצה 5' של יחידות התעתיק, עם העדפה מסוימת לאיי CpG וקרבה לאתרים רגישים ל-DNase I. באופן מעניין, נראה כי ל-HIV-1, SIV, MLV ו-ASLV יש העדפות בסיס סימטריות המקיפות את אתרי האינטגרציה [13, 15]. מה שמסבך עוד יותר את ההבנה שלנו לגבי סלקטיביות של אתרי אינטגרציה פרו-ויראליים היא התרומה המורכבת של גורמי התא המארח, המשתנה בהתאם לרטרו-וירוס המדובר ולסוג התא הנגוע [13]. להטיות באינטגרציה של האתר יכולות להיות השלכות מעניינות על רמת הגנוטוקסיות של וקטורים lentiviral או γ-retroviral שונים. יש לציין כי נראה שלווקטורים לנטי-ויראליים יש פוטנציאל אונקוגני נמוך בהשוואה לוקטורים רטרו-ויראליים [11, 14].

ה-cDNA הנגיפי המשולב מועתק על ידי מנגנון התעתוק הסלולרי [4] באמצעות המקדם/משפר הנגיפי ב-5' LTR [16]. התמלילים מועברים מהגרעין ומתורגמים בדומה ל-mRNA תאיים [16]. התמלילים המוקדמים מקודדים ל-Rev, Nef ו-Tat, כאשר Tat ו-Nef כל אחד מכיל אינטרונים שמוסרים ב-mRNA הבוגרים [9]. Tat נקשר לאתר Transactivation Response Element (TAR) הממוקם ב-5' LTR וממריץ את השעתוק של תמלילים ארוכים יותר [14]. Rev נקשר לאינטרונים של mRNA ויראלי שזה עתה הועתק. הצטברות של Tat ו-Rev גורמת למעבר לשעתוק מאוחר, במהלכו מתורגמים mRNAs הכוללים אחד או את שני האינטרונים. תעתיקים ארוכים יותר אלו מקודדים לחלבונים המבניים [9].

בציטופלזמה, שני RNA גנומי ויראלי מתחבר לאנזימי שכפול וחלבוני הליבה מתאספים סביבם ויוצרים את קפסיד הנגיף. בזמן שהוא נודד לעבר פני התא, הפוליפרוטאינים Gag ו-Gag-Pol מבוקעים על ידי הפרוטאז הנגיפי, וכתוצאה מכך נוצר חלקיק זיהומי בוגר [9, 14]. לאחר מכן, החלקיק הבוגר ניצנים מהממברנה התאית, ובכך רוכש את המעטפת שלו [7].

לאחרונה, כמה מעבדות ייצרו וירוסי lentivirus שאינם משתלבים במנגנון הרטרו-וירוס המסורתי, או לחילופין אינם משתלבים כלל. אלה האחרונים, הנקראים וקטורים לנטי-ויראליים פגומים באינטגרציה, מכילים IN מוטציה שחסרה פעילות אנזימטית. וקטורים lentiviral אלה מייצרים עיגולי DNA אפיזומליים דו-גדיליים בגרעין התא המארח. וקטורים לנטי-ויראליים פגומים באינטגרציה פותחו חלקית עקב חששות סביב האינטגרציה האקראית ואונקוגנזיס ההחדרה (מתואר לעיל) [15]. קיימים גם היברידיות של וקטור-טרנספוזון לנטי-ויראלי אשר מייצרים טרנסגנים משולבים ביציבות על ידי טרנספוזיציה. לבסוף, ישנם וקטורים לנטי-ויראליים שמחדירים גנים על ידי רקומבינציה הומולוגית. יש לכך יתרון של הקטנת הסיכוי למוטגנזה של החדרה ומאפשרת לשמור על דפוס הביטוי הטבעי של רצף 'ההחלפה' [15].

צעד גדול נוסף קדימה בטכנולוגיית וקטור לנטי-ויראלית ורטרו-ויראלית היה השימוש בהם בבעלי חיים ובבני אדם. ניתן לשנות תאים ראשוניים גנטית באמצעות וקטורים לנטי-ויראליים או רטרו-ויראליים (למשל, החדרת תאים סרטניים או הפטוציטים שעברו GFP) ולאחר מכן להחדיר אותם לעכברים. לאחר מכן ניתן לעקוב אחר התאים באמצעות טכניקות הדמיה שונות [14]. וקטורים Lentiviral יכולים גם להחליף את הזרקת ה-DNA של פלסמיד לתוך ביציות מופריות כדרך לייצר בעלי חיים מהונדסים בשל יעילות העברת הגנים שלהם, החוסן של ביטוי טרנסגנים ושיעור ההישרדות המוגבר במיני בעלי חיים רבים ושונים [14, 17, 18]. וקטורים Lentiviral הראו הבטחה גם ביישומים רפואיים. עם זאת חששות בטיחות וגנוטוקסיות הם מכשול עיקרי לשימוש הטיפולי הנרחב בוקטורים ויראליים. ישנם גם אתגרי ייצור, כגון הבטחת הטוהר והתפוקה הגבוהה הנדרשים לוקטורים לנטי-ויראליים בדרגה קלינית [19]. היו מספר מקרי מוות כתוצאה מפרוטוקולים של ריפוי גנטי שהשתמשו בוקטורים אדנו-ויראליים, בוקטורים γ-רטרו-ויראליים או בוקטורים של וירוסים הקשורים לאדנו. כפי שהוזכר לעיל, למרות ניסוי מוצלח בשימוש בוקטורים רטרו-ויראליים לתיקון X-SCID, רבים מהחולים מתו בסופו של דבר מלוקמיה שנגרמה כתוצאה ממוטגנזה של הטרנסגן [19]. ממשיכה להתרחש התקדמות בהפיכת הווקטורים הללו בטוחים ושימושיים יותר עבור ניסויים קליניים. לדוגמה, תיקון מוצלח של מחלת תאי חרמש במודל של בעלי חיים הושג לאחרונה על ידי התמרה של תאי גזע hematopoietic עם וקטור lentiviral [20]. מעניין לציין כי מחקר מבטיח הראה לאחרונה כי וקטורים שמקורם ב-HIV לטיפול גנטי עשויים להיות שימושיים במאבק בזיהום ב-HIV עצמו [21, 22].

פיתוח שיטות חדשניות לאספקת חומצות גרעין פתחה אפיקים חדשים ליישומים טיפוליים, כגון החלפות גנים. בפרט, שיטה חדשה המשתמשת בוקטור ה-lentiviral G1XCGD לביטוי של ה-gp91phoxtransgene בתאים מיאלואידים נבדקה בהצלחה במודל עכברים [23]. תאי CD34+ שהועברו עם הווקטור lentiviral הושתלו בעכברים וגרמו לרמות בולטות מבחינה טיפולית של פעילות NADPH בתאים מיאלואידים.

כמו כן, חולים עם סיסטיק פיברוזיס (CF) עשויים להפיק תועלת מספקת מהגישה הטיפולית המבוססת על וקטורים lentiviral, אשר משתלבים בגנום ומייצרים ביטוי גנים יציב. מחקר שבוצע בחזירי CF, מודל CF ניסיוני של בעלי חיים, השיג את השיפור של תפקודי CFTR (transmembrane conductance regulator חלבון) באמצעות וקטור lentiviral מבוסס וירוס חיסוני בחתולים [24]. לפיכך, שחזור של הפרעת תעלות האניונים הושג על ידי CFTR שנמסר על ידי lentivirus. בנוסף, וקטורים לנטי-ויראליים המבוססים על אתרי כניסה ריבוזומליים פנימיים, אשר ביטאו גורמים אנגיוגניים ומגנים על הלב וממריץ ההתכווצות SERCA2a, הראו שיפור משמעותי בתפקודי הלב כאשר ניתנו לעכברים עם אוטם שריר הלב שנגרם בניסוי [25].

מספר ניסויים קליניים כבר הראו יעילות ראשונית עבור גישות טיפוליות המבוססות על lentivirus. בפרט, שיפור משמעותי בתסמינים של מחלת פרקינסון דווח לאחרונה על ידי ניסוי של ProSavin, וקטור lentiviral המספק דופמין [26].הוכח כי ProSavin נסבל היטב בחולים עם מחלת פרקינסון.

יש לנקוט זהירות בטיפול בוקטורים מבוססי lentivirus ו-y-retrovirus שכן הם בדרך כלל מקורם בפתוגנים אנושיים. החששות העיקריים בעבודה עם וקטורים אלה הם (א) יצירת lentivirus בעל יכולת שכפול, מזהמת (ב) הפוטנציאל לאונקוגנזה ו-(ג) הרעילות הפוטנציאלית של הטרנסגן. למערכות הלנטי-ויראליות מהדור השני והשלישי, המרכיבות את רוב המערכות ההלנטי-ויראליות הזמינות באופן מסחרי, ישנן תכונות בטיחות רבות המפחיתות סיכונים אלו [27]. במערכות אלו, החלבונים האריזה והאנזימטיים מבוטאים בוקטורים נפרדים, מפחיתים את ההומולוגיה בין מבני האריזה ובכך מפחיתים את הסיכוי לרקומבינציה הומולוגית. יתרה מזאת, וקטורי העברה לנטי-ויראליים רבים מנטרלים את עצמם עקב מחיקה ב-3'LTR [28].

  • לבישת ציוד מגן אישי מתאים (כלומר, מעיל מעבדה וכפפות חלק מהחברות מציעות כפפות כפולות)
  • עבודה במנדף זרימה למינרית Class II
  • טיהור כל משטחי העבודה (במיוחד לאחר שפיכה, התזה או ייצור אירוסול)
  • יישום של בלימה BL2 או משופרת BL2

מידע נוסף על טיפול בנגיפים ורטרו-וירוסים, ותיאור של קריטריונים של רמת הבטיחות הביולוגית במעבדה, מסופק על ידי ה-NIH והמשרד לבריאות ובטיחות של המרכז לבקרת מחלות: [29, 30].

מערכות מסירת גנים לנטי-ויראליות ורטרו-ויראליות מנצלות היבטים של שכפול רטרו-וירוס כדי לספק אינטגרציה יציבה של רצף חומצות הגרעין הרצויות. בעוד שטרנספקציה של חומצות גרעין גורמת רק לביטוי טרנסגן חולף, הפעילות של האינטגראז הנגיפי במערכות מבוססות רטרו-ויראליות ולנטיו-ויראליות מאפשרת אינטגרציה יציבה של הטרנסגן אשר עובר בירושה ומתבטא באופן רציף על פני חלוקות תאים חוזרות ונשנות. תכונה מרכזית של וקטורים לנטי-ויראליים וגם של וקטורים רטרו-ויראליים היא שהם מייצרים חלקיקים פגומים בשכפול, או מנטרלים את עצמם. זה מאפשר אספקת הרצף הרצוי, ללא המשך שכפול ויראלי בתאי המטרה. חשוב מכך, מכיוון שחלקם מפותחים מנגיף אנושי, זה מבטל את הסכנות הכרוכות בשימוש בפתוגן חי. הייצור של וירוס פגום בשכפול מתבצע באמצעות טרנס-השלמה (איור 4) שבו תאי האריזה עוברים יחד עם שלושה פלסמידים נפרדים (איור 5) (ראה להלן) המבטאים יחד את כל החלבונים הנגיפיים הדרושים ליצירת חלקיקים זיהומיים, כמו כמו גם רצף חומצות הגרעין המעניין שייארוז בתוכם למסירה. בעוד שמערכות וקטור לנטי-ויראליות רבות מבוססות על התמרה של שני פלסמידים עוזרים (דור שני) עם פלסמיד ההעברה, לכמה מערכות חדשות יותר (דור שלישי) יש את האריזה והמעטפת בונים על שלושה פלסמידים המשולבים עם פלסמיד ההעברה. ההעברה הטיפוסית ושני פלסמידים עוזרים המשמשים בייצור רטרו-ויראלי או לנטי-ויראלי פגום בשכפול הם:

וקטור זה משמש להעברת גנים בעלי עניין לתוך תאי המטרה. ישנה מחיקה של אזור U3 ורצפים אחרים פעילי תעתוק מה-3' LTR, מה שגורם לכך שהוא LTR משבית את עצמו (אשר נחשב בטוח יותר מאשר בעל LTR שלם/פעיל שיכול להפעיל גנים הסמוכים להחדרה ). ה-5' LTR מניע את הביטוי של ה-RNA הגנומי הארוז, והטרנסגן מונע מפרומוטור בתוך הווקטור [14].

גאג ופול: חלבונים ויראליים אלו נחוצים להבשלת הנגיף. Tat ו-Rev מגבירים את פעילות התעתיק ואת הייצוא הגרעיני של RNA גנומי. הגנים הנלווים נמחקו כדי להגביר את הבטיחות על ידי הפחתת ההסתברות לרקומבינציה (ראה סעיף בטיחות להלן) [14]. טאט הוסר בדורות חדשים יותר של מערכות lentiviral ו-Rev הוצב על וקטור נפרד כדי להגביר את הבטיחות.

וקטורים ויראליים יכולים להיות פסבדוטייפ עם חלבוני מעיל מפתוגנים אחרים כדי לשנות את הטרופיזם שלהם. הנפוץ ביותר בשימוש הוא גליקופרוטאין מעטפת G fusogenic של וירוס סטומטיטיס שלפוחית ​​(VSV-G) [31], למשל, פלסמיד AddGene pCMV-VSV-G (8454) [32], יחד עם הפלסמיד האריזה AddGene psPAX2 (12260) ) [33-36]. אם כבר מדברים על וירוס סטומטיטיס שלפוחית, ישנם מקרים שבהם מערכת פסאודוטייפ של וירוס סטומטיטיס שלפוחית ​​מועדפת על פני נגיף לנטי-ויראלי, למשל, לבחינת כניסת הקורונה-ויראלית לתאי המארחים [37]. חלבוני מעטפת נפוצים אחרים נגזרים מנגיף הכלבת, MLV, אבולה, בקולווירוס, וירוס החצבת ופילוווירוס. בעוד ש-baculovirus GP64, ו-Hepatitis E1 ו-E2 פסאודוטייפ משפר את התמרה הכבדית, פסאודוטייפ של מעטפת פילו-וירוס משפר את ההתמרה של תאי אפיתל או אנדותל בדרכי הנשימה. באופן מעניין, פסאודוטייפ עשוי גם להשפיע על סחר של נגיף הלנטי עם הגליקופרוטאין של וירוס הכלבת הגורם להובלה אקסונלית רטרוגרדית [15].

הערה: בשל הבדלים איזופורמיים בין גנים γ-רטרו-ויראליים ו-lentiviral gag, pol ו-env, פלסמידים האריזה אינם ניתנים להחלפה עם פלסמידי ההעברה [38].

מבחינה פרוצדורלית, ההבדל העיקרי בין וקטורים לנטי-ויראליים ו-רטרו-ויראליים הוא שעם וקטורים לנטי-ויראליים, בדרך כלל וקטורי האריזה, המעטפת וההעברה עוברים קו-טרנספקציה לקו התא האריזה, בעוד שעם וקטורים רטרו-ויראליים רק וקטור ההעברה עובר העברה לקו תאים שכבר יציב. נושא את שני הוקטורים האחרים. עבור רטרו-וירוסים, וקטור ההעברה עובר טרנספקציה לתאי Phoenix, קו תאים המבוסס על Human Embryonic Kidney 293T הנושא את שני מבני העזר (env ו-gag-pol) כאפיזומים. תאים אלה צריכים להיות מועבים רק עם וקטור ההעברה על מנת לייצר רטרו-וירוס (איור 4, מימין). תאי פיניקס צריכים להיבחר פעמיים כל שלושה חודשים עם Hygromycin B ו- Diphtheria toxin למשך שבוע אחד כדי להבטיח את נוכחותם של שני המבנים המסייעים בכל התאים. Phoenix-Eco ו-Phoenix-Ampho זמינות דרך ATCC [39, 40] ו-Invitrogen. פלסמידים המבטאים מעטפת lentiviral בשימוש נפוץ כוללים את Addgene pMD2.G (12259), למשל [36, 41].

בדרך כלל, תאי Human Embryonic Kidney 293T או 293FT משמשים כקו האריזה של נגיפי לנטי. נעשה שימוש גם ב-Phoenix-ECO [42]. תאי 293FT תוכננו לייצר טיטר גבוה של lentivirus. יצירת שורות תא אריזה עבור וקטורים לנטי-ויראליים הוכיחה את עצמה כקשה יותר, שכן קשה היה להתגבר על הרעילות של הפרוטאז (מקודד על ידי הגן pol) ו-VSV-G [15]. מספר מערכות ייצור לנטי-וירוס רטרו-וירוס פותחו והן זמינות באופן מסחרי (מפורט להלן בסעיף הריאגנטים).

בעת בחירת פלסמיד העברה, חשוב לשים לב לפרומוטור המניע את הגן המעניין. מקדמי RNA Pol II (כגון CMV) מניעים ביטוי RNA מקודד חלבון. מקדמי RNA Pol III (כגון H1 או U6), מניעים ביטוי של תמלילים קצרים יותר, כגון shRNAs.

  • השלב הראשון בייצור וקטור lentiviral הוא קו-טרנספקציה של תאי האריזה עם הפלסמידים של ההעברה, המעטפת וה-gag-pol (או טרנספקציה בודדת של פלסמיד ההעברה במקרה של ייצור וקטור רטרו-ויראלי).
    הערה: אין לאפשר לתאי אריזה להגיע למפגש מכיוון שהדבר מפחית את יעילות ההעברה שלהם. לדוגמה, טרנספקציה התרחשה ב-70% ריכוז [43].
    איכות ה-DNA של פלסמיד יכולה גם להשפיע על יעילות ההעברה. השימוש בערכות מסחריות, כגון ערכת פלסמיד ללא אנדוטוקסין של QIAGEN, יכול לעזור אם איכות הפלסמיד מהווה בעיה.
  • תאים שמקורם ב-HEK 293T ניתנים להעברה רבה על ידי טרנספקציה בתיווך סידן פוספט או על בסיס שומנים (ראה סעיף ריאגנטים להלן). בהתאם לפרוטוקול ההעברה המשמש, ייתכן שיהיה צורך לשטוף את התאים, ולאחר מכן להוסיף מדיה טריה תוך 12 עד 18 שעות. בערך 24 שעות לאחר ההעברה, יש להסיר את המדיה ולהחליף במדיה המיועדת ליישום על תאי המטרה. תאי האריזה מורשים כעת לייצר וירוס במשך 48-72 השעות הבאות. מכיוון שווירוסים יציבים יותר ב-32 מעלות צלזיוס מ-37 מעלות צלזיוס, ניתן להדגיר את תאי האריזה בטמפרטורה זו עד לאיסוף הנגיף.
  • הריכוז הגבוה ביותר של נגיף מיוצר בדרך כלל בין 48-72 שעות. כדי לאסוף את הנגיף, הסר את הסופרנטנט מתאי האריזה והנח אותו בשפופרת של 15 מ"ל. כדי להסיר פסולת סלולרית, ניתן לבצע צנטריפוגה של הסופרנטנט ב-1500 סל"ד למשך 5 דקות או לסנן אותו דרך מסנן של 0.45 אום ולרכז אותו באמצעות, למשל, רכז Clontech Retro-X [44].
    הערה: ניתן לאחסן את הנגיף המטוהר ב-80 מעלות צלזיוס עד לצורך. עם זאת, הטיטר יורד בכ-50% עם כל מחזור הקפאה-הפשרה.
  • ניתן להוסיף מדיה בחזרה לתאי האריזה וניתן לחזור על הקציר עד 96 שעות לאחר ההעברה אם רוצים עוד וירוסים.
    הערה: אם תרצה, ניתן לקבוע את טיטר הנגיף בשיטות שונות, כפי שנדון בהמשך.
  • כעת ניתן להוסיף את המדיום המכיל וירוסים לתאי המטרה התת-קונפלונטיים. תאים המתחלקים באופן פעיל יקלוט את הנגיפים בצורה יעילה יותר במקרה של וקטורים רטרו-ויראליים, התאים חייבים להיות מתחלקים או שהמבנה לא יגיע לגרעין. בהתאם לניסוי שלך, אתה יכול לבחור ריבוי זיהום ספציפי (MOI) או שאתה יכול לבדוק טווח של נפחים של הנגיף המטוהר כדי לקבוע מה נותן לך את התוצאות המתאימות.
  • ניתן לשפר התמרה לנטי-ויראלית ורטרו-ויראלית על ידי הוספת פוליברן [36, 45] (Santa Cruz sc-134220 MilliporeSigma TR-1003-G [46] MilliporeSigma 107689 [47] ) או פרוטמין סולפט [41, 48]. ידוע גם בשם hexadimethrine bromide, פולימר קטיוני זה משמש להגברת היעילות של התמרה רטרו-וירוס. הוא חשב לפעול על ידי נטרול הדחייה הטעונים של תאים וירוסים [49] והגברת ספיחה בלתי תלויה בקולטן של הנגיפים [50]. עבור תאי השעיה (בהשוואה לתאים נצמדים), ספינוקולציה יכולה להקל על תהליך ההמרה [44, 47], אם כי זה עשוי להפחית את ההישרדות של, למשל, תאי T רגישים [51]. Jung HY וחב' העבירו תאי אורגנואידים אורגנואידים של Caco2 מבודדים טריים של אפיתל עכבר ראשוני עם נגיפי shRNA ורטרו-וירוסים המבטאים יתר על המידה באמצעות פרוטמין סולפט [48].
  • הכללת מעכבי Rho kinase Y-27632 יכולה לשפר את ההישרדות של תאים ואורגנואידים שמקורם בתאי גזע במהלך התמרה ויראלית [44, 52].
  • שנה את המדיה למחרת
    הערה: ניתן לשנות את המדיה תוך קצת כמו 4 שעות אם הרעילות של החלקיקים ה-lentiviral היא דאגה.
    הערה: תעתיק הפוך ואינטגרציה של המבנה מתרחשים תוך 24-36 שעות.
  • ניתן לחזור על תהליך ההמרה במידת הצורך. כאשר המדיום המכיל וירוס מוסר מתאי האריזה, מדיה טרייה מוחלפת. ניתן לאסוף את זה 24 שעות מאוחר יותר ולהשתמש בו כדי לחזור על שלב ההמרה.
  • וקטורי העברה מסוימים מכילים גם סמן כגון כתב פלורסנט או סמן לבחירת תרופות.
  • ניתן להשתמש במיון FACS כדי להעשיר עבור תאים המבטאים כתב פלורסנט (כגון GFP).
  • אם הוא מכיל סמן הניתן לבחירה בתרופה, פעל לפי הפרוטוקול של התרופה הספציפית. לדוגמה, בחירת פורומיצין מתבצעת בדרך כלל ב-1-10 ug/mL, בהתאם לרגישות תאי המטרה.

מכיוון שהייצור והיישום של וקטורים lentiviral ו retroviral מכילים שלבים רבים, ישנן מספר נקודות שבהן יעילות הייצור או ההמרה עשויה להפריע. כאן נדון בכמה מהבעיות הנפוצות ביותר:

סיבה פוטנציאלית לכך היא שתאי האריזה נשמרו במפגש, מה שגורם לירידה קצרת טווח בייצור הנגיף. שקול להפשיר אצווה טרייה של תאים. לחלופין, במקרה של רטרו-וירוסים, ייתכן שיהיה צורך לבחור פעמיים את תאי עוף החול עם היגרומיצין B ורעלן דיפתריה כדי להבטיח שכל התאים מבטאים את שני מבני האריזה.

ייתכן שיהיה צורך לייעל את היחס בין הפלסמידים של ההעברה והעוזר למערכת הספציפית שלך. רוב החברות ימליצו על יחס מלכתחילה, אך ייתכן שיהיה צורך להתאים זאת.

בעוד וקטורים לנטי-ויראליים ורטרו-ויראליים יכולים להכיל תוספות גדולות יחסית בהשוואה למערכות וקטוריות אחרות, עדיין יש מגבלת אריזה. חלקיקים ויראליים יכולים להכיל 8-10 קילובייט בין שני ה-LTR. בונים טרנסגנים ארוכים יותר מזה יקטין מאוד את יעילות האריזה, מה שיביא לטיטר ויראלי נמוך יותר.

דרך אפשרית נוספת להתגבר על טיטר נמוך היא לרכז את הנגיף. לאחר טיהור כדי להסיר את פסולת התא, הסופרנטנט יכול להיות pelleted על ידי ultracentrifugation. לאחר מכן ניתן להשהות מחדש את הנגיף המגולף בנפח המדיה או המאגר הרצוי. חברות רבות מספקות מוצרים וריאגנטים לריכוז וירוסים (ראה ריאגנטים להלן).

אם התפוקה של תאים מתמרדים נמוכה למרות טיטר גבוה של וירוס, ייתכן שהנפח הכולל של אמצעי התמרה על תאי המטרה גבוה מדי [53]. שלב ההמרה יכול להתבצע בנפח של מדיה שרק מכסה את התאים, הדבר מגביר את חשיפת התאים לנגיף וממקסם את הסבירות לאינטראקציות בין וירוס לתאים. יש להקפיד לא לייבש אזורים של המנה, למשל על ידי נדנוד של המנה מעת לעת במהלך ההמרה. ניתן להעלות שוב את הנפח לאחר 4-6 שעות כדי למנוע מהתאים להתייבש במשך הלילה.

ייתכן גם שהנגיף נאסף מוקדם מדי. שיא ייצור הנגיף הוא בין 48-72 שעות לאחר ההעברה.

סוגי תאים מסוימים, כגון פיברובלסטים ראשוניים או תאים עצביים, הם מטבעם קשים להמרה. זו יכולה להיות בעיה קשה לפתרון, ועשויה לדרוש אופטימיזציה של פרוטוקול ההמרה או התמרה עם טיטר מוגבר. פסאודוטיפוס של הנגיף המתמר כדי לכוון לקולטנים שופעים יותר בסוג תא מסוים היא גישה נוספת שיש לשקול.

ייתכן שמדיום תא אריזה לא יהיה תואם לצמיחת תאי יעד. או לדלל את הנגיף במדיום תואם תאי המטרה או לרכז אותו כמתואר לעיל ולהשהות אותו מחדש במדיום תואם לתאי המטרה.

  • כמה קשה האינסרט שאתה מנסה לשכפל?
  • האם תאי המטרה שלך קשים להמרה?
  • האם תצטרך טיטרים ויראליים גבוהים?
  • איזה סוג של תוספת אתה הולך להביע?

רבים מהריאגנטים ומפלסמידי ההעברה עברו אופטימיזציה לתנאים מסוימים (ייצור של כיטרים ויראליים גבוהים) או תוכננו עם תכונות מסוימות (כגון פרומטורים ספציפיים, כפולים או ניתנים להשררה). וקטור ביטוי lentiviral נפוץ הוא Takara Bio / Clonetech pLVX-Puro עם מקדם CMV המכונן [54].

ישנן מספר וריאציות על תאי האריזה מבוססי HEK-293 המתוארים לעיל הזמינים ממקורות מסחריים:

חֶברָה שֵׁם תכונה התייחסות
Clontech / Takara BioLenti-X 293Tייצור נגיפים פי 6 מ-293FT ופי 30 יותר וירוסים מ-293 תאים [32, 55]
גנקופואיהLenti-Pac 293Taלייצר טיטר גבוה
Cell Biolabs293LTV293 נגזר
חיבור יציב לצלחות
קצב צמיחה מהיר יותר
לייצר טיטר גבוה
SBI293TNניתן להעברה מאוד
לייצר טיטר גבוה
Cell Biolabsאריזת פלטינום רטרו-ויראלית293T נגזר
לייצר טיטר גבוה יציבות ארוכה יותר ללא בחירת תרופה
שלוש גרסאות: אקוטרופיות (Plat-E) [56], אמפוטרופיות (Plat-A) ופנטרופיות (Plat-GP)
[56, 57]
Cell Biolabs293RTV קו תאי ביטוי ואריזה רטרו-ויראלי
צמיחה מהירה יותר של תאים
טיטר רטרו-וירוס גבוה יותר
חיבור מוצק יותר לצלחות

ניתן לרכוש ריאגנטים לטרנספקציה באופן מסחרי או לגבש במעבדה. בנוסף לריאגנטים הנפוצים ביותר לטרנספקציה: סידן פוספט [44, 58], ליפופקטמין [59], פוגן [33] וכו' ישנן גם ערכות מסחריות רבות שמכילות את הפלסמידים ההעברה והמסייעים ומציגות תפוקת וירוסים גבוהה יותר. יחס אופטימלי של פלסמידים. הפרמטרים להעברת סידן פוספט עברו אופטימיזציה [60, 61], ודגירה ממושכת עם סידן פוספט עשויה להיות רעילה.

הסעיף הבא דן בכמה ריאגנטים נפוצים לטרנספקציה. קיימות גם ערכות ריאגנטים מיוחדות לטרנספקציה, למשל, Clontech/Takara Bio Xfect mESC Transfection Reagent להעברת תאי גזע עובריים של עכברים [62], Jetprime [63] או JetPEI [64] מ- Polyplus או TransIT-LT1 [65] או TransIT X2 [ 41] מגיב לטרנספקציה מ- Mirus .

Lipofectamine הוא ליפיד קטיוני עם קבוצת ראש טעון חיובי ושרשרת פחמימנים 1-2. קבוצת הראש מקיימת אינטראקציה עם עמוד השדרה של הפוספט של חומצת הגרעין. מטען פני השטח החיובי של הליפוזומים מאפשר היתוך של קומפלקס ליפוזום/חומצת גרעין עם התא בעל המטען השלילי. כדוגמה, Vodnala SK וחב' העבירו תאי אריזה Platinum-E ecotropic (PlatE) מ- Cell Biolabs ופלסמיד pCL-Eco באמצעות Lipofectamine ב- OptiMEM מ-Invitrogen [57]. ריאגנט PLUS מבית Thermo Fisher יכול לשפר את היעילות של ריאגנטים לטרנספקציה, כגון Lipofectamine [59].

חֶברָה מוצר מאפיינים
Cell Biolabsמערכת שלמה של ViraSafe™ Lentivirus Expressionמבוסס HIV-1 בטוח יותר עקב חפיפה מופחתת עם גנים מקוריים של HIV מערכת פנטרופית (VSV-G פסאודוטיפוס) או אקטופית (מדביק רק תאי עכבר או חולדה שאינם יציבים באותה מידה בהקפאה, לא ישרדו מערכות אולטרה צנטריפוגה)
ג'נקופיהערכות אריזה Lenti-Pac™ Lentiviralמערכות אריזת ביטוי HIV ו-FIV
תערובת פלסמידים לאריזה לנטי-ויראלית אופטימלית
ריאגנט לטרנספקציה של EndoFectin™ כלול
מגיב TiterBoost™ מגדיל את הטיטרים פי 5-10
SBIpPACKH1 תערובת פלסמיד אריזהמבוסס על HIV ו-FIV
בטיחות מקסימלית תערובת אופטימלית של 3 פלסמידים עוזרים: pPACKH1-GAG, pPACKH1-REV ו-pVSV-G. pPACKH1-GAG
מדביק גם תאים יונקים וגם לא יונקים
אינוטרוגןViraPower™Lentiviral תערובת אריזהמערכת lentiviral מבוססת HIV-1
שילוב אופטימלי של 3 פלסמידים של אריזות/עזר (pLP1, pLP2 ו-pLP/VSVG)
ViraPower™ ערכת ביטוי Lentiviralוקטור העברה מבוסס pLenti
שילוב אופטימלי של 3 פלסמידים של אריזות/עזר (pLP1, pLP2 ו-pLP/VSVG)
תאי אריזה 293FT
מערכת NativePure™ Lentiviral Expressionלביטוי של מיזוג ביוטיניל מסוף N ו-C עם החלבון המעניין שלך
MilliporeSigmaתערובת אריזה לנטיויראלית [66] טיטר גבוה בשימוש עם פלסמיד MISSION shRNA
היחס בין הפלסמידים שכבר עבר אופטימיזציה (אולי פחות שלבים לייצור בפועל של וירוס) פסאודוטייפ VSV-G
Cell Biolabsמערכות שלמות לביטוי רטרו-ויראלי פלטינוםמערכת ביטוי ואריזה רטרווויראלית
טיטרים גבוהים
לייצר וירוסים אקוטרופיים, אמפוטרופיים או פנטרופיים (צריך קו תאים ספציפי - אקוטרופי (Plat-E), אמפוטרופי (Plat-A) ופנטרופי (Plat-GP))

Fugene הוא מגיב לא-ליפוזומלי לטרנספקציה שטוען שיש לו יעילות גבוהה של טרנספקציה עם רעילות נמוכה. הוא תואם לסרום ואינו מצריך החלפת המדיום לאחר השימוש. זוהי תערובת קניינית של ליפידים בעלי מטען חיובי ורכיבים אחרים המקיימים אינטראקציה עם ה-DNA הטעון שלילי ומאפשרים כניסה לתא. יישומים אחרונים כוללים [33, 67].

הערה: בעת שילוב של Fugene ופלסמידים, מומלץ להשתמש בצינורות פוליסטירן ולהוסיף את Fugene אחרון כדי למנוע אינטראקציה עם הצינור.

רוש מתאר זאת כ"ריאגנט מרובה רכיבים שיוצר קומפלקס עם DNA, ואז מעביר את הקומפלקס לתאי בעלי חיים או חרקים". זה מאפשר העברה של DNA למגוון רחב של תאים עם רעילות מינימלית. זה צוטט בספרות [34].

פלסמידים של העברה נגזרים מעמודי שדרה שונים. וקטורים טיפוסיים מכילים חלק מהתכונות הבאות, או את כולן, שהופכות את הווקטורים לבטוחים יותר, מגדילות טיטרים ויראליים או משפרים את הביטוי של התוספת.

שֵׁם פוּנקצִיָה
5'LTRחזרה מסוף של 5'
SIN/LTR3' חזרת מסוף ארוכה עם השבתה עצמית
אורימקור השכפול
עמידות לאמפיצילין או קנאמיציןגן עמידות לאמפיצילין או קנאמיצין לברירת חיידקים
Psi (ψ)אות אריזת RNA
RREאלמנט תגובת Rev
cPPTמערכת פוליפורין מרכזית
hPGKמקדם איקריוטי אנושי פוספוגליצראט קינאז
אלמנט WPREWoodchuck Hepatitis Post-Transcriptional Regulatory Element
אות פוליאדנילציה SV40מאפשר סיום יעיל של תמלול ועיבוד של תמלילים רקומביננטיים
puroRגן עמידות לפורומיצין לברירת יונקים
מקור pUCמאפשר שכפול גבוה של עותק ותחזוקת פלסמיד בתאי E.Coli
SV40 Originמספק התפשטות יציבה של הפלסמיד בתאי אריזה
F1 Oriמקור השכפול

MilliporeSigma מציעה עמודי שדרה רבים עבור הפלסמידים MISSION shRNA שלהם. יש להם מגוון רחב של אפשרויות פלורסנט או סמן תרופות, ומערכות הניתנות לשרירה. וקטורי shRNA משתמשים במקדם U6. הם מציעים בקרות חיוביות ושליליות עבור כל עמודי השדרה. זה פותח בשיתוף פעולה עם מדעני קונסורציום RNA, וקטור הבסיס pLKO.1-puro פותח במכון Broad [68]. כל אלה הם וקטורים lentiviral. ערכות ובקרות שונות של פלסמידים של MISSION shRNA פורסמו ב->1,500 מאמרי כתב עת.

להשתמש מקדם עמוד שדרה סמנים לבחירה
ביטוי shRNApLKO.1-CMV PLKO.1-UbCeGFP, tGFP, TagCFP, TagYFP, TagRFP, TagFP635, TurboGFP ו-TagFP635 Puromycin, neomycin
ניתן להשראתpLKO-puro-IPTG-1xLacOפורומיצין
pLKO-puro-IPTG-3xLacOפורומיצין
טרנספקציה חולפת או יציבה של shRNA וייצור lentivirusTRC2-pLKOפורומיצין

SBI מציע וקטורים לנטי-ויראליים המבוססים על HIV ו-FIV ובעלי מקדמים רבים, בהתאם לסוג התא המועבר: CMV (Cytomegalovirus) עבור HeLa וסוגי תאים רבים אחרים ועבור HEK293 ו-HT1080 התמרה MSCV (Murine Stem Cell Virus), עבור התמרה המטופואטית ותאי גזע UbC (Ubiquitin C), עבור התמרה של רוב סוגי התאים PGK (Phosphoglycerate Kinase), עבור התמרה של רוב סוגי התאים ו-EF1 (גורם התארכות 1α), עבור התמרה של רוב סוגי התאים [69] בנוסף לוקטורי ההעברה המפורטים להלן, הם מציעים עמודי שדרה ניתנים להשראת מקדם כפולים. סמנים זמינים לבחירה כוללים GFP, RFP, Puromycin, Hygromycin, Neomycin ו-Zeocin.

סיכום של מקדם עמוד השדרה והסמנים שלהם מתואר להלן.

להשתמש מקדם עמוד שדרה
עמוד שדרה/מקדם עבור cDNApCDF1-MCS2-EF1
pCDH-CMV-MCS2
pCDH-CMV-MCS-EF1
pCDH-MCS-T2A
pCDH-CMV-MCS
pCDH-EF1-MCS
pCDH-UbC-MCS
pCDH-MSCV-MCS
pPS-EF1-GFP-RFP
pPS-PGK-GFP-RFP
pPS-MSCV-GFP-RFP
עמוד שדרה/מקדם עבור shRNApSIH1-H1
pSIF-HI
pGreenPuro
pFIV-H1
עמוד שדרה/מקדם למיקרו-DNApCDH-CMV-MCS-EF1
pMIF-cGFP-Zeo

Invitrogen מציעה את ViraPower™ Lentiviral Expression System. הפלסמידים של ההעברה הם וקטורים מבוססי pLP או pLenti ומלווים בשלושה פלסמידים של אריזה/עזר (pLP1, pLP2 ו-pLP/VSVG) [70]. יש להם מערכות lentiviral אופטימיזציה לביטוי גנים בשליטה של ​​מקדמי CMV, UbC, CMV/TO, RSV או EF-1α. הם כוללים כמה וקטורים lentiviral ליצירת חלבונים Lumio או V5 epitope-tagging. הבחנה אחת של מערכות Invitrogen היא שהן מספקות אפשרויות מרובות לשיבוט כולל מערכות Gateway (DEST™), TOPO® ומערכות מבוססות רקומבינציה (pLenti6/UbC/V5-DEST™). הפלסמידים השונים המבוססים על pLenti פורסמו במעל 2,000 מאמרי כתב עת.

להשתמש מקדם עמוד שדרה וקטור מְקַדֵם שיטת שיבוט בְּחִירָה סוכן מעורר
ביטוי גנים יעד או יצירת חלבון מתויגpLPRSV, CMVלאGFPלא
pLenti7.3⁄V5-DEST™CMV, GFPכְּנִיסָה
pLenti7.3⁄V5-TOPO®CMVTOPO® או TOPO®-TABlasticidin
pLenti6.3⁄V5-DEST™CMVכְּנִיסָהBlasticidin
pLenti6.3⁄V5-TOPO®CMVTOPO®-TABlasticidin
pLenti6.4⁄R4R2⁄V5-DEST™EF-1α, CMV, ללא (ללא מקדם)כְּנִיסָהBlasticidin
pLenti6.2/C,N-Lumio™/V5-DESTCMVכְּנִיסָהBlasticidin
pLenti6.2⁄V5-DEST™CMVכְּנִיסָהBlasticidin
pLenti6⁄V5or pDESTCMV, UbCGate Directional TOPO® או Gatewayזאוצין
pLenti4⁄V5-DEST™CMVכְּנִיסָהלא
מערכת הניתנת להשראהה-pLenti6.3⁄ TO⁄ V5-DESTCMV/TOכְּנִיסָהBlasticidinדוקסיציקלין וטטרציקלין
pLenti6/TRCMVכְּנִיסָהBlasticidinדוקסיציקלין וטטרציקלין

הפקת רטרווירוס

Cell Biolabs מציעה מגוון וקטורי ביטוי רטרו-ויראליים [71] בפלסמידים שונים ברקע שמקורם בנגיף לוקמיה של עכברים (MLV). הם מציעים קווי אריזה רטרו-ויראליים (293RTV) וערכות לטיהור וריכוז וירוסים: ערכות ריכוז וטיהור ViraBind™ או ערכות ריכוז וטיהור ViraBind™ PLUS. וקטורי pMXs, pMYs ו-pMCs שלהם הוכחו כיעילים בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים. הם מציעים מספר סמנים לבחירה: Hygromycin, Neomycin, Puromycin, Zeomycin ו-GFP. וקטורי עמוד השדרה השונים פורסמו ב->500 מאמרי כתב עת. לדוגמה, Yasuda S וחב' הציגו את RAD23B והגרסאות שלו לתאי RAD23B-KO עם וקטור pMX-Puro (Cell Biolabs) [72].

להשתמש מקדם עמוד שדרה סמן לבחירה
וקטור ביטויpBABE
pMCs-CAG
pMXs-CMV
pMXs-EF1
pMXs-EF1α
pMXs-IRES
pMXs-SRα
pMXs-U6
pMYs-IRES
pWZL
Hygromycin
ניאומיצין
פורומיצין
זאומיצין
GFP

הפקת לנטיוירוס

Cell Biolabs, Inc. מציעה וקטורי ביטוי lentiviral המבוססים על עמודי השדרה pSMPUW-IRES ו- pSMPUW-U6 שלתוכם ניתן לשבט ישירות גן בעל עניין. הם כוללים את הסמנים הבאים לבחירה: Blasticidin, Hygromycin, Neomycin, Puromycin ו-GFP. וקטורי העברה אלה נושאים גן עמידות לקנאמיצין, WPRE, Multiple Cloning Site (MCS), cPPT, 3' LTR ו-5' CMV/LTR [73]. וקטורי ביטוי אלה זכו להתייחסות ב-6 מאמרי כתב עת.

להשתמש מקדם עמוד שדרה סמן לבחירה
וקטורי ביטויpSMPUW-IRES
pSMPUW-U6
Blasticidin
Hygromycin
ניאומיצין
פורומיצין
GFP

Addgene הוא מאגר ללא מטרות רווח עבור פלסמידים ומציע מגוון רחב של וקטורי העברה lentiviral ו-retroviral. כמה וקטורים רטרו-ויראליים נפוצים מופיעים בטבלה 9. אחרים מ- Addgene כוללים pBMN-PIB [56].

להשתמש עמוד שדרה/בחירה בחירת תרופות
וקטור רטרו-ויראלי לביטוי shRNApMKO.1 ו-pMKO.1Puromycin, neomycin, Zeocin, GFP
ביטוי רטרו-ויראליpBABEHygromycin, Puromycin, Zeocin, GFP
ביטוי גנים רטרו-ויראלי של יונקים עם סמן לבחירה של GFPMSCV-IRES-GFPGFP

וקטורים lentiviral פופולריים הזמינים דרך Addgene כלולים בטבלה 10. פלסמידים אריזה Lentiviral PAX2 (12260) ו-pMD2.G (12259) מ-Addgene נמצאים בשימוש נפוץ מאוד [41, 74]. Duncan A וחב', למשל, השיגו את p-Lenti-7xTcf-FFluc-SV40-mCherry מ- Addgene (24307) [75].

להשתמשעמוד שדרההתייחסות
ביטוי לנטיויראלי pWPXL, pLenti-puro 39481 [76]
ביטוי shRNA LentiviralpLKO.1
ביטוי shRNA lentiviral הניתן ל-TetTet-pLKO 21915 [47]
ביטוי cDNAFUGW
ביטוי shRNA מותנה תחת בקרת Cre-LoxpSico
ביטוי cDNApLJM1-EGFP

SBI System Biosciences מציעה אלטרנטיבה של צנטריפוגה במהירות נמוכה לריכוז רטרו-וירוס עם ה-Retro-Concentrin™ שלהם אשר מזרז את הווירוסים ואחריו צנטריפוגה במהירות נמוכה. התהליך אורך לפחות 12 שעות. יתרון אחד, לעומת זאת, הוא שהגלולה המתקבלת מיוצבת לאחסון ב-80 מעלות צלזיוס [77].

SBI System Biosciences מציעה גם את פתרון משקעי הווירוס Peg-it™ [33]. תמיסה זו מורכבת עם פוליאתילן גליקול ועברה אופטימיזציה עבור משקעים של חלקיקים lentiviral. כאשר מערבבים אותו עם המדיה הנאספת מתאי האריזה, זה גורם לחלקיקים הנגיפים לשקוע. לאחר מכן ניתן לצנטריפוגה את התערובת כדי לגלול את החלקיקים. זה העלה את הריכוזים פי 10 עד 100.

Cell Biolabs, Inc. מספקת ערכות ריכוז וטיהור lentivirus המבוססות על עמודה, דיאליזה או פילטר. הערכה מבוססת העמודים מאפשרת ריכוז עד פי 500 עם טוהר גבוה יותר מזה של אולטרה צנטריפוגה תוך 3-5 שעות. אלה יכולים לעבד נפחים גדולים יותר מאשר שיטות מבוססות פילטרים. הערכה מבוססת דיאליזה מאפשרת ריכוז של עד 10 9 TU/mL, עם טוהר גבוה יותר, תוך כ-12-24 שעות. ערכות מבוססות פילטרים מחלימות יותר מ-90% מהנגיף באיכות גבוהה תוך פחות משעתיים.

GeneCopoeia מציעה את הפתרון לריכוז Lenti-Pac™ Lentivirus אשר, באמצעות ריאגנט הקנייני שלו, מאפשר עלייה של פי 10-100 בריכוז הנגיף תוך פחות מ-3 שעות ללא אולטרה צנטריפוגה.

חברות אחרות מספקות מוצרים דומים גם כן. רכז Lenti-X מבית Clontech (631231) הוא בחירה פופולרית לריכוז lentivirus [59, 78].

Cell Biolabs, Inc. מספקת ערכת כימות/טירינג של lentivirus. זה מודד את תכולת חומצת הגרעין הוויראלית של lentivirus מטוהר או supernatant לא מטוהר תוך 45-60 דקות. הנגיף נלכד על ידי חרוזים ולאחר מכן עובר דנטורציה, והספיגה נקראת ומשווה לעקומה סטנדרטית (תקן Lentivirus RNA שסופק עם הערכה) כדי לקבוע את תכולת חומצת הגרעין.

הם גם מספקים ערכה נוספת (QuickTiter™ Lentivirus Titer Kit) המודדת את חלבון המטריצה ​​p24 הקשור לווירוס על ידי ELISA על צלחת מצופה נוגדנים נגד p24. תקן אנטיגן p24 מסופק לכימות. Fanning S וחב' השתמשו בערכה זו כדי לקבוע את הטיטרים של וקטורי הביטוי pLV-hSyn-hSNC ו-pLV-hSyn-mGFP [79].

GeneCopoeia מציעה ערכות טיטר מבוססות qRT-PCR (ערכות טיטרציה של Lenti-Pac™ HIV ו-FIV qRT-PCR Lentivirus). הם מספקים את הבקרות הסטנדרטיות, ריאגנטים למיצוי RNA וריאגנטים qRT-PCR. גנום RNA lentiviral מכמת על ידי qPCR באמצעות טכנולוגיית SYBR ירוקה.

Cell Biolabs, Inc. מציעה ערכות (ViraDuctin™ Lentivirus Transduction Kit ו-ViraDuctin™ Retrovirus Transduction Kit) הכוללות קוקטייל קנייני שיוצר קומפלקס על עם חלקיקי lentivirus, וכתוצאה מכך לעלייה של פי 2 עד 6 ביעילות ההמרה בהשוואה ל polybrene.

SBI System Biosciences מציעה את TransDux™, שהוא מגיב לזיהום עם רעילות מינימלית המספק יעילות התמרה מוגברת משמעותית על פני פוליברן.

הם מציעים גם ערכת LentiMag™ המכילה ניסוח של ננו-חלקיקים מגנטיים שפותחו להמרה של תאי יונקים עם וקטורים של רטרו-וירוס או לנטי-וירוס. על ידי הפעלת מגנט מתחת לתאים המועברים, הנגיף הקשור לננו-חלקיקים מגנטי מתרכז בתאים במהירות רבה, מה שמגביר את יעילות ההמרה.

רבות מהחברות המפורטות לעיל ואחרות מציעות גם חלקיקי מתמר ויראלי מוכנים לשימוש בעלי טיטר וטוהר גבוהים (AddGene, MilliporeSigma SBI System Biosciences ואחרים). לדוגמה, De Cecco M וחב' השתמשו ב-pLKO-RB1-shRNA63 ו-pLKO-RB1-shRNA19 מ-T. Waldman דרך AddGene (25641 ו-25640) [80]. Duncan A וחב' השיגו את pGF-CREB-mCMV-EF1α-Puro CREB כתב ואת וקטור הבקרה בעמוד השדרה של lentivirus מ-System Biosciences (TR202va-p) [75]. SE Sillivan וחב' השיגו פרה-miR-135b-5p ובקרה בוקטור CD513 lentiviral מ-System Biosciences [64].

Dana-Farber Cancer Institute ו-The Broad Institute מספקים את ספריית הביטוי CCSB-Broad Lentiviral Expression עבור למעלה מ-15,000 ORFs אנושיים במערכת lentiviral מוכנה להבעה עם תג C-terminal V5. Ebright RY וחב' הדביקו תאי גידול מבודדים במחזור עם מספר מבנים מהספרייה [59].

למרות ההתקדמות המסוימת ביישומים הנוכחיים של גישות מבוססות lentivirus, שיפור של טכניקות העברת גנים נשאר המטרה העיקרית לפיתוח פרוטוקולים טיפוליים יעילים יותר. מספר מחקרים דיווחו על שיטות שונות לשיפור יעילות התמרה בתאי גזע המטופואטיים (HSC). מחקר שנערך לאחרונה הראה כי UM171, מפעיל של HSCs, העצים באופן משמעותי התמרה מבוססת lentivirus של תאי CD34+ [81]. כמו כן, על פי Hauber וחב', LentiBOOST, פולוקסמר אוטם ממברנות, משפר גם את היעילות של התמרה lentiviral בתאי CD34+ אנושיים המתקבלים מדם היקפי [82] ותאי T של עכברים [51].

כמו כן, לאחרונה הוצגה פלטפורמה חדשה לביטוי גנים לטווח קצר באמצעות נגיפים חסרי אינטגרציה (IdLVs), המבטאים גנים באופן חולף בלבד בתאים מתחלקים [83]. המחברים הבחינו בפעילות תפקודית משופרת של HSCs כאשר IdLVs שימשו למסירה של HOXB4 ו- Angptl3. טכניקה זו מסייעת למנוע את ההשפעות השליליות שנמצאו עם ביטוי מכונן.


הערכה פונקציונלית של קידוד וריגולציות רגולטוריות מתוך DKK1 לוקוס

ה DKK1 גֵן מקודד מעכב חוץ תאי של מסלול Wnt עם מיקום חיוני בצמיחת רקמת עצם, הומאוסטזיס עצם ואלמנטים חיוניים שונים לחלוטין של העצם ביולוגיה. מספר BMD גנום-מחקרי השתייכות רחבים (GWAS) גילו כל הזמן זיקה ל-SNPs בתוך DKK1 אזור גנומי. מסיבות אלה, חשוב מאוד להעריך את הביצועים של קידוד וגרסאות רגולטוריות בתוך גֵן.

כאן, חקרנו כעת את הביצועים של וריאנטים רגולטוריים משוערים, שהתגלו מראש הקשורים ל-BMD במחקרים רבים על ידי אחרים ועצמנו, ובנוסף שש גרסאות פספוס הקיימות ב- גֵןתושבי ראל. באמצעות מבחן לוציפראז ספציפי ל-Wnt-נתיב, החלטנו כעת שהווריאציות p.Ala41Thr, p.Tyr74Phe, p.Arg120Leu ו-p.Ser157Ile מציגות יכולת עיכוב ירידה של DKK1 בניגוד ל-WT. תוצאה סופית זו תואמת את הפנוטיפ בעל מסת עצם גבוהה (HBM) של שתי נשים מהקבוצה שלנו שנשאו מוטציות p.Tyr74Phe או p.Arg120Leu.

מנגד, באמצעות ניסוי רצף לכידת קונפורמציה של כרומוזומים במעגל (4C-), גילינו כעת שהאזור המכיל 24 גרסאות BMD-GWA, ממוקם ב-350 קילו-בייטים במורד הזרם של DKK1, מקיים אינטראקציה עם כל אחד DKK1 וה LNCAROD (רגולטור להפעלת LncRNA של DKK1, AKA LINC0148) בתאים אוסטאובלסטיים. לסיכום, כעת הוכחנו שכמה גרסאות קידוד לא שכיחות הן מוטציות אובדן תפקוד חלקי שיגרמו לפנוטיפ HBM, בעוד שה-SNPs הנפוצים הקשורים ל-BMD ב-GWAS שייכים לאזור רגולטורי משוער לטווח ארוך, באמצעות אבל מנגנון לא ידוע המערב LNCAROD. © 2020 המחברים. JBMR פלוס נדפס על ידי Wiley Periodicals LLC מטעם החברה האמריקאית לחקר עצמות ומינרלים.

/>תאים נוירואנדוקריניים ריאתיים: פיזיולוגיה, הומאוסטזיס רקמות ומחלות

מדעי הביולוגי של המערכת

System Biosciences מציעה מגוון רחב של שירותים מותאמים אישית כדי לתמוך במחקר שלך, מה שמאפשר לך להשקיע פחות זמן ביצירת כלים ויותר זמן ביצירת תגליות. נצל את המומחיות שלנו עם הטכנולוגיות הבאות: • שיבוט וקטור לנטי-ויראלי ואריזה בטיטר גבוה • בידוד אקסוזומים ורצף NGS • קווי תאים מותאמים אישית מהונדסים של CRISPR/Cas9 • יצירת קו תאים יציבה (ביטוי יתר, נוק-דאון ומערכות ניתנות להשראת) • מיני-מעגל מותאם אישית • פרופיל MicroRNA qPCR עבור כל הגנום או הפאנל לבחירתך כל השירותים הושלמו באתר במתקנים החדישים של SBI בפאלו אלטו, קליפורניה על ידי מדענים ברמת Ph.D עם ניסיון של שנים במתן שירותים איכותיים לחוקרים . בחר SBI לצרכי השירות המותאם אישית שלך - רתימת חדשנות כדי להניע תגליות מאז 2003

הסמכות והסמכות

השירותים שלנו (32)

בידוד ואפיון אקסוזום

ניתוח סמנים ביולוגיים

שיבוט מולקולרי

סינתזת גנים ותת שיבוט מותאמים אישית (Syn2CloneTM)

נמאס לך לקפוץ דרך חישוקי השיבוט כדי לקבל את המבנה שלך? חסוך לעצמך זמן ומאמץ ובקש מצוות המומחים של SBI לבנות את המבנים המותאמים אישית שאתה צריך באמצעות שירות Syn2Clone שלנו. זהו שירות סוהר לחלוטין שבו אתה מספק את רצף השיבוט ואנחנו דואגים לכל השאר. אתה מקבל תוספת QC'd מלאה המשובטת לתוך אוסף הווקטורים המוביל בתעשייה של SBI שנמסר תוך קצת כמו שבועיים ובמחיר שהוא לא הרבה יותר מהוקטור ריק.

SBI מציע מגוון רחב של אפשרויות עבור shRNAs בודדים או מרובים, cDNAs ו-amp microRNAs, כמו גם שיבוט בניית Transcription Reporter. בחר מתוך מגוון מקדמים, גנים מדווחים ומערכות מסירה כולל וקטורים Lentivector, Minicircle ו-PiggyBac.

פרטי שירות
• זמן אספקה ​​עבור פרויקטים של Syn2Clone הוא 2-6 שבועות בהתאם לגודל/מורכבות ההוספה
• כל המבנים מאומתים ברצף באמצעות מפות פלסמיד מוערות
• בחר מתוך הוקטורים הפרימיום Lentivector, Minicircle או PiggyBac של SBI
• אפשרויות התאמה אישית וקטורית כדי לתת לך בדיוק את מה שאתה צריך

הפקת לנטיוירוס

SBI הוא המוביל בתעשייה בייצור Lentivirus
SBI מציעה שירות אריזה Lentiviral Express להפקת חלקיקי וירוס באיכות גבוהה ובטיטר גבוה באמצעות מבנה ה-lentivector שלך תוך 10 ימים בלבד. חסוך לעצמך את הזמן והמאמץ של הכנת נגיף משלך, וקבל חלקיקי lentiviral מוכנים להעברה מ-SBI - המומחים Lentiviral.* (ראה נתוני הדבקות לדוגמה).
כל שירותי ייצור וירוסים מותאמים אישית צריכים להגיע עם מידע על הפלסמידים שיש לארוז.

כמות של Titer Lentivirus
ניתן למדוד טיטרים של Lentivirus במספר דרכים. מדידות חלבון משטח ויראלי על ידי ELISA מעריכות יתר על המידה את רמות הטיטר מכיוון שהיא מזהה חלקיקי וירוסים פעילים ומתים כאחד. SBI מודד טיטר וירוסים על ידי העברת תאי מטרה במספר ריבוי של זיהומים (MOIs) עם ניתוח qPCR שלאחר מכן כדי לקבוע את המספר המדויק של אינטגרציות lentiviral לכל גנום תא מטרה. טיטר מחושב זה הוא השיטה המדויקת ביותר למדידת חלקיקי וירוס פעילים ומדווחת כיחידות זיהומיות (IFU) למ"ל.

אחריות שירות אריזת וירוסים האיכותית שלנו

  • ייצור וירוס במתקן BSL-2 מתקדם עם בקרת איכות חזקה בהתאם לקריטריונים של NIH Biosafety Level 2
  • ריצות פיילוט בקנה מידה קטן זמינות לבדיקת זיהומים בקווי תאים לפי בחירתך
  • עקבי ואמין ביותר תוך שימוש בשירותי הווקטורים והשיבוט של SBI
  • טיטר וירוסים ברמות הטיטר הרצויות או מעליהן, תוך שימוש בוקטור של SBI
  • הפעלת אריזה נוספת של וירוסים כלולה אם הטיטר הרצוי לא מושג
  • גמישות של סולמות ייצור וירוסים כדי לענות על צורכי המחקר שלך
  • טיטר וירוסים מדויקים כפי שנקבעו על ידי qPCR למדידת יחידות זיהומיות למ"ל (ifus/ml)
  • סיוע טכני של מומחה מסופק על ידי הצוות המדעי המנוסה של SBI ומענה תוך 24 שעות

רצף RNA

גלה סמנים ביולוגיים חדשים של מטופלים הקיימים באקסוזומים
אקסוזומים הם שלפוחיות ממברנות בגודל 60 - 150 ננומטר המופרשות על ידי רוב סוגי התאים in vivo ו-in vitro. הם נמצאים בדם, שתן, מי שפיר, נוזלי מיימת ממאירים ומכילים תת-קבוצות ברורות של microRNAs, mRNAs, lncRNAs ו-ncRNAs אחרים. הזהות והשפע של RNAs אלה הוכחו כגישה רבת ערך לגילוי חתימות רצף לאבחון ופרוגנוזה של מחלה. SBI מכריזה על שירות רצף RNA exosome מהדור הבא שלנו כדי להאיץ את גילויי הסמנים הביולוגיים שלך. שירות Exo-NGS של SBI מספק פתרון מלא מהתחלה ועד סיום מכל נוזל ביולוגי ועד לנתוני RNA-Seq מנותחים ומיושרים. אנו מבודדים את האקסוזומים, מטהרים את ה-exoRNA ובונים את ספריות Illumina NGS. לאחר מכן, ספריות אלו עוברות רצף באמצעות ריצות קצה מזווגות של 2x75bp של Illumina NGS כדי לספק ביטחון רב יותר של זהות רצף RNA.

בנייה וקטורית של CRISPR/Cas9

עריכת הגנום באמצעות רנ"א מדריכים
הגילוי האחרון של מתחם CRISPR/Cas9 סיפק לחוקרים כלי רב ערך למיקוד ולשנות כל רצף גנומי עם רמות גבוהות של יעילות וסגוליות. המערכת, המורכבת מנוקלאז מונחה RNA (Cas9) ו-Guide RNA (gRNA) המשלימים לרצף מטרה, מאפשרת ביקוע ספציפי לרצף של לוקוסי מטרה על פני הגנום. SBI מספק עיצוב ושיבוט של gRNA בהתאמה אישית לכל וקטור SmartNuclease עם זמן אספקה ​​של שבועיים. צור איתנו קשר עוד היום כדי להתחיל.

וקטורי משאבי אנוש מותאמים אישית
מחיר לפי בקשה
למנף באופן מלא את האופי העוצמתי של פלטפורמות הנדסת הגנום CRISPR/Cas9 ו-TALEN על ידי שימוש בוקטורי משאבי אנוש תואמים. רוב אירועי עריכת הגנום משפיעים רק על אחוז מכלל אוכלוסיית התאים שעברו טרנספקציה, המוערך ב-1-80% עבור שינויים מונו- או דו-אלליים בהתאם לפלטפורמה, לסוג התא ולמטרת ה-DNA לעניין. בשל השונות הרחבה בפעילות, ביצוע מבחני פנוטיפי במורד הזרם ברקע של תאים מסוג פרא הוא מאתגר, במיוחד אם הפנוטיפ המדובר הוא עדין או קשה להבחין. לכן, כלים בצורה של וקטורים תורם או מיקוד המכילים 1) סמני בחירה פלואורסצנטיים או אנטיביוטיים ו-2) קטע גן שמעניין להחדיר, לדפוק או לתקן רצף מסוג פראי יהיו שימושיים ביותר להשגת אוכלוסייה הומוגנית של תאים שהגנום שלהם בוצע בהצלחה. SBI יצרה חבילה של וקטורי מיקוד רקומבינציה הומולוגיים המתאימים למטרת הנדסת גנים מקודדי חלבון וגם גנים שאינם מקודדים, כולל microRNAs ו-LncRNAs גנומי לוקוסים.


וקטורים לנטי-ויראליים: בסיסיים לתרגום

יותר משני עשורים חלפו מאז שימש HIV מהונדס גנטית להעברת גנים. באמצעות שיפורים מתמשכים, HIV נושאי גנים מוקדמים של סמן מוקדם התפתחו לוקטורים לנטי-ויראליים בטוחים ויעילים יותר. וקטורים לנטי-ויראליים מציעים מספר תכונות אטרקטיביות ככלי מסירת גנים, כולל: (i) אספקת גנים מתמשכת באמצעות אינטגרציה וקטורית יציבה בגנום המארח (ii) היכולת להדביק תאים מתחלקים ותאים שאינם מתחלקים (iii) טרופיזמים של רקמות רחבות, כולל חשובות סוגי תאי מטרה בטיפול גנטי ותאי (iv) ללא ביטוי של חלבונים ויראליים לאחר התמרה וקטורית (v) היכולת לספק אלמנטים גנטיים מורכבים, כגון רצפים פוליציסטרוניים או המכילים אינטרונים (vi) פרופיל אתר אינטגרציה בטוח יותר ו- ( vii) מערכת קלה יחסית למניפולציה וייצור וקטורים. בהתאם, לטכנולוגיות lentivector יש כיום שימוש נרחב במחקרי ביולוגיה ותרגום בסיסיים עבור ביטוי יתר טרנסגני יציב, השתקת גנים מתמשכת, חיסון, הדמיה in vivo, יצירת בעלי חיים מהונדסים, אינדוקציה של תאים פלוריפוטנטיים, שינוי תאי גזע ומעקב אחר שושלת, או גנים מכווני-אתר. עֲרִיכָה. יתרה מכך, בעידן התפוקה הגבוהה הנוכחית, הזמינות המסחרית של וקטורים לנטי-ויראליים מוכנים מראש, אשר מתוכננים לבטא או להשתיק גנים רחבי גנום, מאיצה את ההתרחבות המהירה של טכנולוגיה וקטורית זו. בסקירה הנוכחית, אנו מעריכים את ההתקדמות בטכנולוגיית הווקטור ה-lentiviral, כולל לנטי-וירולוגיה בסיסית, עיצובי וקטורים לשיפור היעילות והבטיחות הביולוגית, פרוטוקולים לייצור וקטור וזיהום, מסירת גנים ממוקדת, יישומים מתקדמים של lentiviral ובעיות הקשורות למערכת הווקטורית.

כתב עת

Journal Biochemical &ndash Portland Press

יצא לאור: 1 במאי 2012

מילות מפתח: מיקוד תאים, דרכי פוליפורין מרכזיות (cPPT), ריפוי גנטי, HIV-1, Lentivirus, השבתה עצמית (SIN)


צפו בסרטון: אולי זו הסיבה של נשק ביולוגי בשם קורונה? #הנאציהשקט #נגיףסיני #נשקביולוגי מטורפים #דילול אוכלוסיה (אוֹקְטוֹבֶּר 2022).