מֵידָע

כיצד מזוהה האנטיגן שכנגדו נוצרים נוגדנים עצמיים?

כיצד מזוהה האנטיגן שכנגדו נוצרים נוגדנים עצמיים?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

נגיד שאנחנו חושדים באיזו הפרעה אוטואימונית חדשה אצל חולה, ואנחנו אוספים דם לסרולוגיה.

כיצד מבדילים נוגדנים עצמיים מהנורמליים בדגימה שנאספה? לאחר זיהוים, כיצד ידוע האנטיגן שאליו הוא מכוון?

האם יש מבחנים לזה? או שזה מזוהה לפי מבנה האזור המשתנה? האם ניתן לעשות IHC פשוט על כל רקמות הגוף באמצעות הנוגדן המבודד המטוהר כדי לאתר את החלבון?

כלומר, מה השורש לחשד לאנטיגן? למשל, מה גרם לחשוד ב-ANCA (נוגדנים ציטופלסמיים אנטי-נויטרופילים) בזאבת אריתמטוזיס מערכתית (SLE)?


כל האמור לעיל, בעצם. אם מדובר באנטיגן חלבוני, ניתן לבצע משקעים חיסוניים עם הנוגדן האוטומטי ולהשתמש בכל אחת (או יותר) מכמה שיטות (Western blot, שיטות שונות של רצף וכו') כדי לזהות את השותף/ים לקשר. ניתן לזהות DNA ו-RNA בקלות באמצעים ביוכימיים. אתה יכול גם להשתמש ב-ELISAs או בשיטות דומות כמו electrochemiluminescence המאפשרות מידה רבה יותר של ריבוי.

רצף האזורים המשתנים של הנוגדנים העצמיים עשוי לתת מידע מסוים על מבנה האנטיגן, אך לא מספיק כדי לזהות בפועל את השותף המקשר. כמו כן, עובדה מרכזית אחת שכדאי לזכור היא שתגובת הנוגדנים במחלות אוטואימוניות רבות היא פוליקונלית (בדיוק כפי שתגובת תאי T היא לעתים קרובות), כלומר יכולים להיות עשרות עד מאות אזורים שונים הקובעים השלמה (CDRs) לרצף, תהליך מאוד מפרך שאולי לא יניב מידע רב.

אימונוהיסטוכימיה (IHC) יכולה להיות שימושית כדי לראות לאילו סוגי תאים נקשרים הנוגדנים, אבל היא לא נותנת רזולוציה מצוינת ברמה התת-תאית, ולא אומרת לך כלום על מהי המטרה האמיתית. בנוסף, בשל כמות העיבוד הכימי שעוברת רקמת פרפין מקובעת בפורמלין (FFPE), ייתכן שהאנטיגן של הנוגדן לא ייחשף כראוי כדי שהנוגדן ייקשר.

ממה שאני יכול למצוא, אנשים חשדו בקשר בין ANCA לזאבת עקב הדמיון בהצגה הקלינית של שתי המחלות. הנה מאמר מ-1996 שמדבר על זה, יש הרבה אחרים.


15.1: נוגדנים מיוצרים בתגובה לאנטיגנים

  • תרמה על ידי קלייר מ. או & rsquoConnor
  • פרופסור חבר אמריטוס (ביולוגיה) בקולג' בוסטון

נוגדנים הם חלבונים המיוצרים על ידי חולייתנים עם מערכת חיסון אדפטיבית המסוגלת להגיב לאנטיגנים זרים. אנטיגנים מוגדרים כחומרים הממריצים את ייצור הנוגדנים. אנטיגנים מסוגלים בדרך כלל לעורר את הייצור של מספר סוגים של נוגדנים, שכל אחד מהם מזהה אזור קטן ומובחן על פני האנטיגן המכונה אפיטופ. נוגדנים הם חלבונים בצורת Y המיוצרים על ידי לימפוציטים הקושרים אפיטופים בעלי זיקה גבוהה.

נוגדנים הנקשרים לאנטיגן.

אנטיגן עם שלושה אפיטופים שונים על פניו קשור לשלוש מולקולות נוגדנים שונות, שכל אחת מהן קושרת אפיטופ בודד עם זיקה גבוהה.

הזמינות של תאי היברידומה המפרישים כמויות גדולות של נוגדנים עם סגוליות יחידה הקלה מאוד על מחקרים מבניים על נוגדנים. החוקרים מסוגלים לקצור מולקולות נוגדנים המופרשות על ידי תאי היברידומה מתורבתים ולהכין גבישים לדיפרקציה של קרני רנטגן. בהתבסס על מספר רב של מחקרים קריסטלוגרפיים, אנו מבינים כעת את הארכיטקטורה הבסיסית של נוגדנים, המוכרים יותר בשם אימונוגלובינים. מבני הגביש מראים שאימונוגלובינים (Igs) מורכבים משלושה תחומים הנראים בקלות במבנה הגבישי (למטה). שני Fאב אזורים (שברי קושרי אנטיגן) היוצרים את זרועות ה-&ldquoY&rdquo הם אזורים היפר-משתנים המעורבים בקשירת אנטיגן. ה-Fג אזור (שבר מתגבש) המהווה את הבסיס של &ldquoY&rdquo מזוהה על ידי תאי אפקטור לא חיסוניים, כגון תאי פיטום ומקרופאגים, המעבדים קומפלקסים של אנטיגן-נוגדנים. לכל מחלקה Ig יש שרשרת כבדה אופיינית, שנותנת למחלקה את שמה. אנו משתמשים בנוגדנים מקבוצת האימונוגלובינים מסוג IgG, בעלי שרשראות גמא כבדות. (IgGs ידועים גם כגמא גלובולינים.) למולקולות IgA יש שרשראות אלפא, למולקולות IgM יש שרשראות mu וכו'.

מבנה גבישי של נוגדן IgG.

נתון זה נגזר מ-Protein Data Bankentry 1IGT (Harris et al., 1997).


מבוא

נוגדנים טבעיים נוצרים באופן ספונטני ללא חיסון ספציפי, בתנאים נטולי חיידקים. הם מהווים את קו ההגנה הראשון של האורגניזם הנולד [1-10], אם כי הגדרה זו אינה כוללת נוגדנים אנטי-גל ו/או נוגדנים טבעיים נגד גל [11]. הם התגלו לפני כחצי מאה [7, 10]. כבר בשנת 1908, הוענק פרס נובל לפול ארליך, בין היתר, על ההשערה שאורגניזם של אדם בריא יוצר נוגדנים שהם חלק מ-𠇊ll antibodies” [12]. המונח "נוגדנים טבעיים" הוצג לראשונה על ידי בוידן בשנת 1963 [13]. בפולין, בשנות ה-80 חלבונים אלו תוארו [10] כמרכיב חשוב של חסינות, למרות שזה היה רעיון שנוי במחלוקת, למשל, בהקשר של אנטיגנים מלאכותיים. נוגדנים טבעיים הם קו ההגנה הראשון מפני זיהומים לפני יצירת מרכזי נבט שבהם נוצרים נוגדנים אדפטיביים [8, 12, 14]. הם מופיעים בבעלי חוליות רבים, למשל. דו-חיים, זוחלים, דגים, ציפורים ויונקים, כולל בני אדם [8, 15, 16]. בבני אדם הם מורכבים בעיקר מאימונוגלובולין M, אימונוגלובולין A עם איזוטיפים IgA1 ו-IgA2, ו-IgG, בעיקר IgG3, אבל גם IgG1, IgG2 ו-IgG4 [1, 7, 8, 15-17]. נוגדנים טבעיים מסונתזים על ידי תת-אוכלוסיית לימפוציטים מסוג B, בעיקר לימפוציטים מסוג B1 ותאי B באזור השולי [1, 7-9, 12, 14-21]. בעודם מתארים נוגדנים נגד גל ו/או נוגדנים טבעיים נגד גל, חלק מהכותבים [22-24] מציינים שהנוגדנים נוצרים על ידי כ-1% מהלימפוציטים מסוג B במחזור, ושאלה הם IgG, IgM, IgA ו-IgE, המהווים כ-1% מכלל האימונוגלובולינים הקיימים בדם.

בניגוד לנוגדנים אדפטיביים, נוגדנים טבעיים (בעיקר IgMs) מיוצרים לפני החשיפה לאנטיגנים או פתוגנים זרים [25]. בניגוד לנוגדנים טבעיים, נוגדנים אדפטיביים הם ספציפיים לאנטיגן מסוים ומיוצרים על ידי תאי B2, הדורשים את הקישור של האנטיגן לקולטן B-cell (BCR) של לימפוציטים B2 ול- “help” הנוסף של לימפוציטים T [ 25]. בעכברים ובבני אדם, האיזוטופים של נוגדנים טבעיים יוצרים ומחליפים בעיקר לימפוציטים B1 [8]. מספרם פוחת עם הגיל, מה שמוביל לירידה בפוטנציאל האימונולוגי שלהם [8, 14, 16, 21, 26, 27]. ללא קשר לעובדות אלו, נצפה כי ישנם אנשים בריאים שאינם חווים שינויים בריכוז ה-IgM הטבעי, גם כאשר הם מעל גיל 25 [28-30], אך מספר ה-IgG הטבעי בגופם עולה [ 31]. נוגדנים טבעיים נבדלים גם מנוגדנים אדפטיביים בתפקודם [8], אך בדומה לנוגדנים אדפטיביים, הם גם רב-ספציפיים (פוליריאקטיביים) והם מזהים אוטואנטיגנים ודטרמיננטים אנטיגנים חדשים, כולל אלו שנוצרו במהלך אפופטוזיס או תהליכי החמצון [1 , 14]. האוטו-ריאקטיביות של נוגדנים טבעיים מבוססת בעיקר על יכולתם להיקשר לחלקיקים כמו ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (oxLDL) מחומצנים, המתרחשים במהלך טרשת עורקים, חלבוני עמילואיד וטאו, המופיעים במחלות ניווניות, ואנטיגנים NGcGM3 (N-glycolyl). [NGc] מקרופאג גרנולוציטי [GM3]), המלווים ניאופלזמות ממאירות [1, 6, 8, 12, 14, 32-40]. אחד התפקידים החשובים ביותר של נוגדנים טבעיים, כולל נוגדנים אנטי-גל ו/או נוגדנים טבעיים נגד גל, הוא ההגנה מפני פתוגנים ויראליים, חיידקים, פטרייתיים ופתוגנים פרוטוזואים [11]. נוגדנים טבעיים מזהים גם פוספורילכולינים – מרכיב של ממברנות של תאים רבים [14], כולל חיידקים כגון Streptococcus pneumoniae. ההנחה היא שהם מבטיחים הומאוסטזיס ספציפי לאורגניזם [1, 8, 9, 11, 12, 14, 32, 37, 38, 41]. המצב הספציפי הזה של האורגניזם המותנה בנוגדנים טבעיים קשור גם לחיסול מואץ של תאים מתים וגוססים ושאריות קרמים, כולל גורמים שעלולים להוביל לדלקת ולאלמנטים רעילים האחראים ישירות לפגיעה בתאים וברקמות [8, 14 ]. נוגדנים טבעיים קשורים גם למיקרוביום האנושי שכן קיים קשר חשוב בין נוגדנים טבעיים לפלורה הקומנלית של האורגניזם, אשר משפיע מאוד על מגוון הנוגדנים הטבעיים [7, 12, 16, 18, 42-46]. הוכח כי כבר בשלבים המוקדמים של החיים נוצר איזון דינמי מתמיד בין מערכת החיסון של המארח לאנטיגנים של המיקרוביום, עובדה שיש לה השפעה על התפתחות תקינה של מערכת החיסון [12, 18, 45, 46]. מצב זה מותנה בהשתתפותם של קולטנים אוטופוליריאקטיביים של חסינות הומורלית ותאית עם זיקה נמוכה לנוגדנים ולחיידקים הקומנסאליים הללו. מצב זה אומר שלמרות שהנוגדנים מסוגלים לזהות אוטואנטיגנים ומיקרואורגניזמים קומנסאליים, הם לא הורסים אותם [18]. נצפה כי נוגדנים טבעיים המסונתזים על ידי לימפוציטים B1 ולימפוציטים באזור השולי מותנים גם בהשפעת לימפוציטים T, כולל לימפוציטים γδT (בשפע במערכת העיכול), אשר יחד עם ציטוקינים רבים המיוצרים משפיעים על הסינתזה של טבעי. נוגדנים [1, 14]. נצפה כי בעכברים שאינם מחוסנים לימפוציטים γδT משפיעים ביעילות לא רק על מספרי ה-IgA וה-IgG הטבעיים, אלא גם על הספציפיות והרפרטואר של חלבונים אלה [1, 47]. הניתוח הראה שלימפוציטים γδT מווסתים את הפעילות התפקודית של נוגדנים טבעיים על ידי השפעה, בין היתר, על רמת IL-4, ונצפה כי IL-18 מגביר את ייצור SIgM [1, 48]. ההנחה היא שרמת ופעילות הנוגדנים הטבעיים של בני אדם ועכברים מושפעות מהשינויים המתרחשים בלימפוציטים γδT, הנוצרים בעיקר עקב השפעת פלורת המעיים [1], ומהעובדה שהם מספקים ציטוקינים. הם תומכים ומווסתים את התפתחות לימפוציטים מסוג B ומשפיעים על יצירת נוגדנים טבעיים עוד לפני החיסון של האורגניזם [1]. הוכח כי נוגדנים טבעיים הפועלים יחד עם המשלים משמשים כתוספים אנדוגניים בייצור לימפוציטים CD8+, למשל. לאחר חיסון נגד לישמניאזיס [48]. לכן, מוצע [48] כי קומפלקסים אימונולוגיים שנוצרו מנוגדנים טבעיים יכולים להיות הסיבה לעלייה במספר לימפוציטים CD8+ וכי הם עשויים לעורר תאים אלה להפריש IL-4 [48].

מקורם ותפקידם של נוגדנים טבעיים

לימפוציטים B1, שבודדו לאחרונה כתת-אוכלוסיה חדשה של לימפוציטים מסוג B [8, 14, 21], נוצרים בגלים במהלך אונטוגנזה, בעיקר בתקופה העוברית ואחרי העובר. הם אינם נוצרים בשלבים מאוחרים יותר של החיים [14, 21, 49]. לימפוציטים מסוג B1 מתפתחים מחוץ לעובר משק החלמון וה-Para-Aortic splanchnopleura, בתקופה העוברית ממח העצם והכבד, ובשבועות הראשונים לאחר הלידה ממח העצם [21, 49]. בתחילה, התפקוד של לימפוציטים B1 נקבע על בסיס המחקר שבוצע על עכברים, ופרופיל הקולטנים שלהם (CD20 + CD27 + CD43 + CD70 −) נקבע על בסיס ניתוח של דם טבורי ודם היקפי. דם של מבוגרים [8, 12, 14, 50-52]. בעכברים, לימפוציטים B1 ממוקמים בעיקר בחלל הצפק, חלל הצדר, הטחול, מח העצם ובכמויות קטנות בבלוטות הלימפה ובדם [19, 53, 54]. לימפוציטים אלו שונים בגודלם מלימפוציטים רגילים מסוג B2. הם מאופיינים בהישרדות מוגברת ex vivo ועמידות לאפופטוזיס תלויה בקולטני Fas [14, 50, 51]. לימפוציטים B1 מאופיינים בביטוי ייחודי של חלבונים ותעתוק גנים. יש להם גם תכונות איתות שונות, כולל התגובה לפורבול אסטר [14]. הם מאופיינים בריכוז תוך תאי גבוה יותר של Ca 2+, והתפתחותם אינה תלויה בהשפעת הגורם המפעיל של תאי B BAFF/BLys ו-IL-7 [14]. עם זאת, לימפוציטים B1, בדומה ללימפוציטים B2, מאופיינים בתפקוד הבסיסי של לימפוציטים B, כלומר סינתזה של נוגדנים הנחוצים להגנה על האורגניזם מפני פתוגנים [8, 9, 12, 14, 55]. ההנחה היא שהמקורות העיקריים לנוגדנים טבעיים, הן בעכברים והן בבני אדם, הם לימפוציטים B1 ולימפוציטים B של אזור השוליים (MZ), אך גם תת אוכלוסיות אחרות של לימפוציטים מסוג B [1, 7-9, 12, 14-21 ]. ההנחה היא שבשל ההטרוגניות שלהם, לימפוציטים B1 ו-MZ משפיעים על התרחשותם של הבדלים בין הנוגדנים הטבעיים המסונתזים [14]. ההנחה היא ש-80-90% מה-IgMs במנוחה של הסרום ו-50% מה-IgAs בסרום במנוחה (האיזוטיפ העיקרי של אימונוגלובולין מתאי B-1 המתחלף) מיוצרים על ידי תאי B-1 [12, 14, 16]. בעכברים, הוכח גם שנוגדנים טבעיים שונים מנוגדנים אדפטיביים במספר דרכים, כולל תפקודם [14]. נוגדנים טבעיים הם פולי-ריאקטיביים, אוטו-ריאקטיביים, והם מבטאים זיקה אנטי-מיקרוביאלית צנועה יחסית [8, 14, 56, 57]. פולריאקטיביות מבטיחה הטרולוגיה שונה לנוגדן בודד, אם כי זה מותנה גם באנטיגנים משטחים מסודרים באופן נרחב. כתוצאה מכך, הנלהבות שלהם עולה [14]. האופן המיוחד של השינויים הקונפורמטיביים שלהם באזור Fc הופך אותם ליעילים מאוד [14]. ההנחה היא שהנוגדנים הטבעיים הנחקרים ביותר בבני אדם ועכברים הם IgMs. הם מקודדים לקו הנבט ומיוצרים על ידי לימפוציטים B1a (CD5 + ), בעיקר של הטחול, אך גם על ידי לימפוציטים B1 של הצפק ומח העצם [1, 3, 14, 21, 58, 59]. נוגדנים טבעיים חשובים במניעת מחלות, לרבות מחלות אוטואימוניות [14], אשר נצפתה גם ביחס לנוגדנים אנטי-גל ו/או נוגדנים טבעיים אנטי-גל במחלת קרוהן ו-Henoch-Schönlein purpura [22] ]. כמו כן, נקבע שניתן להשתמש בנוגדנים טבעיים בטיפול באנשים מבוגרים [8, 14, 50]. בדוגמאות אחרות, הם משמשים במקרה של מחלות ניווניות הקשורות להצטברות של חלקיקים רעילים ובטיפול בזיהומים חיידקיים [8, 14, 60]. נוֹלָד et al. ואוגורסקי מציעים כי קיומם של נוגדנים טבעיים תוכנת באונטוגנזה באופן שיאפשר ליונקים להתפתח כרגיל על ידי הבטחת כל התפקודים הדרושים והגנה מפני פתוגנים נפוצים בזמן שאין נוגדנים אדפטיביים [1, 10] . מצב כזה משפיע על הומאוסטזיס רקמות ואיזון אימונולוגי חשוב במקרה של מחלות זיהומיות והגנה נגד סרטן [1, 7, 8, 12, 14, 32, 37-39]. נוצר במהלך זיהום, המצב מושפע מהעובדה שחשוב מכך, המרכיב העיקרי של נוגדנים טבעיים מזהה פוספורילכולינים (PC), שהם מרכיב מפתח של קרומי התא של חיידקים גראם חיוביים וגראם שליליים, כמו גם פרוטוזואה. ופטריות [ז, 14, 48]. כיום מוצע כי נוגדנים טבעיים מזהים גם את ה-PC של ממברנות של תאים אפופטוטיים ושומנים מחומצנים [5, 7, 14, 61-65]. הכרה כזו של אנטיגנים על ידי נוגדנים טבעיים, בעיקר תאים אפופטוטיים, מותנית באלמנט האחר שלהם – phosphatidylcholines (PtC) – – שהם מרכיב מפתח של ממברנות אריתרוציטים מזדקנות (אפופטוטיות) הנמצאות אצל קשישים [14, 66]. הכרה ספציפית זו של תאים אפופטוטיים על ידי נוגדנים טבעיים עלולה להוביל גם להפעלה מוגזמת של מערכת החיסון ולדלקת כרונית [7]. מצד שני, השתתפות של נוגדנים טבעיים בסילוק תאים אפופטוטיים מובילה לירידה בדלקת [7, 67]. נוגדנים טבעיים מזהים גם ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה, ומגנים על האורגניזם מפני טרשת עורקים מכיוון ש-oxLDL מוביל להיווצרות רובד טרשתי, דלקת וכתוצאה מכך למחלות לב וכלי דם. יתר על כן, נוגדנים טבעיים נקשרים לצורה העיקרית המחומצנת של ליפופרוטאינים – apolipoprotein B100 [8, 14, 38]. נוגדנים אלו משתתפים גם במניעת גידולים [8, 68]. על ידי קשירה עם אנטיגן הגידול NGcGM3 – הקיים, למשל. במהלך סרטן ריאות – הם עלולים להוביל לחיסול תאים סרטניים. הקישור עם אנטיגן גידול מתקדם באמצעות מנגנון התלוי במשלים ו/או מנגנון דמוי אונקוזה התלוי במשלים [8, 33, 48, 68, 69]. השתתפותם של נוגדנים טבעיים נצפתה גם בתגובות עם אנטיגן הגידול Thomsen-Friedenreich [1, 32, 70], הגנגליוזיד של נוירונים בתסמונת Guillain-Barré [1, 71] והעמילואיד הקיים במחלת האלצהיימר [1, 8, 26, 39, 72]. מוצע כי, בשל מערך הפונקציות הזה, נוגדנים טבעיים עשויים לשמש גם כסמנים ביולוגיים במחקרים הקליניים של מצבים אלה [12, 14, 63]. מקובל שהשכיחות המוגברת של מחלות רבות, כולל המחלות השכיחות בקרב אנשים מבוגרים, קשורה לירידה במספר הנוגדנים [8, 14, 26, 48]. לכן, לעתים קרובות יותר ויותר, על מנת לטפל במצבים אלו, מומלץ להשתמש באימונוגלובולינים תוך ורידי (IVIG) הבנויים בעיקר מ-IgGs, כולל IgGs טבעיים, וכמויות עקבות של נוגדנים טבעיים רב-שבטיים – IgMs ו-IgAs [1 , 7, 12, 35, 39, 41, 73-78]. הוכח שטיפול באמצעות IVIG יעיל מאוד בחולים עם מחלות אוטואימוניות ותסמונת תגובה דלקתית מערכתית (SIRS) [79]. נכון להיום, בשל התכונות של נוגדנים טבעיים, בעיקר IgMs, ישנם ניסיונות להשתמש בנוגדנים אלו יחד עם IgAs ב-IVIG, מה שאמור להגביר את היכולות האנטי דלקתיות של התכשיר [79].

המאפיינים והתפקיד של נוגדנים טבעיים מסוג IgM

האימונוגלובולינים מסוג M הם הנוגדנים הטבעיים הנחקרים ביותר. הם מופיעים בדרך כלל אצל אנשים בריאים ומיוצגים היטב במחזור הדם לאחר הלידה [12, 48, 80]. הנוגדנים של מחלקה זו הם אחד האימונוגלובולינים העיקריים באורגניזם, והם המוקדמים ביותר להיווצר מכל הנוגדנים במהלך האנטוגנזה [55]. הן בבני אדם והן בבעלי חיים, הם מציגים כמויות גדולות של SIgM (300-800 μg/ml עבור עכברים ו-400-2300 μg/ml עבור בני אדם) [81]. רוב ה-IgMs הטבעיים נוצרים על ידי לימפוציטים B1, אך גם על ידי לימפוציטים B של האזור השולי של הטחול [3, 7, 12, 14, 16, 21, 58, 59, 80, 82, 83]. נוגדנים אלו מהווים כנראה כ-80% מכלל ה-IgMs שמסתובבים בגוף [12, 16, 21] וללא קשר לתפקודם האימונולוגי [14, 48, 55] יש להם גם השפעה על התפתחות לימפוציטים מסוג B [1]. בעכברים ובבני אדם, IgMs מקודדים בעיקר בקו הנבט, והם נוצרים על ידי לימפוציטים B1a (CD5 + ) [1, 21]. עם זאת, ישנם נתונים רבים המצביעים על כך שמלבד לימפוציטים B1a (CD5 + ), לימפוציטים B1b (CD5 - ) אחראים גם לסינתזה של IgMs [21]. הייצור של IgMs טבעי עשוי להיות מוגבר גם באמצעות הפעלה של LPS/TLR או על ידי הפעלה של קולטני תאי B על ידי פתוגנים [16, 48]. כמו כן, נצפה [55] כי IgMs טבעיים עוברים ביטוי בתאי אפיתל המוגרים על ידי אגוניסט TLR9, ובשל עובדה זו ההנחה היא שתאים אלו הם גם מקור חשוב ל-IgM טבעי. בדומה ל-IgMs אדפטיביים, נוגדנים טבעיים ממחלקת M הם מולקולות פנטאמריות. עם זאת, בחולים הסובלים ממחלות אוטואימוניות [84] ומחלות כבד כרוניות, IgMs טבעיים עשויים להופיע בעיקר בצורה מונומרית [85]. ל-IgMs טבעי יש קולטן Fc ספציפי ל-IgMs (FCMR), שהוא חלבון טרנסממברני עם מסת החלקיקים של כ-41 kDa. עם זאת, לאחר תהליך O-glycosylation בתחום החוץ-תאי, מסת החלבון עשויה לעלות ל-60 kDa [81]. הקולטן עובר ביטוי גם בתאי מערכת חיסון רבים, כולל לימפוציטים B CD19+, לימפוציטים T CD4+/CD8+ ותאי NK CD56+/CD3- [86]. באופן בולט יותר, הוא עובר ביטוי יתר במקרה של לוקמיה לימפוציטית כרונית ובשל כך הוא עשוי לשמש כסמן ספציפי למחלה זו [86]. IgM טבעי רב ערכי עם 10 אתרי קישור לאנטיגנים מזהים מבנים רבים, כולל חלבונים, פחמימות, פוספוליפידים וחומצות גרעין. הם משתתפים בזיהוי תאים אפופטוטיים הודות לשינויים להם נתונה קרום התאים. אחד מהשינויים הללו הוא חמצון, שעשוי לאפשר את ההכרה של קבוצת השומנים העיקרית של פוספורילכולין [5, 12, 48, 64, 82, 87]. התפקיד שממלאים IgMs טבעיים בתהליך הפגוציטוזיס של תאים אפופטוטיים מוביל לאישור ההשפעה האנטי דלקתית שלהם. תכונה זו אושרה בעכברים עם מחסור של נוגדנים טבעיים מסוג M. במקרה זה, הוכחו התכונות האנטי-דלקתיות הפוטנציאליות של IgMs ביחס לממברנות של תאים אפופטוטיים [2, 12, 87]. יש להוסיף שפינוי תאים אפופטוטיים קשור לא רק להסרת גופים תאיים, אלא גם להגנה מפני גורמים שעלולים להזיק, כלומר חלבון הקופסה 1 (HMGB – 1) וחום בעל ניידות גבוהה. חלבוני הלם (HSP) [12] – האלמנטים היוצרים גורמי סיכון – DAMP (דפוסים מולקולריים הקשורים לנזק) [88]. בַּמַבחֵנָה מחקר הראה שהתכונות האנטי-אפופטוטיות של IgMs טבעיות ביחס לדטרמיננט ה-PC מעכבות את הביטוי של ציטוקינים באמצעות קולטנים דמויי אגרה (TLR) והפעלה של קינאזות חלבון המופעלות על ידי מיטוגן, שהם אלמנטים של חסינות התא המולד. [2, 12]. IgMs טבעיים עשויים גם לגרום למסלולי אותות אנטי דלקתיים ספציפיים, התלויים בהשראת חלבון קינאז פוספטאז 1 (הידוע גם כ-MKP-1 או DUSP-1) המופעל על ידי phosphatase mitogenepressive בתאים דנדריטים שמקורם במח העצם [5] , יב, 64]. נכון לעכשיו, ההנחה היא שהסרת גופים אפופטוטיים מהאורגניזם קשורה לתפקוד של SIgM, שתפקודו תלוי במספר אלמנטים של מערכת החיסון, כולל הקולטן IgM Fcα/μR והמשלים רכיב C1q [7, 58, 80, 89]. יתרה מכך, תהליך זה קשור גם ל-IgMs טבעיים, מכיוון שנוגדנים אלו מתחברים עם הרכיב המשלים C1q, מה שמוביל למצב בו גופים אפופטוטיים מופנים לכיוון מקרופאגים [7, 58, 80, 89], המשמידים אותם בתהליך של efferocytosis [90-92]. לכן, הודות לפוליריאקטיביות כזו, הם מחזקים את היעילות נגד זיהום על ידי שימוש בפאגוציטוזה ותהליכים אחרים [3, 5, 64, 80, 93]. הפעלה של מפל המשלים, על ידי לקטין הקושר מנוז או על ידי מרכיב של המשלים C1q, עשויה להתרחש גם כאשר היעדים של IgMs טבעיים הם האפיטופים PC של תאים אפופטוטיים [2, 3, 5, 9, 12, 48, 64]. הוכח כי הסרום של יילודים מאופיין בתגובתיות גבוהה של IgMs טבעיים כלפי אנטיגנים עצמיים רבים, חלקיקי ssDNA ו-LDL ויראליים [6, 12, 35, 36, 94], אנטיגנים חיידקיים נפוצים, פוספוליפידים וכמה חלבוני קרום התא. [1, 9, 21, 94]. מחקרים רבים מראים שניתן לחסום מחלות אוטואימוניות על ידי נוגדנים עצמיים טבעיים של איזוטיפ IgM המסווים את האנטיגנים שמקורם בלימפוציטים אוטואימוניים מסוג T פתוגניים [6]. בעכברים שנשללה מהם היכולת ליצור SIgM, נצפה שבעלי החיים היו בעלי נטייה לפתח נוגדנים עצמיים מסוג IgG “pathogenic” ואוטואימוניות דמוית לופוס [12, 95, 96]. לכן, המסקנה היא ש-IgM טבעיים מגנים על האורגניזם מפני מחלות אוטואימוניות [12], ומאפיין מגן זה של IgM נכון גם למחלות של מערכת הלב וכלי הדם. [יב, 15, 21]. IgMs טבעיים עשויים להשתתף בעיכוב המשוב של התמיינות תאי B1 [97]. פונקציה זו של IgM נצפתה בעכברים עם מחסור של IgM מופרש ובאלה עם FcμR לא מספיק [97-99]. נצפה שמספר הלימפוציטים B1 ב-MZ של הטחול עלה באופן משמעותי בעכברים עם IgM לא מספיק, בעוד שריכוז ה-IgM עלה בבעלי חיים עם מחסור של FcμR. תופעה זו עשויה להצביע על כך שרמת ה-IgMs הטבעית שומרת על הומאוסטזיס של תאי B באמצעות קישור FcμR [97-99]. ההשתתפות של IgM בהגנה מפני טרשת עורקים אושרה על ידי מחקר על עכברים. במקרה זה, IgMs טבעיים כנראה הסירו ליפופרוטאינים מחומצנים בצפיפות נמוכה ושומנים “pathogenic” [12, 34, 38, 40]. יתר על כן, IgMs טבעי מעכבים התקדמות של שינויים טרשת עורקים במקרים של היפרכולסטרולמיה בעכברים הסובלים ממחסור באפוליפופרוטאין E (ApoE) [12, 100]. תפקידם המגן נרשם גם בחולים הסובלים מהמוליזה ובאלה עם תסמונות כלילית חריפות. נצפה שכאשר רמת ה-IgM הטבעית בחולים אלו הייתה נמוכה, שיעור התמותה עלה [12, 63, 101]. בשל עובדה זו, ההנחה היא שריכוז גבוה של נוגדנים אלו מקטין את הסיכון למחלות לב וכלי דם, כגון אוטם שריר הלב (התקף לב) ושבץ מוחי [5, 12, 37, 64]. ההנחה היא ש-IgM טבעי יכול לשמש סמנים במחקרים המאפשרים לקבוע את התרחשותן של מחלות אלו, בעיקר הפרעות הקשורות לטרשת עורקים [12]. בעכברים, נקבע כי IgMs טבעיים הם גם מרכיב בסיסי המהווה את המחסום המגן מפני מיקרואורגניזמים מכיוון שהפחתה של IgMs מובילה לזיהום בבעלי חיים אלה [7, 12]. הוכח שהנוגדן מסוג IgM יכול גם להגיב בצלב עם אפיטופים הקשורים לחיידקים הפתוגנים Porphyromonas gingivalis, אשר אחראים לדלקת בחלל הפה [12, 102]. נוגדן זה מגן גם על האורגניזם האנושי מפני זיהום עם Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae וירוס השפעת [1]. עלייה ברמות שלהם נצפית גם במהלך זיהומים שנגרמו על ידי דלקת ריאות מיקופלזמה ו-Epstein-Barr virus [103-105]. נוגדנים טבעיים אלה תומכים גם בחסינות המארח לזיהומים עם Pneumocystis פטרייה [106]. נצפה כי יש להם גם השפעה על זיהוי האנטיגנים של סוג זה של פטריות באמצעות תאים דנדריטים, מה שמגביר את נדידתם לבלוטות הלימפה וגורם להתמיינות אינטנסיבית של תאי Th2 ו-Th17 במהלך הדבקה בפתוגן זה [106]. לפיכך, ניתן להניח ש-IgM טבעי אחראי על תהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל הומאוסטזיס של רקמות, אפנון התגובה האימונולוגית ופינוי אפופטוטי של תאים [12, 14, 21, 48]. סביר להניח שנוגדנים אלו מהווים גורם חשוב המאפשר לשרוד את מצבי הדלקת הכרונית [12], אך, יחד עם זאת, הם מחזקים את המצב הדלקתי על ידי הגברת ההפרשה של, למשל. גבישים של חומצת שתן, המגבירים את הדלקת על ידי גיוס נויטרופילים [101]. כפי שהוזכר לעיל, IgMs טבעיים מגנים על בני אדם מפני מחלות אוטואימוניות [12], ככל הנראה כולל זאבת אריתמטוזוס מערכתית. הם גם אחראים למניעת מחלות לב וכלי דם, כולל טרשת עורקים [5, 7, 12, 21, 37], ומחלות זקנה [14].

המאפיינים והתפקיד של נוגדנים טבעיים ממחלקת IgG ו-IgA

במונחים של נוגדנים טבעיים, מלבד ה-IgM הידוע ברבים, ישנם גם IgAs ו-IgGs טבעיים [8, 12, 17, 45, 46]. IgGs טבעיים מחולקים עוד לתת-מחלקות IgG1, IgG2, IgG4 והרמה הגבוהה ביותר של IgG3 [1, 7, 8, 16, 17]. נוגדני IgG הם האיזוטיפים היחידים שיכולים לעבור את המחסום של השליה על מנת להבטיח חסינות עוברית [7, 9, 19]. IgG נוצרים על ידי תת-אוכלוסיות שונות של לימפוציטים מסוג B, ויש להניח [1, 7-9, 12, 14-21] שלימפוציטים B1 ולימפוציטים B של טחול MZ אחראים בעיקר לביטוי של IgG2 [7, 8, 12 ,16]. גם IgGs וגם IgMs טבעיים נקשרים לאותם אנטיגנים שנשמרו פילוגנטית ובעכברים נמצאו כ-15-20% מה-IgG כפולריאקטיביים, בדומה ל-IgAs [16]. בניגוד ל-IgMs, IgGs טבעיים אינם פעילים לאחר הלידה. בעכברים, הוכח שלימפוציטים B מתחילים בייצור של IgG לאחר חשיפה לחיידקי מעיים או אנטיגנים זרים [7, 8, 12, 16, 42, 73]. דווח כי בבני אדם יכול לקחת גם שנתיים עד שריכוז ה-IgG הטבעי בסרום הופך גבוה מספיק כדי להיות מורגש [107]. כמו כן, מוצע שלימפוציטים מסוג T עשויים להפעיל לימפוציטים מסוג B כדי לייצר IgG טבעי במבוגרים [16]. נצפה כי רמת ה-polyreactive anti-dsDNA IgGs עולה לאחר זיהומים שונים וכי אותם anti-dsDNA IgGs מגיבים בצלב עם האנטיגנים של מיקרואורגניזמים, כולל חיידקים [16, 43, 108]. התפקיד הפוטנציאלי של IgG טבעי בשליטה בדלקת הוכח, בהתבסס על קומפלקס שנוצר במצבים המוליטיים, בין נוגדני IgG והמוגלובין [7]. זה הוצג בַּמַבחֵנָה [7] ש-IgG טבעיים מטוהרים שמקורם בסרום של אנשים בריאים מזהים חיידקים גראם חיוביים וגראם שליליים באמצעות קולטני זיהוי דפוסים (PRRs), כגון פיקולין או לקטין קושר מנוז (MBL). ידוע כי על ידי קשירה לשאריות פוליסכרידים על מיקרואורגניזמים, לקטין מסוג C גורם להיווצרות קומפלקס הכולל IgGs ולקטין טבעיים, מחזק את תהליך הפגוציטוזיס של חיידקים באמצעות FcγR1 של, למשל. מונוציטים [17]. מנגנונים אלה בתיווך אינטראקציה PRR:PRR מעוררים תגובות אימונולוגיות חזקות אף יותר [7]. במקרה זה, מתרחשת אינטראקציה בין IgG לפיקולין, המגבירה את הפאגוציטוזיס שהוזכרה לעיל [7, 17, 109]. מעניין לציין שהקומפלקס האופייני של IgG-ficolin מתרחש הן בבני אדם והן בעכברים, מה שמוכיח את החשיבות הבסיסית של IgGs בהגנה האימונולוגית של האורגניזם [7, 76]. גם IgGs טבעיים וגם IgGs אדפטיביים מגיבים עם PRRs דרך אזור C של שרשרת H, מה שמעיד על כך ש-Fc חשוב בהעברת מידע הגנה מארח, ללא קשר למקור ולספציפיות של IgGs [7]. IgGs טבעיים גם משתפים פעולה באופן ספציפי עם לקטין במאבק נגד זיהומים הנגרמים על ידי Pseudomonas aeruginosa ו Staphylococcus aureus [7, 17]. ה-IgGs האנטי-PC האנושיים מייצגים בעיקר את תת-המעמד IgG2, ואילו האנטי-MDA (מלונדאלדהיד) מייצגים תת-מעמדות של IgG1 או IgG3, שלאחרונים יש פוטנציאל גבוה יותר לכלול את מפל המשלים ולעסוק בהפעלה של קולטן האימונוגלובולין Fc [5, 7, 12, 64]. It was observed that anti-MDA IgGs do not show high expression apart from in patients with inflammatory diseases [5, 12, 64], and that anti-PC IgGs are present even in healthy people [12]. Therefore, it is assumed that these natural IgGs participate in both the regulation of inflammatory states and in the protection of the organism against pathogens, fulfilling the role of innate immunity [7].

On the other hand, natural IgAs are a group of immunoglobulins consisting of two subclasses, IgA1 and IgA2, which are present in mucosal surfaces [8, 12, 14]. In their case, it has been demonstrated [7] that a percentage of natural IgAs are formed by B1 lymphocytes at the newborn stage [7, 12, 44-46] and that, together with natural IgMs, they recognise autoantigens and bind with homologous molecules produced by different microbes [12]. It was observed that natural IgAs along with natural IgMs are important factors responsible for a variety of microbes which settle in the human intestine – the microbiome [12, 45, 46]. It has been shown that the isotypes of IgA inhibit inflammation by participating in it via a reaction with the Fc type 1 receptor (FcαR1/CD89), but the manner in which they take part in this process is a matter of debate [7]. The regulating role of natural IgAs has also been demonstrated in patients who suffered from a selective deficiency of IgAs, when the concentration of both IgA1 and IgA2 was significantly decreased or totally absent but, at the same time, the concentration of IgMs and IgGs remained normal [78]. In such a case, apart from a higher frequency of occurrence of infections in the respiratory tract and digestive tract, the patient was more susceptible to autoimmune disorders, allergy-related illnesses, haematological diseases, arthritis, chronic liver inflammation, ulcerative colitis and Crohn’s disease.


Advantages and Disadvantages of Using Polyclonal Antibodies

  • Production is quicker
  • It is inexpensive
  • Tolerant of minor changes of antigen. Polyclonal antibodies are less sensitive to antigen changes than monoclonal antibodies.
  • Have a choice of producing antibodies in different animals.
  • Chances of getting a better response to the antigen are increased, and can be tried with various animal sources as the secondary antibody produced recognizes different epitopes on the same antigen.
  • Moderately easy to purify while using the high-affinity chromatography methods.

חסרונות

  • An amplified chance for cross-reaction and false positives.
  • Non-specific interaction with the considerable antigen heterogeneity within the antibody pool.
  • The life span of the host animal is limited.
  • Multiple epitopes make it essential to check the immunogen sequence for any cross-reactivity.
  • Multiple animals have to be immunized against the same antigen.
  • Antibody response depends on the host animal.
  • Sometimes requires multiple control samples to arrive at meaningful conclusions.

Applications of Polyclonal Antibodies

Polyclonal antibodies are a mixture of heterogeneous products produced by different B cell clones. They can recognize and bind to many different epitopes of a single antigen. Polyclonal antibodies are produced by injecting an immunogen into an animal.

After being injected with a specific antigen to elicit a primary immune response, the animal is given a secondary even tertiary immunization to produce higher titers of antibodies against the particular antigen. After immunization, polyclonal antibodies can be obtained straight from the serum or purified to get a free solution from other serum proteins.

The ability of antibodies to selectively bind a specific epitope present on a chemical, carbohydrate, protein or nucleic acid has been thoroughly exploited through the years, as evidenced by the broad spectrum of research and clinical applications in which they are utilized. Applications include simple qualitative and quantitative analyses to ascertain the following:

  • Whether an epitope is present within a solution, cell, tissue, or organism, and if so, where
  • Methods to facilitate purification of an antigen, antigen-associated molecules, or cells expressing an antigen and
  • Techniques that use antibodies bind to mediate and modulate physiological effects for research, diagnostic, or therapeutic purposes.

The applications listed in Table 1 are by no means exhaustive. Still, they illustrate that the versatility of an antibody-x2y is frequently limited only by the user’s imagination and determination.

מַטָרָהApplications relative to antigen
SolubilizedIntact tissues/cellsאורגניזם
Analysis (qualitative or quantitative)Immunoblot (כתם מערבי)FACS b analysisImmunoimaging (SPECT b and PET b)
משקעים אימוניים
Proteomics/antibody microarraySandwich ELISAImmunofluorescence
Proteomics/antibody microarrayImmunohistochemistry
קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן
Purification and/or enrichmentImmunoaffinity purificationFACS and MACS
Mediation and/or modulationCatalysis-abzymesNeutralize activityNeutralize activity
Activate signalingDeplete cell types to alter phenotype
Proteomics/intrabodiesאימונותרפיה

A particular rundown of applications in which polyclonal antibodies(PAbs), monoclonal antibodies (MAbs), their pieces and forms, either play a fundamental part or have had a massive effect in the essential exploration process. With the exception of imaging, immunotherapy, immunohistochemistry, and x-ray crystallography, regardless of whether to utilize PAb or MAb, relies upon the setting wherein the application is being utilized and the staff’s specialized capacities using them.

ELISA, protein connected immunosorbent examine ELISPOT, compound connected immunospot test FACS, fluorescence-enacted cell checking MACS, attractive actuated cell arranging PET, positron discharge tomography SPECT, single-photon outflow automated tomography.

To know more about the comprehensive range of polyclonal and monoclonal antibodies, contact Helvetica Health Care today!!


Autoantibodies

Circulating antibodies elicited by the patient’s own immune system after exposure to cancer proteins are emerging as promising biomarkers for the early detection of cancer. An advantage of autoantibodies as biomarkers is their production in large quantities despite the presence of a relatively small amount of corresponding antigen. Autoantibodies are also expected to have persistent concentrations and long half-lives due to limited proteolysis and clearance. The immune system constantly monitors the body for the invasion of microorganisms and foreign molecules. A tightly regulated network of antibodies, T-lymphocytes, antigen-presenting cells, cytokines, and microenvironment signals secures the development of an appropriately targeted immune response to combat infections. Foreign extracellular and surface antigens are recognized by B-lymphocytes, which respond by secreting antibodies. To mount a sustained antibody response, B cells require an additional signal from T helper cells, which present the relevant antigen as peptide fragments 15–25 amino acids in length that are in complex with major histocompatibility complex (MHC) class II. Antigens can also stimulate CD8+ T lymphocytes. These cells are activated by intracellular and membrane proteins that are processed by the endogenous processing pathway and presented as peptides 8–10 amino acids in complex with MHC class I. The 2 systems are highly coordinated, and in most cases, high affinity immunoglobulin G (IgG) antibody responses require recognition of the antigen by both B and T lymphocytes. During the initial development of the immune system, more than half of the newly generated B cell receptors are estimated to be capable of binding autoantigens. Most autoreactive B cells are eliminated during B cell maturation, however, preventing mature B cells from reacting with self-molecules. This selection provides the basis for the development of self-tolerance, the ability of the immune system to recognize and ignore the body’s own cells and tissues. Sometimes this mechanism fails and the immune system reacts with one’s own antigens as a consequence of over-expression, mutations, changes in protein half-lives, misfolding, aberrant degradation of self-proteins, or altered post-translational modifications (eg, glycosylation and phosphorylation) of the protein. Autoantibodies have long been recognized in autoimmune diseases, including systemic lupus erythematosus, myasthenia gravis, and rheumatoid arthritis. In some of the diseases, autoantibodies play a central role in its pathogenesis (eg, myasthenia gravis), whereas their role in others is less clear. Nevertheless, the existence and detection of autoantibodies is an important element in establishing an accurate diagnosis. In rheumatoid arthritis, for example, the test for an anti-IgG antibody, also known as the rheumatoid factor, is useful and has a sensitivity of approximately 80%.


Immunoglobulins-Antigen-Antibody reactions and Selected Tests

The combining site of an antibody is located in the Fab portion of the molecule and is constructed from the hypervariable regions of the heavy and light chains. X-Ray crystallography studies of antigen-antibody interactions show that the antigenic determinant nestles in a cleft formed by the combining site of the antibody as illustrated in Figure 1. Thus, our concept of antigen-antibody reactions is one of a key (i.e. the antigen) which fits into a lock (i.e. the antibody).

Non-covalent Bonds

The bonds that hold the antigen to the antibody combining site are all non-covalent in nature. These include hydrogen bonds, electrostatic bonds, Van der Waals forces and hydrophobic bonds. Multiple bonding between the antigen and the antibody ensures that the antigen will be bound tightly to the antibody.

Since antigen-antibody reactions occur via non-covalent bonds, they are by their nature reversible.

Antibody affinity is the strength of the reaction between a single antigenic determinant and a single combining site on the antibody. It is the sum of the attractive and repulsive forces operating between the antigenic determinant and the combining site of the antibody as illustrated in Figure 2.

Affinity is the equilibrium constant that describes the antigen-antibody reaction as illustrated in Figure 3.

Avidity is a measure of the overall strength of binding of an antigen with many antigenic determinants and multivalent antibodies. Avidity is influenced by both the valence of the antibody and the valence of the antigen. Avidity is more than the sum of the individual affinities. This is illustrated in Figure 4.

To repeat, affinity refers to the strength of binding between a single antigenic determinant and an individual antibody combining site whereas avidity refers to the overall strength of binding between multivalent antigens and antibodies.

SPECIFICITY AND CROSS REACTIVITY

Specificity refers to the ability of an individual antibody combining site to react with only one antigenic determinant or the ability of a population of antibody molecules to react with only one antigen. In general, there is a high degree of specificity in antigen-antibody reactions. Antibodies can distinguish differences in:

The primary structure of an antigen

Isomeric forms of an antigen

Secondary and tertiary structure of an antigen

Cross reactivity refers to the ability of an individual antibody combining site to react with more than one antigenic determinant or the ability of a population of antibody molecules to react with more than one antigen.

Factors affecting measurement of antigen-antibody reactions

The only way that one knows that an antigen-antibody reaction has occurred is to have some means of directly or indirectly detecting the complexes formed between the antigen and antibody. The ease with which one can detect antigen-antibody reactions will depend on a number of factors.

Affinity
The higher the affinity of the antibody for the antigen, the more stable will be the interaction. Thus, the ease with which one can detect the interaction is enhanced.

Avidity
Reactions between multivalent antigens and multivalent antibodies are more stable and thus easier to detect.

Physical form of the antigen
The physical form of the antigen influences how one detects its reaction with an antibody. If the antigen is a particulate, one generally looks for agglutination of the antigen by the antibody. If the antigen is soluble one generally looks for the precipitation of the antigen after the production of large insoluble antigen-antibody complexes.


Agglutination Tests

Agglutination/Hemagglutination
When the antigen is particulate, the reaction of an antibody with the antigen can be detected by agglutination (clumping) of the antigen. The general term agglutinin is used to describe antibodies that agglutinate particulate antigens. When the antigen is an erythrocyte the term hemagglutination is used. All antibodies can theoretically agglutinate particulate antigens but IgM, due to its high valence, is particularly good agglutinin and one sometimes infers that an antibody may be of the IgM class if it is a good agglutinating antibody.

Qualitative agglutination test
Agglutination tests can be used in a qualitative manner to assay for the presence of an antigen or an antibody. The antibody is mixed with the particulate antigen and a positive test is indicated by the agglutination of the particulate antigen. (איור 7).

For example, a patient’s red blood cells can be mixed with antibody to a blood group antigen to determine a person’s blood type. In a second example, a patient’s serum is mixed with red blood cells of a known blood type to assay for the presence of antibodies to that blood type in the patient’s serum.
Quantitative agglutination test
Agglutination tests can also be used to measure the level of antibodies to particulate antigens. In this test, serial dilutions are made of a sample to be tested for antibody and then a fixed number of red blood cells or bacteria or other such particulate antigen is added. Then the maximum dilution that gives agglutination is determined. The maximum dilution that gives visible agglutination is called the titer. The results are reported as the reciprocal of the maximal dilution that gives visible agglutination. Figure 8 illustrates a quantitative hemagglutination test.

Prozone effect – Occasionally, it is observed that when the concentration of antibody is high (i.e. lower dilutions), there is no agglutination and then, as the sample is diluted, agglutination occurs (See Patient 6 in Figure 8). The lack of agglutination at high concentrations of antibodies is called the prozone effect. Lack of agglutination in the prozone is due to antibody excess resulting in very small complexes that do not clump to form visible agglutination.

Applications of agglutination tests

אני. Determination of blood types or antibodies to blood group antigens.

ii. To assess bacterial infections

לְמָשָׁל A rise in titer of an antibody to a particular bacterium indicates an infection with that bacterial type. נ.ב. a fourfold rise in titer is generally taken as a significant rise in antibody titer.

Practical considerations
Although the test is easy to perform, it is only semi-quantitative.

Direct Coomb’s Test
When antibodies bind to erythrocytes, they do not always result in agglutination. This can result from the antigen/antibody ratio being in antigen excess or antibody excess or in some cases electrical charges on the red blood cells preventing the effective cross linking of the cells. These antibodies that bind to but do not cause agglutination of red blood cells are sometimes referred to as incomplete antibodies. In no way is this meant to indicate that the antibodies are different in their structure, although this was once thought to be the case. Rather, it is a functional definition only. In order to detect the presence of non-agglutinating antibodies on red blood cells, one simply adds a second antibody directed against the immunoglobulin (antibody) coating the red cells. This anti-immunoglobulin can now cross link the red blood cells and result in agglutination. This test is illustrated in Figure 10 and is known as the Direct Coomb’s test.

יישומים
These include detection of anti-rhesus factor (Rh) antibodies. Antibodies to the Rh factor generally do not agglutinate red blood cells. Thus, red cells from Rh+ children born to Rh- mothers, who have anti-Rh antibodies, may be coated with these antibodies. To check for this, a direct Coombs test is performed. To see if the mother has anti-Rh antibodies in her serum an Indirect Coombs test is performed.
Hemagglutination Inhibition
The agglutination test can be modified to be used for the measurement of soluble antigens. This test is called hemagglutination inhibition. It is called hemagglutination inhibition because one measures the ability of soluble antigen to inhibit the agglutination of antigen-coated red blood cells by antibodies. In this test, a fixed amount of antibodies to the antigen in question is mixed with a fixed amount of red blood cells coated with the antigen (see passive hemagglutination above). Also included in the mixture are different amounts of the sample to be analyzed for the presence of the antigen. If the sample contains the antigen, the soluble antigen will compete with the antigen coated on the red blood cells for binding to the antibodies, thereby inhibiting the agglutination of the red blood cells. as illustrated in Figure 12.

By serially diluting the sample, you can quantitate the amount of antigen in your unknown sample by its titer. This test is generally used to quantitate soluble antigens and is subject to the same practical considerations as the agglutination test.


Precipitation tests

Radial Immunodiffusion (Mancini)
In radial immunodiffusion antibody is incorporated into the agar gel as it is poured and different dilutions of the antigen are placed in holes punched into the agar. As the antigen diffuses into the gel, it reacts with the antibody and when the equivalence point is reached a ring of precipitation is formed as illustrated in Figure 13.


The diameter of the ring is proportional to the log of the concentration of antigen since the amount of antibody is constant. Thus, by running different concentrations of a standard antigen one can generate a standard cure from which one can quantitate the amount of an antigen in an unknown sample. Thus, this is a quantitative test. If more than one ring appears in the test, more than one antigen/antibody reaction has occurred. This could be due to a mixture of antigens or antibodies. This test is commonly used in the clinical laboratory for the determination of immunoglobulin levels in patient samples.
Immunoelectrophoresis
In immunoelectrophoresis, a complex mixture of antigens is placed in a well punched out of an agar gel and the antigens are electrophoresed so that the antigen are separated according to their charge. After electrophoresis, a trough is cut in the gel and antibodies are added. As the antibodies diffuse into the agar, precipitin lines are produced in the equivalence zone when an antigen/antibody reaction occurs as illustrated in Figure 14.


This tests is used for the qualitative analysis of complex mixtures of antigens, although a crude measure of quantity (thickness of the line) can be obtained. This test is commonly used for the analysis of components in a patient’ serum. Serum is placed in the well and antibody to whole serum in the trough. By comparisons to normal serum, one can determine whether there are deficiencies on one or more serum components or whether there is an overabundance of some serum component (thickness of the line). This test can also be used to evaluate purity of isolated serum proteins.
Countercurrent electrophoresis
In this test the antigen and antibody are placed in wells punched out of an agar gel and the antigen and antibody are electrophoresed into each other where they form a precipitation line as illustrated in Figure 15. This test only works if conditions can be found where the antigen and antibody have opposite charges. This test is primarily qualitative, although from the thickness of the band you can get some measure of quantity. Its major advantage is its speed.


Radioimmunoassay (RIA)/Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Radioimmunoassays (RIA) are assays that are based on the measurement of radioactivity associated with immune complexes. In any particular test, the label may be on either the antigen or the antibody. Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) are those that are based on the measurement of an enzymatic reaction associated with immune complexes. In any particular assay, the enzyme may be linked to either the antigen or the antibody.

Competitive RIA/ELISA for Ag Detection
The method and principle of RIA and ELISA for the measurement of antigen is shown in Figure 16. By using known amounts of a standard unlabeled antigen, one can generate a standard curve relating radioactivity (cpm) (Enzyme) bound versus amount of antigen. From this standard curve, one can determine the amount of an antigen in an unknown sample.

The key to the assay is the separation of the immune complexes from the remainder of the components. This has been accomplished in many different ways and serves as the basis for the names given to the assay:

Precipitation with ammonium sulphate
Ammonium sulphate (33 – 50% final concentration) will precipitate immunoglobulins but not many antigens. Thus, this can be used to separate the immune complexes from free antigen. This has been called the Farr Technique

Anti-immunoglobulin antibody
The addition of a second antibody directed against the first antibody can result in the precipitation of the immune complexes and thus the separation of the complexes from free antigen.

Immobilization of the Antibody
The antibody can be immobilized onto the surface of a plastic bead or coated onto the surface of a plastic plate and thus the immune complexes can easily be separated from the other components by simply washing the beads or plate (Figure 17). This is the most common method used today and is referred to as Solid phase RIA or ELISA. In the clinical laboratory, competitive RIA and ELISA are commonly used to quantitate serum proteins, hormones, drugs metabolites.

Non-competitive RIA/ELISA for Ag or Ab
Non-competitive RIA and ELISAs are also used for the measurement of antigens and antibodies. In Figure 18, the bead is coated with the antigen and is used for the detection of antibody in the unknown sample. The amount of labeled second antibody bound is related to the amount of antibody in the unknown sample. This assay is commonly employed for the measurement of antibodies of the IgE class directed against particular allergens by using a known allergen as antigen and anti-IgE antibodies as the labeled reagent. It is called the RAST test (radioallergosorbent test). In Figure 19, the bead is coated with antibody and is used to measure an unknown antigen. The amount of labeled second antibody that binds is proportional to the amount of antigen that bound to the first antibody.

Tests for Cell Associated Antigens

Immunofluorescence
Immunofluorescence is a technique whereby an antibody labeled with a fluorescent molecule (fluorescein or rhodamine or one of many other fluorescent dyes) is used to detect the presence of an antigen in or on a cell or tissue by the fluorescence emitted by the bound antibody.

Direct Immunofluorescence
In direct immunofluorescence, the antibody specific to the antigen is directly tagged with the fluorochrome (Figure 20).

Indirect Immunofluorescence
In indirect immunofluorescence, the antibody specific for the antigen is unlabeled and a second anti-immunoglobulin antibody directed toward the first antibody is tagged with the fluorochrome (Figure 21). Indirect fluorescence is more sensitive than direct immunofluorescence since there is amplification of the signal.

ציטומטריית זרימה
Flow cytometry is commonly used in the clinical laboratory to identify and enumerate cells bearing a particular antigen. Cells in suspension are labeled with a fluorescent tag by either direct or indirect immunofluorescence. The cells are then analyzed on the flow cytometer.


Figure 22 illustrates the principle of flow cytometry. In a flow cytometer, the cells exit a flow cell and are illuminated with a laser beam. The amount of laser light that is scattered off the cells as they passes through the laser can be measured, which gives information concerning the size of the cells. In addition, the laser can excite the fluorochrome on the cells and the fluorescent light emitted by the cells can be measured by one or more detectors.

The type of data that is obtained from the flow cytometer is shown in Figure 23. In a one parameter histogram, increasing amount of fluorescence (e.g. green fluorescence) is plotted on the x axis and the number of cells exhibiting that amount of fluorescence is plotted on the y axis. The fraction of cells that are fluorescent can be determined by integrating the area under the curve. In a two parameter histogram, the x axis is one parameter (e.g. red fluorescence) and the y axis is the second parameter (e.g. green fluorescence). The number of cells is indicated by the contour and the intensity of the color.

rx-24.jpg (17140 bytes) Figure 24
PowerPoint animation of figure 24 of this figure

Antigen/antibody complexes can also be measured by their ability to fix complement because an antigen/antibody complex will “consume” complement if it is present, whereas free antigens or antibodies do not. Tests for antigen/antibody complexes that rely on the consumption of complement are termed complement fixation tests and are used to quantitate antigen/antibody reactions. This test will only work with complement fixing antibodies (IgG and IgM are best).
The principle of the complement fixation test is illustrated in Figure 24. Antigen is mixed with the test serum to be assayed for antibody and antigen/antibody complexes are allowed to form. A control tube in which no antigen is added is also prepared. If no antigen/antibody complexes are present in the tube, none of the complement will be fixed. However, if antigen/antibody complexes are present, they will fix complement and thereby reduce the amount of complement in the tube. After allowing complement fixation by any antigen/antibody complexes, a standard amount of red blood cells, which have been pre-coated with anti-erythrocyte antibodies is added. The amount of antibody-coated red blood cells is predetermined to be just enough to completely use up all the complement initially added, if it were still there. If all the complement was still present (i.e. no antigen/antibody complexes formed between the antigen and antibody in question), all the red cells will be lysed. If antigen/antibody complexes are formed between the antigen and antibody in question, some of the complement will be consumed and, thus, when the antibody-coated red cells are added not all of them will lyse. By simply measuring the amount of red cell lysis by measuring the release of hemoglobin into the medium, one can indirectly quantitate antigen/antibody complexes in the tube. Complement fixation tests are most commonly used to assay for antibody in a test sample but they can be modified to measure antigen.


Dendritic Cells

Dendritic cells reside in the skin, lymph nodes, and tissues throughout the body. Most dendritic cells are antigen-presenting cells. That is, they ingest, process, and present antigens, enabling helper T cells to recognize the antigen. Dendritic cells present antigen fragments to T cells in the lymph nodes.

Another type of dendritic cell, the follicular dendritic cell, is present in lymph nodes and presents unprocessed (intact) antigen that has been linked with antibody (antibody-antigen complex) to B cells. Follicular dendritic cells help B cells respond to an antigen.

After T and B cells are presented with the antigen, they become activated.


REAP: A platform to identify autoantibodies that target the human exoproteome

Autoantibodies that recognize extracellular proteins (the “exoproteome”) exert potent biological effects but have proven challenging to detect with existing screening technologies. Here, we developed Rapid Extracellular Antigen Profiling (REAP) as a technique for comprehensive, high-throughput discovery of exoproteome-targeting autoantibodies. With REAP, patient samples are applied to a genetically-barcoded library containing 2,688 human extracellular proteins displayed on the surface of yeast. Antibody-coated cells are isolated by magnetic selection and deep sequencing of their barcodes is used to identify the displayed antigens. To benchmark the performance of REAP, we screened 77 patients with autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dystrophy (APECED). REAP sensitively and specifically detected known autoantibody reactivities in APECED in addition to numerous previously unidentified reactivities. We further screened 106 patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and identified novel autoantibody reactivities against a diverse set of antigens including growth factors, extracellular matrix components, cytokines, and immunomodulatory proteins. Several of these responses were associated with disease severity and specific clinical manifestations of SLE and exerted potent functional effects on cell signaling ex vivo. These findings demonstrate the utility of REAP to atlas the expansive landscape of exoproteome-targeting autoantibodies and their impacts on patient health outcomes.


נקודות מפתח

Natural antibodies or autoantibodies, particularly IgM, that react with self-molecules occur in normal individuals and display a moderate affinity but high avidity for self-antigens

High-affinity, somatically mutated, class-switched IgG autoantibodies reflect a pathologic process in which homeostatic pathways related to cell clearance, antigen-receptor signaling or cell effector functions are disturbed

The mechanisms involved in immune-complex-mediated tissue injury include engagement of FcγRs and activation of complement, as well as internalization and activation of Toll-like receptors

Autoantibodies might be detectable long before disease onset and serve as biomarkers enabling diagnosis and targeting of therapeutic intervention

In organ-specific autoimmune diseases, autoantibodies directly injure target organs in systemic autoimmune diseases, they can also bind to different self-molecules and cause disease through the formation of immune complexes

Research is needed to clarify why certain antigens are targeted in different autoimmune diseases and how some antibodies activate, whereas others inhibit, immune responses


Regulatory Cells

The adaptive immune system is carefully regulated by several different cell populations. Helper T cells that promote immune responses are described earlier. Other T cells are called regulatory T cells (Treg cells). These secrete a mixture of cytokines that inhibit conventional immune responses. They serve to turn off an immune response once it has completed its task and the invading microorganism is eliminated. טreg cells also play a central role in preventing the development of autoimmunity.

For More Information

Also see pet health content regarding adaptive immunity in dogs, cats, and horses.