מֵידָע

איך לצפות בעובר דג זברה בפירוט?

איך לצפות בעובר דג זברה בפירוט?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

כמה זום מיקרוסקופ אצטרך כדי לצפות בהתפתחות של עובר דג זברה בפירוט מסוים? תודה חברה!


מניסיון אישי, זה אמור להספיק לצפות בדג הזברה בהגדלה של פי 10-20 לשינויים מבניים רחבים במהלך הפיתוח. אם למיקרוסקופ שלך יש עינית פי 10, אז זה יהיה זום פי 1-2. אם אתה צופה בשינויים תת-תאיים, תרוויח מהגדלה גבוהה יותר.


דג זברה

תַקצִיר

דג הזברה מוכר כאורגניזם מודל אידיאלי לחקר המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס היווצרות והתחדשות הלב. לדג הזברה מערכת לב וכלי דם סגורה ומחזור לב שמזכיר מאוד את הפיזיולוגיה הקרדיווסקולרית האנושית. ניתן לבצע מניפולציה גנטית של דג הזברה, והגנום שלהם עבר רצף מלא. מחקרים גנטיים בדגי הזברה גילו גנים ומסלולים חדשים בהתפתחות ותפקוד הלב וכלי הדם, עם מתאם הדוק עם מחלות לב וכלי דם. התחדשות הלב של דג הזברה מתרחשת בעקבות פציעה דרך ביטול ההבחנה והשגשוג של קרדיומיוציטים בוגרים. מסכי מולקולות קטנות המבוססות על עוברים גילו בדיקות כימיות ומועמדים לתרופות לשיפור ההתפתחות, התפקוד וההתחדשות הקרדיווסקולרית.


דג הזברה, המראה החי

במרתף בניין מדעי החיים, כ-1,500 מיכלי דגים, בגודל החל מתיקים ועד ארגזים קטנים, מונחים באופן שיטתי בשורות על מדפי מתכת. מביצית מופרית ועד בוגרת, כ-20,000 הדגים מייצגים את כל מחזור החיים של דג הזברה, ומספקים לברוס דרייפר מבט מקיף על הצמיחה שלהם.

"אם אתה מסתכל על תהליך ההתפתחות - אז עובר מביצית מופרית לאורגניזם שוחה ומזין - כל התהליך הזה ביונקים מתרחש ברחם, אז אתה למעשה צריך להקריב את האמא כדי להוציא את העוברים לחקור אותם," אומר דרייפר. "עם דג הזברה, הכל הפריה חיצונית."

חלק מהמחקר של דרייפר מתמקד בבעיות של התפתחות הרבייה. דג הזברה (Danio rerio) מתאימים היטב למחקר זה מכיוון שהעוברים שלהם צלולים, ומספקים צוהר למנגנון הביולוגי מאחורי היווצרותם. ככל שהדגים מתבגרים, הם מפתחים פסים ומאבדים את השקיפות שלהם.

חוקרים עוקפים את הבעיה הזו על ידי שינוי גנטי של דג הזברה עם גונדה - האיבר שאחראי על ייצור זרע וביצים - שזוהר תחת אור אולטרה סגול. זה מאפשר ניטור רציף של התפתחות הגונדה כשהדג גדל, ומספק רמזים לגבי מחלות התפתחות הרבייה כמו סרטן השחלות.

בעבר, דרייפר ועמיתיו זיהו את הגן fgf24 כחשוב להתפתחות הגונדה בדג הזברה. דג זברה מוטנטי פיתח בלוטות דם פגומות והיו בעלי יכולות רבייה מוגבלות. אמנם לא ידוע כי איתות גן ספציפי זה מעורב בהתפתחות גונדה של יונקים, אך סרטן שחלות אגרסיבי רבים מתואמים עם מסלול איתות פעיל יתר על המידה הקשור לגן זה. בסך הכל, לכ-84 אחוז מהגנים הקשורים למחלות אנושיות יש מקבילים בדג הזברה.

פרופסור חבר ברוס דרייפר משתמש בדג זברה כדי ללמוד התפתחות גונדה. עוצב על ידי Steve Dana/UC Davis

דרייפר ועמיתיו חוקרים כיצד רצף RNA חד-תא יכול לעזור לקדם את המחקר שלהם. הטכניקה מאפשרת תצוגה ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים והגנים שהם מבטאים.

"עכשיו אנחנו מזהים ברמה הרבה יותר מעודנת אילו גנים מתבטאים בתאים מסוימים", הוא אומר, ומציין שהצורות האגרסיביות ביותר של סרטן השחלות מתרחשות בדרך כלל בציפוי התאים של האיבר. "אנחנו מאוד מעוניינים לנסות לזהות את תאי האפיתל האלה במערך הנתונים שלנו כדי שנוכל להתחיל לשאול אילו גנים אחרים מתבטאים שם."

הטכניקות של דרייפר עבור הפרויקט הזה נמסרות על ידי סלינה ג'וליאנו, שהמשרד שלה נמצא במרחק של כמה דלתות ממנו.


דג הזברה עוזר לגלות רמזים למחלות אנושיות

מאי 2018 - מהרצפה ועד התקרה, בשורה אחר שורה של מיכלים קטנים ומבעבעים, 30,000 דגים טרופיים זעירים חושפים את הסודות למחלות שהטרידו דורות של חוקרים ורופאים.

דג הזברה הצנוע, בן מים מתוקים באורך סנטימטר וחצי ממשפחת הדגיגים, יליד הנחלים, הבריכות והשלוליות של אזור ההימלאיה. זה לא נראה כמו זברה, אם כי יש לו חמישה פסים אופקיים המעטרים את שני הצדדים.

אחד הדברים המעניינים ביותר בדג הזברה הוא שכאשר הם מאבדים משהו - עין, סנפיר, זנב, אפילו סוגי תאים בודדים - הם מגדלים אחד חדש.

מכיוון שהפרופיל הגנטי שלהם דומה להפליא לשלנו, דגי הזברה נמצאים גם בבניין המחקר מילר בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, שם הם מספקים למדענים רמזים גנטיים לתעלומות רפואיות. הדגים סייעו לחוקרים בג'ונס הופקינס לבצע פריצות דרך חשובות לקראת חידוש רקמת העין, הבנת סרטן בלוטת התריס והבנת סבך ה-DNA המווסת את פעילות התא.

המרכז לחקירה פונקציונלית בדג הזברה - או מרכז FINZ - הוא מתקן ליבת מחקר של המכון לרפואה גנטית מק'קוסיק-נת'נס. שלושים ליבות שונות ממחלקות ברחבי אוניברסיטת ג'ונס הופקינס מציעות יותר מ-500 שירותים שונים הקשורים למחקר. המרכזים מאפשרים לחוקרים לחלוק משאבים ומומחיות יקרי ערך, תוך חיסכון בזמן וגם בדולרים.

מנהל שותף במרכז FINZ, ג'ף מאם, ממכון וילמר איי ומכון מקוסק-נת'נס, אומר שבנוסף לשלושה חוקרי ג'ונס הופקינס שמתחזקים כיום מיכלי דגים שם, המרכז משתף פעולה עם מדענים אחרים.

תמורת תשלום, FINZ מציעה שירותים גנטיים רבים לעמיתים ברחבי המוסד, כולל שינוי הגנום כדי לייצר דגים עם תכונות שחוקרים רוצים לחקור. לדוגמה, חוקר שרוצה לחקור כיצד הכבד מתפתח ומתפקד יכול לבקש ממרכז FINZ לייצר דג זברה עם כבדים זוהרים. נטילת גן ממדוזות המאפשר את זוהר הליבון שלהן, צוות FINZ מציג את הגן הזה לתוך דג הזברה, מאיר את הכבד ומאפשר לחוקרים לצפות בגדילתו ובתפקודו.

"זה סוג העבודה שאנחנו עושים כל הזמן", אומרת אמא. "זה תהליך זול ויעיל לעבוד איתנו כדי ליצור דגי זברה מהונדסים גנטית לצרכי מחקר ספציפיים."

בשנת 2004, הגנטיקאי אנדי מק'קליון, יחד עם הקולגות לשעבר שאנון פישר וסטיבן ליץ', הציעו לג'ונס הופקינס לבנות מתקן משלו לדגי זברה. מקאליון, שמנהל שותף את מרכז FINZ, ופישר, כיום חבר סגל באוניברסיטת בוסטון, שכנעו את הנהגת בית הספר לרפואה שדג הזברה יציע דרך יעילה יותר וזולה יותר לבצע מחקר גנטיקה.

מקאליון וצוות המעבדה שלו חופרים עמוק בקודים גנטיים השולטים מתי והיכן גנים מופעלים/כיבים, תוך שילוב של כלים גנומיים חדישים ובינה מלאכותית חישובית כדי למצוא את החריגות שיכולות להשפיע על מחלות כמו פרקינסון. הוא אומר שלמרות שהעבודה הזו עדיין מפרכת, בתחילת הקריירה שלו זה היה הרבה יותר קשה.

"יכולנו לראות רצפים שבלטו כדומים מאוד בקרב מינים שונים, אבל לא הייתה לנו דרך בקנה מידה גדול וכלל גנומי לבדוק את ההשערות שלנו", נזכר מק'קליון. "היינו צריכים דרך לבדוק מאות ומאות מהדברים האלה. מהרבה סיבות, לימוד הדגים נותן לנו את היכולת הזו".

בנוסף לדמיון הגנטי שלהם לבני אדם, לדגי הזברה יש תכונות נוספות שהופכות אותם לאטרקטיביים עבור מדענים שצריכים לחקור מספר רב של אותו אורגניזם. הדגים מתרבים ומתבגרים במהירות, קל לתחזק אותם והביציות שלהם מופרות מחוץ לגופם, מה שמאפשר לחוקרים לקצור עוברים שהופרו לאחרונה. כדי לייצר את התכונה הרצויה בדג, הם יכולים להכניס גנים חדשים או להסיר גנים מהעוברים שנקטפו. ומכיוון שעוברי דג הזברה הם שקופים, מדענים יכולים לצפות בהתפתחותם בזמן אמת, ולצפות באיברים ובמערכות שלמות צומחים מתאי גזע.

מום אומרת שבעוד שהמדע התמקד בעכברים כמודלים לחקר מחלות מאז יצירת העכבר הראשון שעבר שינוי גנטי ב-1980, דג הזברה הופיעו בשנים האחרונות גם כמין מודל חשוב.

מחקר דג הזברה | מאחורי הקלעים של מתקן דג הזברה של ג'ונס הופקינס

דג הזברה ממלא תפקיד חשוב במחקר בג'ונס הופקינס. פרייזר מתיוס והאנה אדלמן לוקחים אותנו לסיור במתקן שבו 30,000 דגים עוזרים לחוקרים לגלות רמזים למחלות.

במשך שנים רבות, זבובי הפירות היו המין המועדף על חוקרי הגנטיקה, וחלקו יותר מ-61 אחוז מהגנים עם בני אדם. ובעוד החרקים עדיין ממלאים תפקידים חשובים, הבדלים פיזיולוגיים מרכזיים הופכים דגים, כבעלי חוליות אחרים, לאטרקטיביים.

בעוד שדג הזברה חולק כ-71 אחוזים מהגנום האנושי, בחלק מהמקרים העיקריים, גנים של דגים הם התאמה כמעט מושלמת עבור אנשים. על פי מחקר משנת 2013 של חוקרים בריטים, ל-82 אחוז מהגנים הקשורים למחלות והפרעות אנושיות יש מקבילה של דג הזברה.

עכברים ובני אדם הם התאמה גנטית קרובה יותר, בערך 85 אחוז. אבל אמא אומרת, "דג הזברה מספק נקודת מבט רעננה, ומעניק הזדמנויות ייחודיות מעבר למה שאפשרי בעכברים." מעבדת Mumm מתמחה ב"ביולוגיה בתפוקה גבוהה", שבה ציוד אוטומטי מעבד מספר רב של דגימות כדי לאפשר בדיקה כימית וגנטית בקנה מידה גדול.

גישה זו קשה ויקרה ליישום על עכברים ולכן הוגבלה במידה רבה לעבודת תרבית תאים. עם זאת, בשל גודלם הקטן, דגי הזברה הופיעו כפלטפורמה של מודל מחלות חי לגילוי תרופות בתפוקה גבוהה. מעבדת Mumm פיתחה גישת סקר מבוססת דג זברה שמעריכה את השפעות התרופות מהר יותר מאי פעם, ומעבדת עשרות אלפי דגים ביום.

מכיוון שניתן לשנות את הגנים שלהם בצורה כל כך זולה ובמספרים גדולים, מום אומרת שדג הזברה מאפשרים למדענים להמשיך גם ביוזמות מחקר גנטי בקנה מידה גדול, ולחקור את תפקודם של מספר גדול יותר של גנים בפרקי זמן קצרים יותר.

מנתח ג'ונס הופקינס, ג'ייסון פרסקוט, מחזיק במיכלי דג זברה רבים במרכז FINZ. שלושה ימים בשבוע הוא מנתח חולים עם סרטן בלוטת התריס. אבל יש לו גם מעבדת מחקר שמטרתה, יום אחד, להפוך את התקדמות המחלה ולבטל את הצורך בניתוח. דג הזברה עוזר לפרסקוט להבין טוב יותר כיצד מוטציות גנטיות יכולות לגרום לבלוטת התריס הבריאות להפוך לסרטנית.

"המטרה היא להוציא את עצמי מעסקי הניתוחים", הוא אומר.

פרסקוט וצוות המעבדה שלו חוקרים את קידוד הגנים הפגום בחולים המגיעים אליו לניתוח סרטן בלוטת התריס. כאשר הם מבודדים את הגן הפגום של חולה, הם מציגים גן דומה בדג הזברה. אחר כך הם מתבוננים בדגים כדי ללמוד את מקורות התאים הסרטניים וכיצד הם משתכפלים.

"לדגים יש בלוטות התריס הדומות מאוד לשלנו", אומר פרסקוט. "מבחינה אנטומית, הם נמצאים בערך באותו מקום והם מבצעים תפקיד דומה. ומכיוון שהם חיים, אנחנו יכולים למעשה לראות את הביולוגיה בזמן אמת, כפי שהיא מתרחשת."

הדגים מאפשרים גם בדיקה מהירה ויעילה של תרופות למלחמה במחלות.
"עוקפים טכניקות סקר פרימיטיביות יותר, אנו מסוגלים לחסוך זמן וכסף על ידי בדיקת תרופות על מאות דגים בו זמנית", הוא אומר. בדוגמה אחת למחקר של פרסקוט, דגים בודדים, שעברו שינויים גנטית לבעלי בלוטת התריס סרטנית, מונחים בכלי מים רדודים. הדגים הונדסו כך שבלוטת התריס שלהם זוהרת כאשר תרופה מסוימת גורמת לתגובה מסוימת. החוקרים מכניסים למים תרכובות תרופות שונות וחוקרים את התוצאות.

דג הזברה מילא תפקיד מפתח במרדף של פרסקוט אחר פריצות דרך פרמצבטיות למלחמה בסרטן בלוטת התריס.

"סטנדרט הזהב לניסויים פרה-קליניים בתרופות הוא עבודה עם אורגניזם חי", הוא אומר. "זה מאפשר לנו סביבה הרבה יותר מציאותית מאשר עבודה עם תאים הגדלים על צלחת."

היכולת לתיקון עצמי

הסטודנטית לרפואה חנה אדלמן נמצאת בשש שנים ל-M.D./Ph.D. תוכנית, חוקרת גנטיקה אנושית וסוכרת ילדים. היא מבלה שעות רבות במרכז FINZ במחקר כיצד דג הזברה לעולם אינו חולה במחלה.

בסוכרת מסוג 1, מערכת החיסון של המטופל תוקפת והורסת את התאים בלבלב המייצרים אינסולין, ההורמון המווסת את רמת הסוכר בדם. בעוד שבני אדם אינם יכולים ליצור מחדש את התאים הללו, דג הזברה כן.

"הם יכולים להצמיח מחדש תאי בטא של הלבלב", היא אומרת, בהתייחסה לתאים האוגרים ומשחררים אינסולין. "אני רוצה לדעת מה כל כך מיוחד שמאפשר להם לעשות את זה. אנחנו מנסים למצוא דרך לבני אדם להיות מסוגלים לחדש את התאים האלה. זה אומר הרבה בטיפול בסוכרת מסוג 1".

בעבודתו של מאם על מחלת עיניים ניוונית, הוא מנצל את העובדה שבני אדם ודגי הזברה חולקים תכונה - סוג תאים ספציפי שיכול לחזור להיות תא גזע - המאפשרת להם לייצר תאים חדשים בתגובה לפציעה או מחלה בגוף. רִשׁתִית. לפיכך לשני המינים יש את היכולת לייצר תאים חדשים לריפוי העין.

"אי שם לאורך הדרך בבחירה האבולוציונית שלהם, דג הזברה פיתח יכולת לתיקון עצמי", אומר מום.

ההבדל, אומרת אמא, הוא שבעוד שהתאים החדשים מובילים לרשתית חדשה לגמרי אצל דג הזברה, לבני אדם אין כל כך מזל. "עבורנו, התאים החדשים הופכים לרקמת צלקת. זה למעשה גורם לבני אדם יותר נזק מתועלת". בתרבית תאים, לעומת זאת, לתאי גזע רשתית אנושיים המגיבים לפציעה יש את היכולת לייצר נוירונים חדשים.

הוא מקווה שעל ידי למידה כיצד נשלטות יכולות ההתחדשות החזקות של דג הזברה, נוכל לרתום יכולות התחדשות רדומות בחולים עם מחלות עיניים ניווניות. לדבריו, הדגים מזרזים את התהליך בכך שהם עוזרים לחסל את הקצוות המבוי הסתום המדעיים מהר יותר מאי פעם.

בשילוב מחקרים אלה עם טכניקות הסינון בתפוקה גבוהה במעבדה שלו, מום אומר, "אנחנו יכולים לגלות מה לא עובד בשלב הראשון ולא בשלב 52. זה מסתכם בהרבה מאוד זמן וכסף שנחסכו".


דינמיקת אבות פוטורצפטורים ברשתית עוברי דג הזברה והאפנון שלו על ידי ריסים ראשוניים ו-N-cadherin

רקע כללי קולטני הפוטו של הרשתית העצבית של החולייתנים מקורם בנוירופיתל, וכמו נוירונים אחרים, עליהם לעבור טרנסלוקציה של גוף התא ומעברי קוטביות כדי לרכוש את המורפולוגיה התפקודית הסופית שלהם, הכוללת תכונות של תאי עצב ואפיתל.

שיטות ניתחנו תהליך זה בפירוט על עוברי דג הזברה באמצעות in vivo מיקרוסקופיה קונפוקלית ומיקרוסקופיה אלקטרונית. אבות פוטורצפטורים סומנו על ידי הביטוי הטרנסגני של EGFP תחת ויסות האמרגן הספציפי לפוטורצפטור crx, וגנים של עניין הופסקו באמצעות אוליגומרים של מורפולינו.

תוצאות אבות פוטורצפטורים התנתקו מהרשתית הבסיסית בשלבים פרה-מיטוטיים, ונסוגו במהירות תהליך בסיסי קצר כאשר גוף התא עבר טרנסלוקקציה אפיקית. הם נשארו בעמדה קודקודית ללא הגבלת זמן כדי ליצור את השכבה הגרעינית החיצונית (ONL), בתחילה הרחיבה ומשיכה של תהליכים דמויי עצב דינמיים מאוד, המשיקים למשטח הקודקוד. אבות פוטורצפטורים רבים הציגו צלייה ראשונית אפיקלית קצרה. מספרם ואורכם של ריסים אלה הופחתו בהדרגה עד שכמעט נעלמו בסביבות 60 hpf. ההפרעה שלהם על ידי הפלת IFT88 ו-Elipsa גרמה לפגם ידוע לשמצה בנסיגת התהליך הבסיסי. ניתוח זמן-lapse של N-cadherin knock-down, טיפול הידוע כגורם להפרעה חמורה של ה-ONL, הראה כי אבות הפוטו-קולטן החוץ רחמיים נדדו בתחילה בצורה אקראית לכאורה, והאריכו מאוד את תהליכי התא, עד שהם נתקלו בתאים אחרים כדי לבסס רוזטות תאים שבהן שהו ורוכשות את הקוטביות דמוית קולטן הפוטו.

סיכום בסך הכל, התצפיות שלנו מצביעות על ויסות מורכב של דינמיקת אבות פוטורצפטור ליצירת הרשתית ONL, לפני שלבי ההתבגרות הפוסט-מיטוטיים.


מחקר ביו-רפואי III: תקשורת בין המוח לאיברים אחרים

התבגרות אנושית היא תהליך דינמי שמתחיל את האינטראקציות המורכבות של ציר ההיפותלמוס-היפופיזה-גונדאלי (ציר HPG), המתייחס לבלוטות אנדוקריניות בודדות כישות אינדיבידואליות. ציר ה-HPG ממלא תפקיד קריטי בפיתוח ובוויסות רבות ממערכות הגוף, במיוחד רבייה 39 . הורמון משחרר גונדוטרופין (GnRH), המופרש על ידי ההיפותלמוס במוח, מסתובב דרך החלק הקדמי של מערכת השער ההיפופיזה של יותרת המוח ונקשר לקולטנים על תאי הפרשה של האדנוהיפופיזה 40 . בתגובה לגירוי GnRH, תאים אלו מייצרים הורמון luteinizing והורמון מגרה זקיקים, אשר מסתובבים בזרם הדם 41 . לכן, מתבגר מתפתח למבוגר בוגר בעל גוף המסוגל להתרבות מינית 42 . תסמונת קלמן (KS) היא הפרעה גנטית הידועה כמונעת מאדם להתחיל או להשלים את גיל ההתבגרות במלואו. במחקר שמראה כי WDR11 מוטציה גנטית מעורבת בפתוגניות KS, דג הזברה wdr11 הוכח כי הגן מתבטא באזור המוח, מה שמצביע על תפקיד פוטנציאלי לאינטראקציה של חלבון WDR11-EMX1 43 .

בנוסף, ידוע כי דלקת חריפה יוזמת תגובה רגנרטיבית לאחר פציעה טראומטית במוח של דג הזברה הבוגר. הקולטן לציסטניל לוקוטריאן 1 (cysltr1)–לויקוטריאן C4 (LTC4מסלול נדרש ומספיק לשגשוג משופר ונוירוגנזה 44 . LTC4, אחד הליגנדים של CysLT1, נקשר לקולטן שלו Cysltr1 המתבטא בתאי גליה רדיאליים במוח דג הזברה 44 . במחקר של Kyritsis וחב', cysltr1 התבטא יותר ויותר בתאי גליה רדיאליים לאחר פגיעה מוחית טראומטית, דבר המצביע על הצלבה בין מרכיבי התגובה הדלקתית ומערכת העצבים המרכזית במהלך פגיעה מוחית טראומטית 44 .

משפחת הניקוטינאמיד אדנין דינוקלאוטיד פוספט (NADPH) אוקסידאז (NOX) מעורבת בייצור מיני חמצן תגובתיים בתגובה לאותות תאיים שונים. בן משפחת NOX כפול אוקסידאז (DUOX) זוהה כ-NADPH אוקסידאז של בלוטת התריס. בבני אדם זוהו מוטציות DUOX2 בקרב ילדים שאובחנו עם תת פעילות בלוטת התריס מולדת. לאחרונה, הוכח שבנוסף לבלוטות התריס הזקן ופיגור בגדילה, נמצאו פגמים בתגובת חרדה ואינטראקציה חברתית ב דווקס-נוקאאוט דג זברה 45 . תוצאות אלו מצביעות על כך דווקסדג הזברה נוקאאוט יכול לשמש מודל חיה יעיל למחקרים בהתפתחות בלוטת התריס ומחלות נוירולוגיות קשורות, כולל מוגבלות אינטלקטואלית ואוטיזם.

לאחוז גדול מהילדים עם ASD ידוע כי יש בעיות במערכת העיכול, כגון עצירות, שלשולים וכאבי בטן. מחקרים אחרונים על ציר המוח-מעי הראו גם שאינטראקציות עם קהילות מיקרוביאליות הקשורות למארח, בין אם ישירות על ידי מטבוליטים מיקרוביאליים או בעקיפין באמצעות מערכות חיסון, מטבוליות או אנדוקריניות, יכולות לשמש כמקורות לרמזים סביבתיים. אותות מולקולריים מהמעי מספקים רמזים סביבתיים לתקשורת בין המעי למוח במהלך אפיזודות הקשורות לחרדה, דיכאון, קוגניציה או הפרעת הספקטרום האוטיסטי (ASD) 46 . יתר על כן, אפנון של מסלולי איתות פנימיים ורמזים חיצוניים בחיידקי מעיים גרים משפר את היציבות של β-catenin בתאי אפיתל מעיים, ומקדם את התפשטות התאים 47 .


מסלול הפרשת החלבון

מסלול ההפרשה מייצר, סוחר ומעבד חלבונים המיועדים לחלל החוץ-תאי או לממברנת הפלזמה. הוא כולל את הרשת האנדופלזמית (ER), את תא הביניים ER-Golgi (ERGIC), את קומפלקס Golgi ואת השלפוחיות הנושאות מטען ביניהם (איור 2). סינתזת חלבון וגליקוזילציה מתרחשים ב-ER וב-Golgi, בהתאמה. תסביך חלבון המעיל II (COPII) מקל על בחירת מטען, היווצרות שלפוחית ​​וסחר אנטרוגרד מ-ER ל-Golgi, ואילו הובלה רטרוגרדית מתרחשת בשלפוחיות COPI (איור 1F איור 2). קומפלקסים חלבוניים מגוונים פועלים בכל שלב של מסלול זה כדי לגייס Rab GTPases וחלבוני SNARE, המכוונים וקושרים שלפוחיות למטרת אברונים ומקלים על היתוך ממברנה.

רכיבי מסלול הפרשה שנחקרו בדג הזברה ומעורבים במחלות אנושיות. חלבוני מסלול הפרשה המעורבים במחלות אנושיות מוצגים בשחור עם כלים מתאימים של דג הזברה לחקור אותם באדום. NTD, פגמים בצינור העצבי CLSD, dysplasia cranio-lenticular-sutural CDAII: congenital dyserythropoietic anemia II CMRD, מחלת שימור כילומיקרון LGMD, ניוון שרירים בחגורת הגפיים SEDL, X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda ID, in.

רכיבי מסלול הפרשה שנחקרו בדג הזברה ומעורבים במחלות אנושיות. חלבוני מסלול הפרשה המעורבים במחלות אנושיות מוצגים בשחור עם כלים מתאימים של דג הזברה לחקור אותם באדום. NTD, פגמים בצינור העצבי CLSD, dysplasia cranio-lenticular-sutural CDAII: congenital dyserythropoietic anemia II CMRD, מחלת שימור כילומיקרון LGMD, ניוון שרירים בחגורת הגפיים SEDL, X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda ID, in.

עבודה באורגניזמים חד-תאיים ובתאים מתורבתים יצרה הנחה שהפרשת חלבון מווסתת באופן אחיד על פני סוגי תאים. מחקרים בבני אדם, דגי זברה ובעלי חוליות אחרים, לעומת זאת, גילו שמסלול זה מווסת בצורה מרחבית-זמנית וספציפית לפרלוג (Melville and Knapik, 2011 Unlu et al., 2013). למרות שכל התאים מפרישים חלבונים, חלקם - כולל תאי B, כונדרוציטים, הפטוציטים ותאי הלבלב האנדוקריניים והאקסוקריניים - נחשבים לתאי הפרשה 'מקצועיים', וההנחה היא שתאים אלה רגישים במיוחד לשיבוש מסלול ההפרשה. מוטנטים של דג זברה בגנים של מסלול הפרשה תמכו והפריכו את ההשערה הזו: חלק מהמוטנטים מראים פנוטיפים ברוב התאים בעלי הפרשה גבוהה, בעוד שלאחרים יש פנוטיפים המוגבלים לתת-קבוצת תאים בלבד.

הדעה המתגבשת היא שמנגנון ההפרשה הוא חלק בלתי נפרד ממורפוגנזה ותפקוד איברים באופן ספציפי לתא. הזמינות של מוטנטים גנטיים ופלורסנטים של דג הזברה in vivo עיתונאים מספקים תובנה חדשה לגבי הפונקציות האורגניזמיות של מסלול ההפרשה. ההשפעות של הפרעה במסלול ההפרשה הרלוונטית להתפתחות ולמחלה נדונות להלן.

השלכות התפתחותיות של הפרעה במסלול ההפרשה

קומפלקס COPII כולל את ה- Sar1 GTPase, דימרים Sec23-Sec24 של המעיל הפנימי, והטרוטטרמרים Sec13-Sec31 של המעיל החיצוני (איור 2 Kaiser and Schekman, 1990 Novick et al., 1980). מוטציות דג הזברה של sec23a (מַגרֵסָה) ו sec24d (בּוּלדוֹג) מפתחים דיסמורפולוגיה קרניופציאלית, סנפירי חזה מכווצים ואורך גוף קצר (Lang et al., 2006 Sarmah et al., 2010). אלה מיוחסים לכשל בהפרשת המטריצה ​​החוץ-תאית (ECM) במהלך התמיינות כונדרוציטים. בעלי חיים חסרי Sec23A ו- Sec24D אינם מצליחים לייצא קולגן וחלבונים אחרים בעלי N-glycosylated מה-Chondrocyte ER, עוצרים התמיינות ובסופו של דבר גורמים למוות של תאים (Lang et al., 2006 Sarmah et al., 2010 Unlu et al., 2013), בעוד שהפרשת קולגן והתפתחות השלד שלמים עם דלדול הפרלוג הקרוב Sec24C (Sarmah et al., 2010). מוטציות Sec23B בבני אדם ודגי זברה משבשות את האריתרופוזה (Bianchi et al., 2009 Schwarz et al., 2009), פנוטיפ שונה מהפגמים בכונדרוציטים שנצפו ב מַגרֵסָה ו בּוּלדוֹג מוטנטים. פנוטיפים אלו של COPII שונים מהמוטנטים הננסיים מתעטש, שַׂמֵחַ ו מְטוּמטָם, אשר משבשים גנים המקודדים את תת-היחידות α, β ו-β′ של קומפלקס COPI, בהתאמה (איור 2), המתאפיינים בפגמים ביצירת notochord ומלנוזום (Coutinho et al., 2004). נתונים אלו מצביעים על כך שלמרות ש-COPI ו-COPII נדרשים להפרשה יעילה ומיחזור ממברנות בכל התאים, לאובדן של איברים ספציפיים של כל קומפלקס יש השפעות עמוקות ושונות על תת-קבוצה של תאים. מוטציות ברכיבי COPII בודדים גורמות למערך של פנוטיפים בסוגי תאים בעלי הפרשה גבוהה באיברים כגון סחוס, נוטקורד, עין ומעי (Niu et al., 2012 Schmidt et al., 2013 Townley et al., 2008 Townley et al., 2012), ובאריתרוציטים (Bianchi et al., 2009 Schwarz et al., 2009 Unlu et al., 2013), בעוד שתאים התלויים בהיווצרות וואקוולים רגישים ביותר לדלדול COPI.

אז איך מנגנוני ויסות תעתיק מכוונים את מסלול ההפרשה כדי להבטיח זמינות בזמן של מעילים ספציפיים למטען? מסך בקנה מידה גדול בדג הזברה זיהה את מרגיש טוב מוטנט, הנושא וריאנט missense ב- creb3L2 גן (Driever et al., 1996 Knapik, 2000 Neuhauss et al., 1996) - גורם השעתוק הראשון הידוע המווסת את זמינות רכיבי COPII sec24d ו sec23a, אבל לא sec24c (Melville et al., 2011). קווי דמיון בין מרגיש טוב, מַגרֵסָה ו בּוּלדוֹג פנוטיפים מוטנטיים מצביעים על כך ש'מודול הפרשה' המורכב מ-Creb3L2-Sec23A-Sec24D מתמחה בהפרשת פרוקולגן. בהתחשב בכך שדג הזברה המדולדל מ-Sec24C אינו מראה דיסמורפולוגיה שלד והגן אינו מטרה ל-Creb3L2, סביר להניח שמודול הפרשה ספציפי למטען מווסת sec24c וגנים אחרים במסלול זה. מחקרים עתידיים בדגמי זברה ומודלים של בעלי חיים אחרים יידרשו כדי לפצח את הקוד של רשתות הפרשה רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, ספציפית למטען.

מחלות הנגרמות כתוצאה מהפרעה במסלול ההפרשה בדגי זברה ובבני אדם

מספר תסמונות אנושיות קשורות לפגמים במסלול ההפרשה (De Matteis and Luini, 2011), שחלקם משוחזרים במוטציות בגנים אורתולוגיים של דג הזברה (איור 2). הזיהוי במקביל של מַגרֵסָה/sec23a מוטנטים בדגי זברה וחולים עם גרסאות SEC23A/cranio-lenticulo-sutural dysplasia (CLSD) (Boyadjiev et al., 2006 Lang et al., 2006) מספקים דוגמה מצוינת להתכנסות בין הגנטיקה האנושית לביולוגיה התפתחותית של דג הזברה כדי לחשוף השלכות פיזיולוגיות. על ידי שיבוש תהליכים ביולוגיים בסיסיים של התא. שניהם מַגרֵסָה מוטנטים וחולי CLSD מציגים דיסמורפולוגיה קרניופציאלית ופגמים בשלד צירי המיוחסים לצבר של חלבוני ECM במיון (Boyadjiev et al., 2006 Lang et al., 2006). הקרובים SEC23B הגן עובר מוטציה בחולי אנמיה מולדת דיסריתרופואטית מסוג II שיש להם אריתרובלסטים מרובי-גרעינים במח העצם, פנוטיפ המשובץ בדג הזברה sec23b morphants (Bianchi et al., 2009 Schwarz et al., 2009).

לא ברור מדוע מוטציות בפרלוגים של SEC23A ו-SEC23B, אשר נבדלים רק על ידי מתיחה של 18 חומצות אמינו, גורמות לפנוטיפים שונים כל כך. אפשרות אחת היא שהבדלים מרחבי-זמניים בביטוי מקנים פונקציות ספציפיות לתא של כמה גנים מורכבים של COPII. עם זאת, כמו sar1a ו sar1b באים לידי ביטוי בכל מקום בשלב מוקדם בהתפתחות ומתעשרים ברקמות נפרדות מאוחר יותר (E.W.K., תצפיות שלא פורסמו), אין זה סביר שדפוס הביטוי הגנים שלהם הוא האחראי הבלעדי לפנוטיפים השונים שנצפו במוטנטים אלה.

הפנוטיפים קרניופציאליים של מוטציות COPII מצביעים על כך שכונדרוציטים רגישים מאוד לפגמים בהפרשת ECM. זה מנבא שמניפולציות אחרות שחוסמות את מסלול ההפרשה יגרמו גם הן לדיסמורפולוגיה קרניופציאלית. עם זאת, זה לא נתמך על ידי נתונים מדגי זברה או בני אדם כאשר גורמים הפועלים בשלבים אחרים במסלול ההפרשה מתרוקנים. קומפלקס החלבונים התחבורה (TRAPP) קושר שלפוחיות שמקורן ב-ER לממברנת cis-Golgi (איור 2 ו-Sacher et al., 2008). פיברובלסטים מחולים עם TRAPPC11 אוֹ TRAPPC2 מוטציות (Bögershausen et al., 2013 Scrivens et al., 2009), ותאים מתורבתים המדוללים מ-TRAPPC11 (Scrivens et al., 2011 Wendler et al., 2010) מציגים פיצול של Golgi ושימור חלבון הפרשה. עם זאת, כאשר חלבונים אלו מתרוקנים באורגניזמים שלמים מתגלים תפקידיהם הספציפיים לתא: חולים עם TRAPPC2 מוטציה לפתח spondyloepiphyseal dysplasia tarda (SEDT) המובחן על ידי פגמים בשלד, קומה נמוכה ומיקרוצפליה (Gedeon et al., 1999 Huson et al., 1993). זה מסודר ב trapc2 דג זברה מורפנטים, בעלי גזע קצר ומיקרוצפליה (A.M. Vacaru ו-K.C. Sadler, לא פורסם). הפנוטיפ הקצר ו/או הגזע עשוי לשקף פגם ביצירת כונדרוציטים או בתצהיר ECM, כמו במוטציות COPII, אך חולים ודגי זברה עם TRAPPC11 מוטציה מופיעה בצורה שונה מאוד. מוטציה של TRAPPC11 בבני אדם גורמת למיאופתיה, פגיעה אינטלקטואלית ותנועות היפר-קינטיות (Bögershausen et al., 2013). באופן מעניין, דג זברה כבד אווז (foigr) מוטנטים הנושאים החדרה ויראלית מוטגנית ב- trapc11 הגנים מציגים פנוטיפ שונה ממודלים אחרים של שיבוש קומפלקס של TRAPP: הם מפתחים כבד שומני, הפטומגליה, מעיים ולסתות קטנים יותר ומומים בסנפירים (Cinaroglu et al., 2011 Sadler et al., 2005). ה foigr/trappc11 הפנוטיפ של כבד שומני מיוחס חלקית להפעלה של תגובת החלבון הבלתי מקופלת (Cinaroglu et al., 2011), עם זאת, לא תאים מתורבתים יונקים שמדולדלים מ-TRAPPC11 ולא trapc2 מורפנטים גורמים לתגובה זו (A.M.V. ו- K.C.S., תצפיות שלא פורסמו), המדגישים את התועלת של in vivo לימודי ביולוגיה של תאים בבעלי חוליות.

הפנוטיפים הייחודיים המבדילים בין שיבוש קומפלקס TRAPP למוטציות COPII או COPI מצביעים על כך שחסימה גלובלית בהפרשת חלבון אינה המנגנון היחיד שעומד בבסיס הפנוטיפים הקשורים ביניהם. יתרה מזאת, על אף שדלדול גורמי TRAPP או COP בודדים יש השפעות דומות בתאים מבודדים, לא ניתן היה לחזות את ההשלכות הפיזיולוגיות ללא שימוש בבעלי חיים שלמים. ממצאים אלה מצביעים על תפקידים ספציפיים לתאים ולהתפתחות עבור כל גן המעורב בהפרשת חלבון ומדגישים את הצורך במודלים השוואתיים של בעלי חיים שלמים כדי לפענח את התפקודים התאיים והפיזיולוגיים של מסלול זה.


פרק 9 - ניתוח מבנה ותפקוד ריסים בדג הזברה

ריסים הם בליטות מבוססות מיקרו-צינוריות על פני השטח של רוב התאים האוקריוטיים. הם נמצאים ברוב, אם לא בכל, איברי החולייתנים. ריסים בולטים נוצרים במבנים חושיים, בעין, באוזן ובאף, שם הם חיוניים לזיהוי גירויים סביבתיים, כגון אור וריחות. ריסים מעורבים גם בתהליכי התפתחות, כולל היווצרות אסימטריה משמאל-ימין, מורפוגנזה של גפיים ועיצוב של נוירונים בצינור העצבי. כמה ריסים, כמו אלה שנמצאים בצינורות הכליה, נחשבים לבעלי תפקידים מכנו-חושיים. דג הזברה הוכיח שימוש רב באנליזה גנטית והדמיה של תהליכים הקשורים לסיליה, ובמודלים של מנגנונים מאחורי הפרעות ריסים אנושיים, המכונה ciliopathies. A number of zebrafish defects resemble those seen in human ciliopathies. Forward and reverse genetic strategies generated a wide range of cilia mutants in zebrafish, which can be studied using sophisticated genetic and imaging approaches. In this chapter, we provide a set of protocols to examine cilia morphology, motility, and cilia-related defects in a variety of organs, focusing on the embryo and early postembryonic development.


Glossary

Digital scanned laser light sheet fluorescent microscopy (DSLM): An improved version of SPIM, which uses a thin laser beam rather than a full light sheet, thus reducing damage to both specimen and fluorescent dye.

Gastrulation: The phase in early embryonic development during which the three germ layers are formed: ectoderm, mesoderm and endoderm. The timing and molecular mechanism of gastrulation differ between organisms.

Genetic strain: A genetically uniform group of animals, used in laboratory experiments. A genetic strain can be developed by inbreeding, mutation or genetic engineering.

Single-plane illumination microscopy (SPIM): This method allows 3D observation of processes in living organisms, even in deep tissue layers. It detects fluorescence at an angle of 90° relative to the axis of illumination with a sheet of laser light, permitting optical cutting. The specimen is not positioned on a microscope slide but in a liquid-filled chamber which is rotated during observation.


Math Model Helps Show How Zebrafish Get Their Stripes

A mathematical model developed by Brown University researchers, including doctoral student in Applied Mathematics Alexandria Volkening, is shedding new light on how zebrafish get their iconic stripes. The model helps to demonstrate how two dynamic processes—the movement of pigment cells across the skin, and the birth and death of cells as the fish grows—combine to keep zebrafish stripes in line.

Zebrafish have become quite a popular model organism for biology researchers over the past few decades. The small freshwater fish begin life as transparent embryos and develop in just a few months to full size, giving scientists the chance to watch their development in detail. The emergence of their namesake stripes of dark blue and bright yellow has been the subject of much research. The stripes have been shown to be the result of interplay between three types of pigment cells: black melanophores, yellow xanthophores, and silvery iridophores.

“The stripe pattern forms dynamically as the fish develops,” said Volkening, who is the lead author on the new paper. “It’s not like these pigment cells are filling out some kind of prepattern that’s already there. It’s the interactions of the cells over time that causes the patterns to form. We wanted to build a model that simulates this based as much as possible on what’s known about the biology.”


צפו בסרטון: שרצים של ציקליד זברה אדומה (נוֹבֶמבֶּר 2022).