מֵידָע

האם החלפת מחלקות מתרחשת הן בתאי B והן בתאי פלזמה?

האם החלפת מחלקות מתרחשת הן בתאי B והן בתאי פלזמה?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

אני מבין שמחלקת התאים עוברת לשינוי סוג האימונוגלובולין שהוא מייצר. תא B מייצר את הקולטן הקשור לתאי B (BCR) ואילו תא הפלזמה מייצר את הצורה המופרשת של Ig, הנוגדן. עכשיו, האיזוטיפים שונים באזורים הקבועים שלהם ואני מניח שהחלפה משנה רק אם מדובר בנוגדן. (הבדלים בין נחישות, חדירות, קולטני נוגדנים וכו ')

כיצד היה קולטן של תאי B (Ig קשור בממברנה) אפילו להפיק תועלת ממעבר מיתוג? האם החלפת מחלקות מתרחשת בכלל בתאי B מופעלים? או שזה תהליך מוגבל לתאי פלזמה? קראתי שגם ל-BCR יש את 5 האיזוטיפים.

מהן אבני הדרך הכרונולוגיות הספציפיות בהן מתרחשת החלפת מחלקה בתאי פלזמה ותאי B (אם כן)?


תשובה קצרה : מחלקה של תאי B עוברים להפוך לתאי פלזמה במרכז הנבט של בלוטת הלימפה.

תשובה ארוכה :

ישנם שני מושגים חשובים המתייחסים בשאלה. האחד הוא מבנה האימונוגלובולינים - איזוטיפ וסוג ממברנה/מסיס. והשני הוא הפרדיגמה של תאי B מרכז הנבט. הבנת שני המושגים הינה תנאי הכרחי להבנת התשובה לסוגיה.

קודם כל, אימונוגלובולין המסונתז על ידי הלימפוציט יכול להיות קשור לממברנה (הידוע כקולטן תאי B (BCR)) או נוגדן מסיס. לאחר סידורים מחדש של הגנים, תא B (עדיין לא בשל) מתחיל לייצר IgM/IgD הקשור לממברנה. זה ממשיך אפילו בתא ה- B הבוגר. ל- Ig או mIg הקשור לקרום יש רצף נוסף (עיין בתמונה) בקצה הקרבוקסילי ומוסיף כמה רצפי חומצות אמינו הידרופוביים כך שהוא מעוגן היטב בחלק ההידרופובי של הממברנה. כמו כן, בסוף היא סדרה של שאריות הידרופיליות המעורבות באיתות תאים במורד הזרם.

החלפת כיתות היא תהליך שמוביל לשינוי באיזוטיפ של Ig שהתא מייצר. החלפת מעמדות כוללת כריתה של DNA מה שמרמז שהתא לא יכול לחזור לייצור Ig פעם אחת. רצף מקטעי הגנים בגן השרשרת הכבדה הופך להיות חשוב.

כשיש חשיפה לראשונה לאנטיגן, תאי B הבוגרים עוקבים אחר פרדיגמה קלאסית לאנטיגנים תלויי תאי T, אשר מוצג בתמונה זו להלן.

החלפת מחלקות מתרחשת בתאי B המשתתפים בתגובת מרכז נבט, לאחר שתא ה- B הנאיבי הופעל על ידי אנטיגן ותא T מקושר. יש גם החלפת מחלקות עצמאית של מרכז נבט שאנחנו מתעלמים ממנו כאן.

לאחר שתא B עבר היפר -מוטציה סומטית והחלפת מחלקות של הגן האימונוגלובוליני שלו, יתכן שנבחר באופן חיובי להתמיין לפלסמאבלסט. פלזמבלאסטים מתרבים במהירות לפני התמיינות סופנית לתאי פלזמה, אשר מפרישים נוגדנים מבשילים בזיקה. אז במילים אחרות, ריקומבינציה של מתג כיתה מוגבלת במידה רבה לתאי B מופעלים במרכז הנבט. מתג מחלקות תאי B אלה, כאחד מתהליכים רבים לייצור תאי פלזמה המסיסים נוגדן.

תאי פלזמה ותאי B אינם רק אותו הדבר. תאי B עוברים סדרה של תהליכים ליצירת תאי הפלזמה שגם הם שונים במורפולוגיה.

כפי שכבר הוזכר, יש לזכור שהחלפת מחלקות כוללת כריתה של ה-DNA המתערב בין האקסון VDJ המאורגן מחדש לבין האקסונים הקבועים אליהם עוברים, כלומר הם נמחקים מהאלל. לפיכך, תא B שיש לו מחלקה עבר מ-IgM ל, למשל, IgG ימחק את האקסונים של השרשרת הכבדה של IgM ו-IgD על אותו אלל, ויוגבל ל-IgG (או ל-IgE ו-IgA, שנמצאים במורד הזרם).

אבל אז, אם תאי B הנושאים IgM כבר עברו את המעמד (למקבילים האפשריים שלהם במורד הזרם), כיצד יכולה התגובה החיסונית העיקרית להיות דומיננטית ב- IgM? כיצד נוגדנים מסוג IgM יכולים להגיע מתאי פלזמה מחליפים?

הסיבה לכך היא שכל המחזה המרכזי החיידקי לוקח זמן לקרות ובינתיים ישנם מנגנונים חוץ -פוליקולאריים של ייצור נוגדנים במקום במוקדים חוץ -פוליקולאריים בטחול או בחבלי המדולה של בלוטות הלימפה. מאחר שנוגדנים המתפתחים באופן תלוי במרכז החיידק (IgG) הם מתאים סופר -מוטציה סומטיים, יש להם זיקה רבה יותר לאנטיגן מאשר ל- IgM המיוצר על ידי פלזמבלסטים עצמאיים במרכז החיידק.

ל- BCR בדרך כלל יש רק שני סוגים, mIgM ו- mIgD. אם יש מעבר מחלקה, הם פונים לנוגדנים מסיסים (IgG/IgA/IgD).

נוגדן מפריש כאן מתייחס לנוגדן מסיס שיוצא מה-WBCs, לא ל-IgA שנמצא בהפרשות הגוף.

הפניה, קרדיט לתמונות:

  1. הטבע סוקר אימונולוגיה, מרכזי נבטים: תפקיד בפיזיולוגיה של תאי B וממאירות
  2. אימונולוגיה של קובי. מהדורה 6
  3. סקירות אימונולוגיות, תגובות נוגדנים חוץ פוליקולריים

תאי ויסות T זקיקיים

חשיפה לפתוגן גורמת לייצור נוגדנים בעלי זיקה גבוהה המעוררים על ידי תאי עוזר זקיק (Tfh) בתגובת המרכז החיידקי. תאי Tfh מספקים הן ציטוקינים קוסטימולציוניים והן ציטוקינים מעוררים לתאי B כדי להקל על התבגרות זיקה, רקומבינציה של מתג כיתה והתמיינות תאי פלזמה בתוך מרכז הנבט. בנסיבות רגילות, תגובת מרכז הנבט גורמת לנוגדנים המכוונים במדויק לפתוגנים זרים תוך הגבלת אוטואימוניות ודלקת מוגזמת. על מנת לקבל דרגה זו של שליטה, המערכת החיסונית מבטיחה כי עזרה בתאי B מסוג בתיווך Tfh מוסדרת באופן מקומי במרכז הנבט. תת-קבוצת ה-T follicular regulatory (Tfr) שזוהתה לאחרונה יכולה לנדוד למרכז הנבטים ולעכב את ההפעלה של תאי B בתיווך Tfh וייצור נוגדנים. למרות שהיבטים רבים של הביולוגיה של תאי Tfr עדיין אינם ברורים, הנתונים האחרונים החלו לתחום את התפקידים המיוחדים של תאי Tfr בשליטה על תגובת המרכז הנבט. כאן אנו דנים בהבנה הנוכחית של התמיינות ותפקוד תאי Tfr וכיצד ידע זה מספק תובנות חדשות לגבי הרגולציה הדינמית של מרכזי נבט, ומציע אסטרטגיות חיסון יעילות יותר ודרכים לטיפול במחלות מתווכות נוגדנים.

מילות מפתח: Tfh Tfr מרכז נבט הומורלי חסינות מווסת תאי T.


תאי B בוגרים שהועברו ל-IgD הם אוטו-ריאקטיביים אצל אנשים בריאים

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו -3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתובת כתובת: פטריק סי. וילסון, אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה, רחוב 825 NE 13, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה 73104, ארה"ב. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

מצא מאמרים מאת Koelsch, K. בתוך: JCI | PubMed | Google Scholar

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו -3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו -3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתובת כתובת: פטריק סי. וילסון, אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה, רחוב 825 NE 13, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה 73104, ארה"ב. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו -3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתובת כתובת: פטריק סי. וילסון, אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה, רחוב 825 NE 13, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה 73104, ארה"ב. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו -3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתובת כתובת: פטריק סי. וילסון, אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה, רחוב 825 NE 13, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה 73104, ארה"ב. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו -3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתובת כתובת: פטריק סי. וילסון, אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה, רחוב 825 NE 13, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה 73104, ארה"ב. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

מצא מאמרים מאת מתיאס, מ .: JCI | PubMed | Google Scholar

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתובת כתובת: פטריק סי. וילסון, אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה, רחוב 825 NE 13, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה 73104, ארה"ב. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתובת כתובת: פטריק סי. וילסון, אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה, רחוב 825 NE 13, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה 73104, ארה"ב. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו -3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, המרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתובת כתובת: פטריק סי. וילסון, אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי של אוקלהומה, רחוב 825 NE 13, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה 73104, ארה"ב. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

קביעת המקור והגורל של תאי B אוטו-ריאקטיביים היא קריטית להבנה וטיפול במחלות אוטואימוניות. אנו מדווחים כי למרות שמקורם באנשים בריאים, נוגדנים מתאי B שהחלפו ל- IgD באמצעות רקומבינציה גנטית (ובכך הופכים למחלקה לתאי Cδ [Cδ-CS]) מגיבים מאוד לאנטיגנים עצמיים. יותר ממחצית הנוגדנים מתאי Cδ-CS B נקשרים אוטואנטיגנים על תאי קו אפיתלומיה 2 (HEp-2) אנושיים או אנטיגנים אנטי-גרעיניים, ורבע נקשרים ל- DNA דו-גדילי שתי קבוצות הנוגדנים הן לעתים קרובות פולי-אקטיביות. למרבה הפלא, כמה תאי Cδ-CS B צברו שאריות בסיסיות באזורים המשתנים של נוגדנים המתווכים תגובתיות אנטי-דנ"א באמצעות היפר-מוטציה סומטית ובחירה, בעוד שתאים אחרים של Cδ-CS B הינם אוטוריאקטיביים באופן טבעי. למרות שהאחוז הכולל היה נמוך במידה ניכרת מאשר עבור תאי Cδ-CS, 31% מפתיעים מנוגדנים לתאי זיכרון IgG היו אוטו-ריאקטיביים במידה מסוימת, וכצפוי, כ-24% מהנוגדנים התאיים היו אוטו-ריאקטיביים. אנו מפרשים ממצאים אלה כדי להצביע על כך שניתן לגרום לתאי B autoreactive למעבר בכיתה ל- IgD או שתאי B autoractive שמשתמשים ב- IgD כקולטן תא B אינם נמחקים ביעילות. קביעת המנגנון שבו מרבית תאי Cδ-CS B הם אוטוריאקטיביים עשויה להיות חשובה בהבנת מנגנוני הסובלנות ההיקפיים ועשויה לספק תובנה לגבי הפונקציה האניגמטית של נוגדן IgD.

תאי B ספציפיים נשלטים בדרך כלל על ידי מחיקה משובטת (1, 2), עריכת קולטן (3, 4) ואנרגיה משובטת (5, 6). למרות מנגנונים אלה, לימפוציטים מסוג B המבטאים אימונוגלובולין פני השטח שיכולים להיקשר לאנטיגנים עצמיים נפוצים למדי ברפרטואר תאי B הבוגר (7, 8). רוב הידע אודות מנגנוני הסובלנות לתאי B נגזר מניסויים עם עכברים מהונדסים הנושאים נוגדנים עצמיים משולבים מראש פחות ידוע על גורלם של תאי B המגיבים עצמית בבני אדם. מכיוון שתאי B אוטו-ריאקטיביים עשויים להיות המבשרים ליצירת נוגדנים עצמיים פתולוגיים במחלות אוטואימוניות שונות כגון זאבת אדמנתית מערכתית (SLE) או דלקת מפרקים שגרונית, הבנת גורלם בבני אדם בריאים היא קריטית. מוצגות כאן עדויות לכך שאצל אנשים בריאים, תאי B שעוברים בכיתה לאיזוטיפ IgD הם בעיקר אוטוריאקטיביים.

בתאי B בוגרים שלא הופעלו על ידי אנטיגן (תאים נאיביים), נוגדני IgM ו- IgD מקודדים בו זמנית על ידי אקסונים Cμ ו- Cδ באמצעות שחבור mRNA דיפרנציאלי של תמליל יחיד של VDJ-Cμ-Cδ. לאחר ההפעלה, ניתן לגרום לתאי B נאיביים לעבור למעמד. מיתוג מחלקות אימונוגלובולין מתמחה בתפקוד הנוגדנים באמצעות החלפת אקסונים גנים IgM ו- IgD (Cμ ו- Cδ) באקסונים IgG (Cγ), IgA (Cα) או IgE (Cε) על ידי רקומבינציה גנטית. עם זאת, חלק קטן מתאי B (1%-3%) למעשה עוברים מחלקה מ- Cμ ל- Cδ ברמה הגנטית באמצעות אזורי מתג קריפטיים בין האקסונים Cμ ו- Cδ וכתוצאה מכך פנוטיפ IgM - IgD +. אלה מכונים כיתת תאי B המועברת לתאי Cδ (Cδ-CS) (9, 10) ונראה כי הם נבעו מתגובה חיסונית המופעלת על ידי אנטיגן מכיוון שניתן לבודדם כתאי GC, הם משובטים מאוד (מה שמרמז חלוקת תאים), ולגנים המשתנים יש מוטציות סומטיות נרחבות (11, 12). תאי Cδ-CS B גם מבטאים בעיקר שרשראות l-light ויכולים להתמיין לתאי זיכרון ותאי פלזמה (13, 14). השימוש השולט בשרשראות L-light מצביע על כך שרוב נוגדני ה-IgD המופרשים בסמים אנושיים (

1% מכלל הנוגדנים) הוא מתאי Cδ-CS B, שכן גם IgD בסרום מקודד בעיקר לשרשרת קלה (15). תאי Cδ-CS B משתמשים בתת-קבוצה של גנים באזור משתנה של אימונוגלובולינים הקשורים לאורך זמן עם אוטו-ריאקטיביות (16) וייתכן שהיו נתונים לעריכת קולטן במהלך התפתחות תאי B (12, 16, 17). תצפיות שונות אלה מצביעות על כך שתאי Cδ-CS B נוצרים על ידי מנגנון של סובלנות חיסונית או שהם מתחמקים מסבילות חיסונית. כאן יצאנו לקבוע אם אכן תאי Cδ-CS B פועלים באופן אוטומטי בבני אדם בריאים.

מצאנו שלימפוציטים מסוג Cδ-CS B אנושיים היו אוטו-ריאקטיביים, מכיוון שהם מקודדים לנוגדנים שלעתים קרובות קושרים תאי אפיתליומה אנושית קו 2 (HEp-2), אנטיגנים אנטי-גרעיניים (ANAs), DNA חד-גדילי (ssDNA), DNA דו-גדילי ( dsDNA), והם היו לעתים קרובות פולי -אקטיביים. בהתאם לדוח שנערך לאחרונה מאת טילר ועמיתיו, לתאי זיכרון IgG אנושיים הייתה תגובתיות עצמית בעצימות נמוכה והיו פולי-ריאקטיביים בתדירות גבוהה באופן מפתיע (8), אם כי התדירות והעוצמה של קישור האוטואנטיגן היו נמוכות משמעותית מאלו של תאי Cδ-CS B. . באופן מעניין, תגובתיות אנטי-DNA הקודדה באופן טבעי על ידי הגנים המשתנים ללא מוטציה או נרכשה במהלך תגובה חיסונית באמצעות מוטציות סומטיות. לפיכך, נוגדנים אנטי-דנ"א הנובעים כנראה מתגובה חיסונית עלולים להיווצר אצל אנשים בריאים. ממצאים אלה מספקים התקדמות חשובה בהבנת מנגנוני הסובלנות השולטים בתאי B המגיבים עצמית שעלולים להפריע בחולים עם מחלות אוטואימוניות.

קביעת הספציפיות של נוגדנים עצמיים של תאי Cδ-CS B. תאי Cδ-CS B הם שושלת ייחודית שנמצאת בשקדים ובדם שהם IgD + IgM - וניתן לבודד כתאים GC (CD38 +) או פלזמה (CD38 ++) משקדים אנושיים (11, 14) (איור 1A) או כתאי זיכרון (CD27 +) מדם היקפי (13) (איור 1 ב). על מנת לבדוק את הספציפיות של תאי Cδ-CS B, נוצרו נוגדנים חד שבטיים רקומביננטיות מגנים מהאזור המשתנה של תאים בודדים. השתמשנו באסטרטגיה שונה הדומה לזו שתוארה בדוחות קודמים (7, 18), שבה תאי B בודדים מוינו על ידי ציטומטריית זרימה לתוך צלחות של 96 בארים והגנים המשתנים הוגברו על ידי מרובה, RT-PCR חד תאי לזיהוי ושיבוט הגנים של השרשרת הכבדה והשרשרת הקלה של אימונוגלובולינים ממבחר אקראי של תאים (הגנים המשתנים שבהם נעשה שימוש מופיעים בחומר משלים בטבלה 1 הזמין באינטרנט עם מאמר זה doi:10.1172/JCI27628DS1). גנים משתנים אלה שוכפלו לאחר מכן לתוך וקטורי ביטוי ובאו לידי ביטוי באזורים קבועים של IgG בשורת התאים האנושית 293A. סך של 100 נוגדנים הופקו מתאי Cδ-CS GC B (IgD + IgM-CD38 + איור 1 א) המבודדים משלושה תורמי שקדים (על ידי תורם, נ = 45, 34 ו-21 נוגדנים) ובהשוואה ל-78 נוגדנים מתאי B תמימים מ-3 תורמים (IgD + IgM + CD38 - לפי תורם, נ = 37, 27 ו-14 נוגדנים) ו-64 נוגדנים מתאי זיכרון IgG מ-4 תורמים (IgD – IgM – CD27 + על ידי תורם, נ = 25, 12, 7 ו -20 נוגדנים). ראוי לציין כי תאי B נאיביים כהגדרתם כאן הכילו אולי אוכלוסייה קטנה של תאי B שהיו תאי מעבר אך עדיין ייצגו בעיקר את הרפרטואר הנאיבי של תאי B אנושיים.היה חשוב להימנע מזיהום תאי B הנאיביים בתאי זיכרון IgM + D+ - מכיוון שתאי זיכרון IgM מבני אדם הם לעתים רחוקות אוטו-ריאקטיביים (19), זיהום יגרום לנו להמעיט בערכו של התדירות האמיתית של נוגדנים עצמיים שזוהו. בנוסף לניתוח תאי CD27, כדי למנוע עוד יותר מזיהום תאי זיכרון IgD + IgM +, השתמשנו רק בנוגדנים מהתאים התמימים שלא היו להם מוטציות סומטיות (כלומר, שהיו להם פחות מתדירות הרקע של חילופי בסיס 1 לכל גן משתנה) . הזהות של תאי Cδ-CS B הממוינים אומתה על סמך מאפיינים ידועים של רפרטואר הגנים המשתנה כולל מוטציות סומטיות נרחבות (איור 1C) (11) ושימוש שופע ב-Jח6 קטע גנים (איור 1D) (16). התעניינו לדעת האם, כפי שנחזה על ידי הממצאים של קליין ועמיתיו (13), גנים משתנים מתאי זיכרון דם היקפיים Cδ-CS דומים לתאי Cδ-CS GC ותאי פלזמה. ואכן, לגנים משתנים המשוכפלים באקראי מתאי זיכרון Cδ-CS היו גם מוטציות סומטיות מוגזמות והעדפה לשימוש ב- J הקשור לאוטואימוניות.ח6 מקטע גנים (איור 1, C ו-D) (7, 16, 20). כפי שמתואר להלן, נוגדנים מתאי זיכרון Cδ-CS GC, תמימים ו-IgG נבדקו עבור תגובתיות לתאי HEp-2 על ידי אימונופלואורסצנטי וקשירה ל-ANA על ידי מבחני אימונוסורבנט מסחריים ונבדקו על ידי ELISA עבור תגובתיות ל-DNA או לריאקטיביות.

פנוטיפ של תאי Cδ-CS B. (א ו ב) שערי מיון ציטומטריית זרימה המשמשים לבידוד סוגי תאי B השונים שנותחו מדם או שקדים, כולל תאי Cδ-CS GC (IgD + IgM - CD38 + ), תאי B תמימים (IgD + IgM + ו-CD38 - שקדים או CD27 - דם ), ותאי זיכרון B (IgD - CD27 + מתיבה "זיכרון" ב ב). מחשב, תא פלזמה. ניתוח של תדירות מוטציות סומטיות (ג) והשימוש ב- Jח6 מקטע גנים (ד) להדגים שכל תת-קבוצות תאי Cδ-CS B ואלו המובעים כאן ייחודיים באופן דומה מתאי IgG ו-IgM B. (ג) מוצג האחוז של Vח גנים עם מספר המוטציות המצוין עבור כל תת-קבוצה שניתחה. (ד) שימוש במגוון Jח מקטעי גנים. כלולים תעתיקים מ-625 גנים משתנים של תאי Cδ-CS GC מ-11 תורמים (לפי תורם, נ = 44, 44, 57, 44, 62, 34, 225, 59, 16, 21 ו-19), 78 גנים משתנים של תאי פלזמה Cδ-CS מתורם אחד, 124 גנים משתנים של תאי זיכרון Cδ-CS מ-4 תורמים (על ידי תוֹרֵם, נ = 20, 20, 28 ו- 56), 620 IgG GC, זיכרון ותאי פלזמה מגנים משתנים מ -14 תורמים (לפי תורם, נ = 18, 28, 174, 40, 108, 37, 25, 21, 18, 22, 15, 24, 19 ו -71), 681 IgM GC, זיכרון ותאי פלזמה גנים משתנים מ -18 תורמים (לפי תורם, נ = 18, 91, 51, 158, 17, 10, 16, 48, 30, 19, 28, 11, 36, 29, 13, 22, 20 ו-64), ו-267 גנים משתנים תמימים מ-6 תורמים (לפי תורם) , נ = 47, 30, 24, 15, 24 ו-127).

נוגדנים שמקורם בתאי Cδ-CS B קושרים אנטיגנים עצמיים. מבחן ה- HEp-2 Slide הוא מבחן האבחון הקליני הקלאסי המשמש לאיתור אוטוריאקטיביות ומחייבות ANA על ידי נוגדני סרה כפי שניתן לראות במחלות אוטואימוניות כגון SLE. Assay זה מעסיק את השימוש בתאים מקו תאי האפיתליום האנושי המודבק לשקופית מיקרוסקופ, ולאחר מכן זוהה על ידי אימונופלואורסצנטי לאחר הדגירה עם הסרה (21). כדי לקבוע אם נוגדנים מתאי Cδ-CS B נקשרים לאנטיגנים עצמיים בתדירות גבוהה יותר מאלה של תאים B נאיביים או זיכרוןיים, נוגדנים מכל אוכלוסייה נבדקו לגבי תגובתיות לאנטיגנים בקו התא HEp-2. בנוסף, כל הנוגדנים נבדקו לצורך קישור ל- ANA באמצעות מבחן חיסוני חיסוני מסחרי המיועד לאיתור תגובתיות ANA קלינית (ערכת QUANTA Lite ANA, INOVA Diagnostics Inc.). נוגדנים שהייתה להם כריכה ניתנת לגילוי גדולה מזו של סרטן שליטה שלילית במבחן החיסוני החיסוני HEp-2 זכתה לחיוב. עבור assay ANA, נוצר ערך ספיגה שאיפשר הערכה כמותית יותר. מכיוון שהתאים הנאיביים היו אוכלוסיית הביקורת, חשבנו שנוגדנים חיוביים ל- ANA אם הם מייצרים ספיגה בריכוז של 25 מיקרוגרם/מ"ל שהיו גדולים מהממוצע ± SD של הספיגה של כל הנוגדנים לתאים נאיביים. ממוצע ± ספיגת SD של הנוגדנים הנאיביים היה 0.4293 ± 0.2235 OD415כך שלבדיקות חיוביות היו ספיגות של 0.6829 ומעלה. דיווחים קודמים הוכיחו כי בריכוזים של 25 עד 50 מיקרוגרם/מ"ל, כ-70% מהנוגדנים מתאי B לא בוגרים מוקדם (לפני הבחירה) קושרים אנטיגנים של תאי HEp-2, בעוד שרק 18% מהנוגדנים מתאי B נאיביים בוגרים תגובתיות ניכרת של HEp-2 (7). מצאנו תדירות דומה של נוגדנים תגובתיים ל- HEp-2 ו- ANA מתאים נאיביים שנבדקו (16 מתוך 70, או 23% איור 2 א). באופן מפתיע, אך עקבי עם דיווח אחרון על תגובתיות של נוגדני IgG אנושיים (8), 27% (17 מתוך 64) מהנוגדנים מתאי זיכרון IgG B היו תגובתיים ל-HEp-2 או ANA. לעומת זאת, 60% (53 מתוך 89) מהנוגדנים שמקורם ב-Cδ-CS הגיבו עם אנטיגנים HEp-2 או ANA. העלייה בתדירות נוגדנים תגובתיים לתאי HEp-2 מתאי Cδ-CS בהשוואה לאלו של תאים נאיביים או תאי זיכרון IgG הייתה משמעותית ביותר הן כאשר כל הנוגדנים הושוו כמכלול (איור 2 א 2, פ & lt 0.0001) ובהשוואה לתדירות ממוצעת בין התורמים (איור 2 ב 'של סטודנטים t מִבְחָן, פ & lt 0.05 לעומת נוגדנים נאיביים או IgG).

נוגדנים מתאי Cδ-CS B הם לעתים קרובות אוטו-ריאקטיביים. (א) נוגדנים שמקורם ב- Cδ-CS מגיבים מאוד לאנטיגנים HEp-2 ו- ANA בהשוואה לנוגדנים נאיביים ונגיפים מסוג IgG. נוגדנים שנבדקו כללו 89 נוגדנים Cδ-CS (מ-3 תורמים, נ = 37, 18 ו- 34), 70 נוגדנים תאי B תמימים (מ -3 תורמים, נ = 39, 14 ו -17), ו -64 נוגדנים מתאי זיכרון IgG (מ -4 תורמים, נ = 25, 5, 12 ו- 20). התדירות של נוגדנים תגובתיים ל- HEp-2 נקבעה על ידי סינון הנוגדנים על ידי אימונו-פלואורסצנטיות באמצעות שקופיות HEp-2 שהוכנו באופן מסחרי (איור משלים 1), ותדירות נוגדנים תגובתיים של ANA באמצעות מבחני חיסוני ANA מסחריים (ראה שיטות). נוגדנים שקשרו את שקופיות HEp-2 באופן אינטנסיבי יותר מאשר סרומי בקרה שליליים שסופקו על ידי היצרן או שקשרו את ANA באופן אינטנסיבי יותר מהממוצע ± SD של כל הנוגדנים התאים הנאיביים נחשבו חיוביים בשני המבחנים. התוצאות הצביעו על כך ששכיחות האוטור-אקטיביות הייתה גבוהה יותר באופן משמעותי בנוגדנים שמקורם ב- Cδ-CS מאשר בנוגדנים נאיביים או IgG (χ 2, פ < 0.0001). (ב) תדירות תגובתיות HEp-2 ו- ANA על ידי התורם. נוגדני Cδ-CS נקשרו לעתים קרובות יותר מאשר IgG או נוגדנים נאיביים שמקורם בתאים (התלמידים t מִבְחָן, פ < 0.05). (ג) למרות שתאי IgG היו בדרך כלל יותר תגובתיים במבחני ANA מאשר תאים תמימים, התגובתיות הייתה בעוצמה נמוכה. לעומת זאת, יותר נוגדנים מסוג Cδ-CS נקשרים ל- ANA בעוצמה גבוהה. קווים אדומים מצביעים על ספיגות מחייבות ANA ממוצעות. קווים מקווקווים מציינים את ספי הציון החיובי (קו מקווקו תחתון מציין ANA + כלומר ממוצע התא הנאיבי ± קו מקווקו עליון SD מציין גבוה ANA) רמת הספיגה הגבוהה הושגה בשכיחות רבה יותר עבור נוגדני Cδ-CS.

נוגדני Cδ-CS נקשרים גם ל- ANA (איור 2C) ולאנטיגנים HEp-2 (איור משלים 1) בעוצמה גדולה יותר מאשר נוגדני תאי הזיכרון הנאיביים או IgG. 11 אחוז מהנוגדנים Cδ-CS שנבדקו קשרו ANA בעוצמה גבוהה במיוחד (ANA high ) בהשוואה ל-3% מה-IgG ואף אחד מהנוגדנים התמימים (איור 3C χ 2 , פ = 0.05). ראוי לציין שכמחצית מנוגדני ה-IgG היו בעלי קשירה נמוכה לאנטיגנים ANA שהייתה גדולה מזו של הנוגדנים הנאיביים אך לא מעבר ל-SD של הממוצע ולכן קיבלו ציון שלילי. לאחרונה הוכח כי תגובתיות קלה זו של תאי זיכרון IgG נובעת ממוטציות סומטיות שהצטברו (8) וגרמה לספיגה ממוצעת מוגברת הכוללת. לתאי Cδ-CS בתורו הייתה עוצמת הקישור ANA הממוצעת הגדולה ביותר (איור 2C 0.4593 ± 0.2235 OD415 עבור תאים תמימים, 0.6691 ± 0.5092 OD415 עבור IgG ו- 0.8004 ± 0.6906 OD415 עבור נוגדנים Cδ-CS). לבסוף, האוטואנטיגנים של HEp-2 הקשורים היו משתנים וכללו דפוסי ציטופלזמה כמו גם דפוסי ANA קלאסיים (איור משלים 1), ולכן התגובתיות העצמית אינה מכוונת לאוטואנטיגן בודד. לסיכום, נוגדנים מתאי Cδ-CS B נקשרים בדרך כלל אנטיגנים שונים בתאי HEp-2 ובמבחני ANA מסחריים, מה שמדגים שהם בדרך כלל אוטוריאקטיביים.

ההיקשרות ל- ssDNA, dsDNA, LPS או אינסולין על ידי הנוגדנים המתבטאים נמדדה על ידי ELISA. מידת הקישור לצלחות מיקרוטיטר מצופות אנטיגן (ספיגה [OD415]) נמדד בריכוזי נוגדנים של 6.67 × 10–8, 1.67 × 10–8, 4.17 × 10–9, ו -1.04 × 10–9 M (שהם 1 מיקרוגרם/מ"ל ושלוש דילולים סדרתיים פי 4, איקס צִיר). כל ELISA כוללים 3H9 (קווים אדומים עם יהלומים) ו- H241 (קווים אדומים עם ריבועים) נוגדנים חד שבטיים עם אנטי-דנ"א גבוהים או בינוניים, בהתאמה. המבחנים נורמלו על סמך יכולת הספיגה של הנוגדן 3H9. אחוזים מציינים את מספר הנוגדנים שקיבלו ציון חיובי. בסך הכל 78 נוגדנים מתאי B תמימים מבודדים משלושה תורמים (על ידי תורם, נ = 37, 27 ו -14 נוגדנים) הושוו עם 100 נוגדנים מתאי Cδ-CS B משלושה תורמים (לפי תורם, נ = 45, 34 ו -21 נוגדנים) ו -64 נוגדנים מתאי תאי זיכרון מ -4 תורמים (לפי תורם, נ = 25, 12, 7 ו -20 נוגדנים). קווים כחולים מייצגים את הספים החיוביים המשוערים שנקבעו על ידי חישוב ממוצע ± 2 SD של הנוגדנים הנאיביים (ראה תוצאות).

נוגדנים מתאי Cδ-CS B אנושיים נקשרים לעתים קרובות ל-DNA חד-גדילי ודו-גדילי. סימן ההיכר של פעילות אקטיבית ב- SLE הוא ייצור נוגדנים המגיבים ל- DNA, במיוחד dsDNA. על מנת להעריך עוד יותר את התגובתיות האוטומטית הפוטנציאלית של שושלת Cδ-CS בהשוואה לתאי זיכרון B נאיביים או IgG, קישור DNA הוערך על ידי ELISA. כריכת DNA נבדקה עבור הנוגדנים השונים ב 1 מיקרוגרם/מ"ל ו -3 דילולים סדרתיים נוספים פי 4. עקומות מחייב הרוויה מוצגות באיור 3. זיקה מחייבת אנטי- DNA נקבעה על ידי התאמת עקומות. נוגדנים עם ספיגה מחושבת עבור ריכוז 1 מיקרוגרם/מ"ל שהיו 2 SD מעל הספיגה הממוצעת של 95% מהנוגדנים התמימים בריכוז זה, קיבלו ניקוד כחיובי נגד DNA (איור 3). לשם השוואה באמצעות אותה מערכת ביטוי, הגנים המשתנים המקודדים ל-2 נוגדנים מאופיינים היטב המשמשים בדרך כלל לחקר תגובתיות אנטי-DNA הופקו כמונוקלונלים רקומביננטיים של עכבר/אדם IgG-κ (איור 3), כולל 3H9, המשמשים כטרנסגן. לגלות עריכת קולטן (3), ו-H241 (22). לפיכך, ניתן היה להשוות ישירות את הנוגדנים האנטי-DNA והפולי-ריאקטיביים הללו עם ריאגנטים זהים לזיהוי לנוגדנים האנושיים שנבדקו כאן. כל ה-ELISA נורמלו לנוגדן הבקרה 3H9 שנכלל בכל צלחת ELISA.

נוגדנים המגיבים ל- ssDNA שכיחים יותר בקרב אנשים עם מחלות אוטואימוניות מאשר אצל אנשים בריאים, אולם הם אינם מאבחנים מצב פתולוגי. כפי שצוין באיור 3, 8 מתוך 78 (10%) מהנוגדנים שנוצרו מתאי B תמימים היו מגיבים ל-ssDNA. זה עולה בקנה אחד עם דו"ח קודם של Wardemann et al. בהם נותחו נוגדנים מ-93 תאי B תמימים, מתוכם כמה קשרו ssDNA (7). תדירות גבוהה יותר (9 מתוך 64, או 14%) של נוגדנים מתאי זיכרון IgG קשרו ssDNA. לעומת זאת, 21% (21 מתוך 100) מנוגדני Cδ-CS הגיבו ל- ssDNA (איור 3, 2, פ = 0.05 עבור Cδ-CS לעומת נאיבי פ = לא משמעותי עבור Cδ-CS לעומת זיכרון IgG).

נוגדנים חשובים יותר מאשר נוגדנים ל- ssDNA הינם נוגדנים ל- dsDNA, כיוון שהם יותר מעידים על פתולוגיה (23, 24). נוגדנים המגיבים ל- dsDNA היו פחות תכופים מתאי B (6%או 5 מתוך 78) ותאי B מסוג זיכרון IgG (14%, 9 מתוך 64 איור 3) מאשר מתאי Cδ-CS B. נוגדנים מתאי Cδ-CS היו בעלי סיכוי גבוה פי 2 לקשור dsDNA מאשר נוגדנים מתאים נאיביים (21 מתוך 100, או 21% χ 2, פ = 0.006 עבור Cδ-CS לעומת נאיבי). שוב, מכיוון שנוגדני IgG נוטים להיות פולי-אקטיביים במידה מסוימת (8), אם כי 50% עלו, נוגדני Cδ-CS לא נקשרו ל- dsDNA באופן משמעותי יותר. השונות בין התורמים לכל מבחני האוטור -אקטיביות מתוארת באיור 4 א. כפי שצוין בעבר על ידי טילר ועמיתיו, לתא הזיכרון של IgG יש רמות שונות מאוד של תגובתיות אנטי-DNA (8). נוגדנים שקושרים dsDNA נבדקו גם לקשירה לקינטופלסטים של Crithidia luciliae, מכיוון שמבחן זה מחמיר יותר ונחשב לתקן הזהב לאיתור תגובתיות dsDNA באבחון הקליני של SLE. באופן כללי, הייתה התאמה טובה לתוצאות שלנו מה- ELISA, בכך שנוגדנים בעלי זיקה גבוהה יותר ל- dsDNA על ידי ELISA קשורים גם הם קריטידיה kinetoplasts (נתונים לא מוצגים). לפיכך, בדומה לתוצאות מבחני ה-ELISA, אחד מהנוגדנים התמימים וכמה מנוגדני IgG אנטי-DNA קשורים קריטידיה קינטופלסטים בעלי עוצמה גבוהה ועוד אחד מנוגדני ה- IgG היו בעלי קשר קל לגילוי קל. כמו כן, כפי שנחזה על ידי מבחני ELISA, 10 מנוגדני Cδ-CS נקשרו קריטידיה לקינטופלסטים ולכמה אחרים היו קשירה ניכרת אך בעוצמה נמוכה. מניסויים אלה, אנו מסיקים שתאי Cδ-CS B מגיבים לעתים קרובות יותר ל-ssDNA ו-dsDNA מאשר תאי B תמימים, ותאי Cδ-CS B נוטים להיות תגובתיים יותר מנוגדני IgG.

שונות בין התורמים ותדירות הפוליאקטיביות. (א) ממוצע ± SEM לתורמים עבור המבחנים השונים שבוצעו. (ב) אחוז הנוגדנים מכל קבוצה (תאי B Cδ-CS, תאי B תמימים, או תאי זיכרון B של IgG) שקושרו 0-1, 2, 3 או כל 4 האנטיגנים שנבדקו (ssDNA, dsDNA, LPS ואינסולין) . פולי -אקטיביות מוגדרת כקישור של יותר מ -1 אנטיגן. החלק הצהוב של התרשים מציין את האחוז שנקשר לאנטיגן אחד ולכן לא היו פולי-ריאקטיביים. מובהקות סטטיסטית (χ 2, פ = 0.04) הושגה עבור Cδ-CS לעומת נוגדנים תאי B תמימים.

נוגדנים מתאי Cδ-CS B הם בדרך כלל פולי-אקטיביים. כדי לקבוע אם תאי Cδ-CS B נוטים לבטא נוגדנים פולי-ריאקטיביים המקיימים אינטראקציה עם מספר אנטיגנים עצמיים ולא-עצמיים, בדקנו גם תגובתיות לאינסולין אנושי רקומביננטי וליפופוליסכריד ה. coli. כפי שצוין באיור 4B, יותר תאי Cδ-CS משמעותית-מאשר נוגדנים נגזרים של תאים-הציגו פולי-ריאקטיביות, אך לא יותר מאשר נוגדנים שמקורם בתאי IgG. בעוד 20% (20 מתוך 100) מהנוגדנים שמקורם בתאי Cδ-CS קשרו לפחות 2 מהאנטיגנים על ידי ELISA, פחות פחות נוגדנים מתאי נאיביים (9% או 7 מתוך 79 χ 2, פ = 0.039) אינטראקציה עם 2 או יותר אנטיגנים. עבור תאי זיכרון IgG שכיחות הפולי-ריאקטיביות הייתה נמוכה מזו של Cδ-CS (16% לעומת 20%, או 10 מתוך 64 מול 20 מתוך 100) אולם לא הושגה משמעות. לסיכום, נוגדנים מתאי B אשר התחלפו בכיתה ל-IgD או IgG היו בדרך כלל פולריאקטיביים.

בסך הכל, בהתחשב בתדירות הגבוהה של תגובתיות HEp-2 ו- ANA ותדירות אנטי-דנ"א ופולי-ריאקטיביות, הגענו למסקנה כי 56% נוגדני Cδ-CS היו אוטואקטיביים. לפיכך תאי Cδ-CS היו בתדירות אוטומטית של פי 2 יותר מנוגדנים לתאים תמימים (24% אוטו-ריאקטיביים, χ 2 , פ & lt 0.0001) פי 1.8 יותר מאשר נוגדנים שמקורם בתאי IgG (31% אוטוריאקטיביים, χ 2, פ < 0.001). מניתוח זה, הסקנו שתאי Cδ-CS B הם בדרך כלל אוטו-ריאקטיביים.

מיתוג IgD מתרחש הן בתאי B עם נוגדנים עצמיים טבעיים והן עבור תאים עם פעילות אקטיבית הנוצרת על ידי היפר -מוטציות סומטיות. יתכן כי מעבר קלאסי ל- IgD התרחש רק עבור פעילות אקטיבית שהוצגה במהלך תגובות חיסוניות בשל מוטציות סומטיות מוגזמות האופייניות לתאי Cδ-CS B (איור 1C) (11). דיווח עדכני של טילר ועמיתיו מצא תדירות גבוהה באופן מפתיע של תאי זיכרון B מסוג IgG שהם פוליריאקטיביים, והתגובתיות נגרמה בדרך כלל מהיפרמוטציות סומטיות שהצטברו (8). לחלופין, סביר שמעבר כיתה ל- IgD עשוי להתרחש לפני מוטציה סומטית וללא תלות בתגובת GC רגילה. בהתאם להשערה זו, הוכחנו בעבר שתאי Cδ-CS B צוברים מוטציות סומטיות ממוקדות המשבשות את האוטורקטיביות הטבעית של נוגדנים המקודדים על ידי ה- Vחקטע גנים 4-34 (16). ממצא זה הצביע על כך שהצטברות של היפר-מוטציות סומטיות מוגזמות בגנים המשתנים של תאי Cδ-CS B עשויה לנבוע מלחץ סלקטיבי לשינוי חומצות אמינו הגורמות לאוטוראקטיביות טבעית, כמו גם להגברת הזיקה לאנטיגנים זרים. על מנת לקבל תובנה לגבי מקורם של תאי B אוטו-ריאקטיביים שהועברו בכיתה ל-IgD, אפיינו את תפקידה של מוטציה סומטית בתיווך האוטו-ריאקטיביות. העובדה ש-11 מתוך 100 (11%) מנוגדני Cδ-CS שהובעו היו מגנים משתנים ללא מוטציה אפשרה לנו לקבוע אם תאי B שהוחלפו ל-IgD יכולים להיות בעלי אוטו-ריאקטיביות טבעית (לא בגלל מוטציות). שים לב שהגנים המשתנים המקודדים לתמלילים אלה היו דומים אחרת לזה של רוב נוגדני Cδ-CS עם שימוש מועדף ב-Jח6 מקטע גנים, אזורים 3 הקובעים השלמה ארוכה [CDR3s], ושימוש בשרשרת קלה (נתונים לא מוצגים). כפי שצוין באיור 5A, התדרים של אוטריאקטיביות אנטיגן HEp-2, התחברות ל- dsDNA ופולי-תגובתיות היו דומים בנוגדנים מוטציות ובלתי מוטציות מתאי Cδ-CS B והיו גבוהים יותר מתדירות נוגדנים עצמיים מתאי נאיבים ותאי זיכרון IgG . ניתוח זה גם סיפק אימות כי שיבוטי Cδ-CS אלה עם גנים ללא מוטציה באזור משתנה אינם מזהמים תאים תמימים. בנוסף, השוואת כותרות אנטי-דנ"א עם תדירות החלפות חומצות האמינו הצביעה על כך שאין מתאם בין הזיקה ל- dsDNA לבין הצטברות של מוטציות סומטיות, שכן טיטרים אף נוטים להיות גבוהים יותר עבור מספר השיבוטים ללא מוטציות (איור 5 ב) ). מתצפיות אלה, הגענו למסקנה כי מחלקת התאים שהוחלפה ל- IgD יכולה לבטא נוגדנים אוטואקטיביים (המקודדים על ידי germline) באופן טבעי ללא תלות בהיפרמוטציה סומטית.

Cδ-CS יכול להופיע עבור תאים המבטאים נוגדנים אוטו-ריאקטיביים (טבעיים) של קו הנבט, כמו גם כאלה שרכשו תגובתיות אוטומטית באמצעות מוטציות סומטיות. (א) נוגדני Cδ-CS המקודדים על ידי גנים משתנים ללא מוטציה (קו הנבט) מציגים רמות של תגובתיות אוטומטית של HEp-2, קישור ל-DNA ופוליריאקטיביות הדומות לאלו של גנים משתנים שעברו מוטציה סומטית. מוצגים אחוזי הנוגדנים מכל תת-אוכלוסיה. (ב) עקומות מחייבות של 1 מיקרוגרם/מ"ל נוגדני אנטי-DNA מתאי Cδ-CS B ל-DNA שימשו לחישוב ספיגה (נקודות כחולות).השוואה בין ספיגות אלו לבין תדירות החלפות חומצות האמינו (ברים אדומים) הראתה כי אין מתאם בין הזיקה ל- dsDNA לבין הצטברות מוטציות סומטיות. הגנים המשתנים של שיבוטים 14 ו -17 (כוכביות) הוחזרו לרצפי קו החיידקים שלהם כדי לקבוע אם המוטציות הסומטיות עלולות לגרום לקשירת DNA. (ג) הקישור ל-DNA אובד כאשר 2 נוגדנים אנטי-DNA Cδ-CS (שיבוט 14, שיבוט מרובע כחול 17, עיגול כחול) באו לידי ביטוי מגנים משתנים שהוחזרו לרצפים ללא מוטציה של קו הנבט (שיבוט 14, שיבוט ריבועי שחור 17, עיגול שחור). הכריכה נגד DNA הוערכה על ידי ELISA (ספיגה [OD415]) ביחס לנוגדן החד שבטי 3H9 בעל שליטה גבוהה ל- DNA (קו אדום). GL, germline.

ארגינין נחשב לשריד החשוב ביותר לקשירת אנטי- DNA (25, 26). הנוגדנים בעלי תגובתיות טבעית ל- DNA ולמספר הנוגדנים האחרים הכניסו ארגינינים ל- CDR3 על ידי רקומבינציה של VDJ (שיבוטים Cδ-CS 1 ו- 2 היו germline, שימו לב גם כי ארגינינים הוכנסו ל- CDRs של שיבוטים 4, 6, 8 , 10, 11, 12, 14 ו- 21 איור משלים 2). תצפית חשובה הייתה שלרוב שיבוטים Cδ-CS עם תגובתיות אנטי- DNA היו גם ארגנינים שהוכנסו בגלל שינויי קודון שנבעו ממוטציה סומטית (איור משלים 2). למעשה, ל-15 מתוך 22 (68%) מהשיבוטים המקושרים ל-Cδ-CS dsDNA הללו היו עד 7 ארגינינים שהוכנסו על ידי מוטציה לשרשראות הכבדות ו/או הקלות (לשיבוט 18 הוצגו הכי הרבה ארגינינים איור 2). זה הציע כי ייתכן שהפעילות הסמכותית שראינו התעוררה כתוצאה ממוטציות סומטיות שהוצגו במהלך תגובות החיסון. על מנת לחקור אפשרות זו, יצרנו וביטאנו את המקבילים ללא מוטציה של הגנים המשתנים של 2 מנוגדנים אנטי-DNA מתאי Cδ-CS (שיבוטים 14 ו-17 איור 5B). אף אחת מהווריאציות הבלתי מוטציות קשרה את ה- dsDNA, והדגימה שהתגובתיות האנטי-דנ"א שראינו התעוררה כתוצאה מהיפר-מוטציה סומטית (איור 5C). לפיכך, נוגדנים אנטי- DNA הגורמים בסופו של דבר למחלות אוטואימוניות עלולים להתעורר בדרך כלל כתוצאה מתגובות חיסון ספציפיות לאנטיגן אצל אנשים בריאים. ביחד, ניתוחים אלה מצביעים על כך שתאי Cδ-CS B יכולים להיות אוטו-ריאקטיביים באופן טבעי או שהאוטו-תגובתיות שלהם יכולה להתעורר עקב שינויים בחומצות אמינו המוכנסות על ידי היפרמוטציה סומטית.

קיימות מספר אפשרויות לשיעורים הגבוהים של תגובתיות עצמית המצויים בתאי Cδ-CS B. הוא האמין כי המעבר למחלקה ל- IgD ולתאי Cδ-CS B המתקבלים מתעוררים במהלך תגובות GC מכיוון שהם בדרך כלל מבטאים גנים משתנים בעלי מוטציה גבוהה, הם מורחבים משובטים, והם יכולים להיות מבודדים רק כתאי GC, זיכרון או תאי פלזמה (11 , 13, 14, 16). לא הצלחנו להבחין אם תאי B שהם אוטו-ריאקטיביים מושרים לעבור מחלקה ל-IgD או אם תאי B המבטאים IgD שהם אוטו-ריאקטיביים נבחרים באופן מועדף. בכל מקרה, ניתן לדמיין מספר מודלים היפותטיים. ראשית, יתכן שיש מנגנון מכוון שבאמצעותו אזור מתג Cδ הקריפטי ממוקד בתאי B אנושיים מופעלים אשר מגיבים בעצמם. ייתכן שמנגנון כזה התפתח כדי להציל תאי B אוטו-ריאקטיביים עבור תפקיד מיוחד או מופחת בחסינות המערבת IgD. מעניין לשקול כי הפונקציה החמקמקה של IgD עשויה להיות מעורבת באופן ייחודי בסובלנות עצמית (נסקרת בפניה 15). עם זאת, ניתוחים של עכברים מהונדסים המבטאים IgD או IgM בלבד כנוגדנים אוטואליים מצאו הבדל קטן בין IgD ו- IgM בסובלנות תאי B או בחירה שלילית (27). למעשה, מספר מחקרים מצביעים על כך ש- IgD מגביר את איתות ה- IgM לבחירה חיובית של תאי B לרפרטואר התפקודי (נסקרו בפניות 15 ו -28). עם מחקרים אלה בחשבון, ניתן לדמיין מספר מודלים אחרים שבהם ל-IgD אין תפקיד ספציפי בסובלנות. אחת האפשרויות היא שתאי B אוטוריאקטיביים עשויים להיות מעוכבים ממעבר המעבר לאיזוטיפים Ig במורד הזרם (כלומר, IgG, IgA, IgE), ומשאירים רק את אזור מתג Cδ ההצפנה זמין למתג בתאים שקשרו בעבר אנטיגן עצמי. עיכוב זה של החלפת מעמדות עשוי להתרחש כביטוי של אנרגיה. שני המודלים לעיל מעניינים מכיוון שכל אחד מהם מציע שמנגנוני סובלנות יכולים לשלוט ישירות על מתג מחלקת אימונוגלובולינים.

השערה חלופית היא שמעבר מחלקה ל-IgD הוא אקראי (כלומר, כל תא יכול לעבור), ושבחירה של תאי Cδ-CS B מתרחשת לאחר החלפת מחלקה, מה שגורם להישרדות מועדפת של השיבוטים האוטו-ריאקטיביים. לדוגמה, הוצע כי בהשוואה לקולטני IgM בלבד, ביטוי של IgD מספק הישרדות מועדפת (29) וגיוס של תאי B לתגובות חיסוניות שעשויות לאפשר הצלה על ידי גירוי כרוני עם אנטיגן עצמי (30). הסבר אפשרי נוסף הוא שכאשר הוא מגורה על ידי אנטיגנים עצמיים או ללא האותות הנלווים הנדרשים בדרך כלל, ביטוי של IgD רק על פני תאי B עלול לא לגרום למוות של תאי B. הבהרת המנגנון האמיתי הגורם לתאי Cδ-CS B להיות אוטוריאקטיביים עשויה לספק תובנות חשובות לגבי תפקידו של IgD כקולטן לתאי B ולמנגנונים היקפיים של סובלנות חיסונית.

תאי B זיכרון IgG מבטאים בדרך כלל נוגדנים עצמיים בעלי זיקה נמוכה (8), בעיקר כתוצאה משינויים ממוטציות סומטיות שהצטברו. במחקר שלנו, ל -31% מנוגדני ה- IgG הייתה פעילות אקטיבית ניתנת לגילוי. ראוי לציין כי ניתוחים אחרונים מצאו כי נוגדנים מתאי IgM + זיכרון B היו לעיתים רחוקות אוטואקטיביות, אך כאשר נמצאה אוטוריאקטיביות היא נגרמה על ידי מוטציות סומטיות שהצטברו (19). באופן דומה, רוב התגובה האוטומטית הנראית בתאי IgG + זיכרון B מאנשים בריאים נגרמת על ידי מוטציות סומטיות (8). ידוע שתאי IgG + זיכרון B צברו בקירוב פי 2 מהתדירות של מוטציות נקודתיות כמו תאי זיכרון IgM (31) ובהתאמה הם לעתים קרובות יותר אוטו-ריאקטיביים (8). תאי Cδ-CS B בתורם צברו הכי הרבה מוטציות נקודתיות, בממוצע של 21 ± 7 חילופי בסיס לכל Vח הגן לעומת 14 ± 5 ​​לגן עבור IgG ו- 8 ± 4 מוטציות לגן עבור IgM GC ותאי זיכרון (איור 1C). במקביל, תאי Cδ-CS B הם גם הפעילים באופן אוטומטי לרוב, אם כי בניגוד לתאי זיכרון IgG ו- IgM, 10% מתאי Cδ-CS B שאינם מוטציה עדיין פעילים באופן אוטומטי (איור 5 א). תא הזיכרון מסוג IgM שעבר מוטציה קלה עשוי להזכיר יותר את רפרטואר תאי B הנאיבי שנבחר לאחר מכן לאחר אינטראקציה של אנטיגן, ובכך להפחית את התדירות הכוללת של נוגדנים עצמיים (19). לעומת זאת, תאי B המופעלים יתר על המידה המצטברים יותר מוטציות ובסופו של דבר מתג מחלקות עשויים להיבחר כדי להימנע מפעילות אוטואולוגית פתולוגית, כפי שמעידה התמיינות מועדפת לתאי Cδ-CS B, אך עם זאת, התערבות נוספת מקו החיידקים גורמת לתדירות מוגברת של IgG תאי זיכרון B שהם אוטוריאקטיביים ופולי -אקטיביים. קולטון ועמיתיו דיווחו לאחרונה כי קיימת מחסום סלקטיבי המסיר שיבוטים תאי B אוטומטיים במהלך המעבר לתאי פלזמה (32). מחסום זה יכול לדכא את היכולת של תאי זיכרון IgG אוטומטית להפוך לתאים מפרישי נוגדנים אצל אנשים בריאים. השערה אחרונה היא כי ייתכנו הבדלים איכותיים בין נוגדנים אוטרגטיביים ל- IgG ו- Cδ-CS, כפי שהציע האינטנסיביות הגדולה יותר של נוגדני Cδ-CS ל- ANA (איור 2C) ו- HEp-2 אנטיגנים (איור משלים 1). לדוגמה, העוצמה הפוטורית בעוצמה נמוכה של הנוגדנים הפולי-אקטיביים של IgG עשויה להיספג או מוסווה על ידי אינטראקציה לא ספציפית עם מולקולות אחרות בסרום ולכן אינה מהווה איום משמעותי על העצמי אך עדיין מהווה איום על האנטיגן שלשמו נבחרו נקשרים עם זיקה גבוהה. לעומת זאת, ספציפיות שנבחרו בתאי Cδ-CS B עשויות להיות אוטומטיות יותר באופן בוטה. ניתוח מעמיק יותר של סגוליות IgG בהשוואה לספציפיות של Cδ-CS וזיקה לאוטואנטיגנים נדרש להבהיר אפשרות זו.

לסיכום, הממצאים במסמך זה מוכיחים כי לתאי Cδ-CS (IgD בלבד) יש שיעור גבוה של אוטוריאקטיביות בקרב אנשים בריאים. אפיון המנגנון שגורם לרוב תאי Cδ-CS B להיות אוטוריאקטיביים עשוי לספק התקדמות חשובה בהבנתנו את המנגנונים ההיקפיים של סובלנות חיסונית ואולי הבנה טובה יותר של תפקודו החמקמק של איזוטיפ IgD.

בידוד לימפוציטים B וציטומטריה. לימפוציטים מסוג B היו מבודדים משקדים אנושיים או מדם כפי שתואר לעיל (11, 14, 31). כל הרקמות והדם בודדו בהתאם להנחיות ה-NIH שנקבעו עם אישור מועצת הביקורת המוסדית מהמועצה לביקורת מוסדית של Oklahoma Medical Research Foundation (IRB) (דם ושקדים) ומרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה IRB (שקדים). שקדים התקבלו מבית החולים לילדים באוניברסיטת אוקלהומה במהלך כריתת שקדים שגרתית והדם היה ממכון הדם של אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. שימוש ברקמת שקדים ודם היה פטור מהסכמה בכתב. כל תורמי השקדים היו ילדים בריאים עם היסטוריה של שקדים דלקתיים (אך ללא כל דלקת נוכחית). דם היה מתנדבים צעירים. בקצרה, תאים בודדים הקניטו את השקדים. חלקים מועשרים בתאי B טוהרו באמצעות ריאגנטים של RosetteSep (StemCell Technologies Inc.) ושיפוע לימפופרפ (CellGro Mediatech Inc.) עם תוספת rbc של כבשים. תאי B מועשרים לאחר מכן לטוהר קרוב על ידי התדלדלות חרוזים מגנטיים באמצעות ערכת בידוד תאי B Miltenyi Biotec B II. תאי B נאיבים בודדו כ- IgD + IgM + CD38-(שקד) או CD27-(דם) ותאי Cδ-CS B בודדו כ- IgD + IgM-CD38 +, ותמלילי תאי זיכרון מסוג IgG בדם היקפיים הוגברו על ידי RT-PCR מתוך תאי זיכרון ממויינים (IgD - IgM - CD27 + איור 1 ב) באמצעות ציטומטר זרימה של Dako Cytomation MoFlo או BD FACSAria. לוחות של Igκ + ו-Igλ + מתאי תמימים ו-Cδ-CS מוינו מ-2 מהתורמים. מכיוון ששברי Igκ ו-Igλ היו דומים עבור כל המבחנים, השברים קובצו עבור הניתוחים כאן. כפי שחזה, רוב תאי Cδ-CS B היו שליליים Igκ (Igλ +). תאים בכמויות גדולות של 3 הפנוטיפים ממוינו ונכנסו ללוחות PCR עם 96 טובות על מנת להבטיח טוהר של תאים בודדים (98% -99% טוהר זוהה בסוג התאים הבודדים). נוגדנים המשמשים לציטומטריית זרימה היו אנטי- IgM מצומדים ל- APCs (Southern Biotechnology Associates), אנטי IgD מצומדים ל- PE (BD), ביוטיניליטים נגד CD38 ואחריהם סטרפטאווין מצומדות לטריקולור (Invitrogen), אנטי Igκ מצומדות ל-FITC (Invitrogen), ואנטי-CD27-מצומד ל-PE (Invitrogen).

תא יחיד RT-PCR ו- PCR. תאי B יחיד ממוינו לצלחות PCR המכילות 10 מ"מ Tris-HCL עם 40 יחידות/μl של מעכב RNase (Promega). הצלחות הוקפאו מיד על קרח יבש ואוחסנו ב -80 מעלות צלזיוס. כל תא הוגבר בתגובת RT-PCR חד-שלבית (Qiagen) תוך שימוש בקוקטייל של פריימר סנס ספציפי לאזורי המנהיג ופריימרים אנטי-סנס ספציפיים ל-Cμ- (נאיבי), Cδ- (Cδ-CS), או Cγ- אזורים קבועים עבור שרשראות כבדות ואזורים קבועי C or או קבועים ב- Cl עבור השרשראות הקלות. מיקרוליטר אחד מכל תגובת RT-PCR הוגבר בתגובות PCR נפרדות למשפחות הגן הכבדות והקלות בשרשרת הגן באמצעות פריימרים מקוננים. כל רצפי הפריימר פורסמו בעבר (7, 18) למעט הפריימרים נגד Cδ (חיצוניים, 5'-GTGTCTGCACCCTGATATGATGG-3 ', מקוננים, 5'-GGGAACACATCCGGAGCCTTG-3') והפריימרים אנטי-Cγ (חיצוניים, 5 ′ -TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCT-3 ′, מקונן, 5′-AGGTGCTCTTGGAGGAGGGT-3 ′). מוצרי ה- PCR היו ברצף (Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer). לאחר זיהוי הגנים המשתנים, נעשה שימוש בפריימר סנס ייחודי לגנים המשתנים המסוימים ובפריימרים אנטי-סנס הקושרים את הגנים הצמתים המסוימים שימשו להגברת 1 μl של תגובת RT-PCR כדי לשלב אתרי הגבלה בקצוות הגנים המשתנים לשיבוט וביטוי. . חלק מרצפי הגנים המשתנים המוצגים להשוואה באיור 1, C ו- D, היו מנתונים היסטוריים שפורסמו בעבר על ידי המעבדה שלנו (12, 16, 33, 34). כדי ליצור את הגנים המשתנים שהוחזרו עבור הניסויים באיור 5, השתמשנו ב-PCR עם הארכת חפיפה של גדילים של תבניות כבדות משתנות, משתנה-אור ו-J ללא מוטציה ופריימרים חופפים המקודדים את אזורי CDR3 עם פריימרים V ו-J ספציפיים לגנים.

ביטוי נוגדן חד שבטי רקומביננטי. לאחר טיהור ועיכול, cDNAs המוגברים של הגנים המשתנים של נוגדנים מכל תא בודד היו משובטים לתוך וקטורי ביטוי המכילים אזורים קבועים של IgG, Igκ או Igλ כפי שתואר לעיל (7). פלסמי הכנה מקסי פלסמיד מקסי קיט (Qiagen) המכיל את גני Ig הכבדים והקלים בשרשרת הועברו לקו התאים 293A באמצעות סידן פוספט או מגיב תמצית Roche Applied Science FuGENE 6 בהתאם לפרוטוקול המוצע של היצרן. תאי 293A שעברו נגיעה הורשו להפריש נוגדנים ב-DMEM נטול סרום בתוספת 1% Nutridoma-SP (Roche) למשך 4 עד 5 ימים. נוגדנים טוהרו באמצעות עמודי חלבון A (לא פירומטיים). ביטוי וטוהר נוגדנים נאותים אומתו על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, וריכוזי נוגדנים מטוהרים נקבעו באמצעות ערכת EZQ Protein Quantitation (Invitrogen).

ניתוחי ELISA ו- HEp-2 לאקטראקטיביות. כדי לסנן את הנוגדנים המובעים עבור תגובתיות או פולי-ריאקטיביות של DNA, לוחות המיקרוטיטר של ELISA (Costar Corning Inc.) צופו ב-10 מיקרוגרם/מ"ל תימוס עגל ssDNA או dsDNA (Invitrogen), LPS (Sigma-Aldrich), או אינסולין אנושי רקומביננטי (Fitzgerald) . צימוד IgG-peroxidase של עיזים ספציפי ל-y-שרשרת (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) שימש לזיהוי קישור של הנוגדנים הרקומביננטיים, ואחריו פיתוח עם מצע פרוקסידאז של חזרת (Bio-Rad). ספיגות נמדדו ב- OD415 על קורא מיקרופלט (התקנים מולקולריים).

הנוגדנים נבדקו לאיתור תגובתיות HEp-2 על ידי אימונופלואורסצנטי באמצעות שקופיות HEp-2 מסחריות לפי הפרוטוקול המוצע על ידי היצרנים (BION Enterprises Ltd.). שקופיות HEp-2 נותחו באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט של Zeiss Axioplan II. הנוגדנים נבדקו לקשירת ANA באמצעות ערכת QUANTA Lite ANA (INOVA Diagnostics Inc.) וזוהו באמצעות פרוקסידאז-מצומד של IgG (ספציפי לשרשרת γ) של עיזים (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) ולאחר מכן פיתוח עם מצע פרוקסידאז של חזרת (ביו-ראד). כל תגובתיות HEp-2 ו- ANA הושוותה לסרטי בקרה חיוביים של חולה זאבת ולסרה לא-תגובתית מתורם דם בריא. מבחני ה-QUANTA Lite ANA נורמלו לנוגדן ANA + חד שבטי בבית (mAb: 050504P181L+B09).

סטָטִיסטִיקָה. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת Microsoft Excel 2003 או GraphPad Prism 4. לניתוחים באיור 1, A ו- B, ואיור 2 ב, סטודנטים דו-זנביים t בוצעו בדיקות. עבור הניתוחים באיור 2, A ו- C, איור 3 ואיור 4 ב, בוצעו 2 בדיקות.

אנו מודים לג'ודית א. ג'יימס על הקריאה הביקורתית של כתב היד ועל מתן הצעות חשובות. אנו מודים לארי ויסוצקי על שסיפקו, ולמרטין וייגרט ודייויד סטולר על שאיפשרו לנו להשתמש במונוקלונים השליטה החיובית 3H9 ו- H241 נגד DNA. סיוע טכני ניתנו על ידי לני אברהם ושריל כריסטופרסון ממתקן רצף הדנ"א של אוקלהומה (OMRF), צוות מתקן ליבת ההדמיה של OMRF, וג'ייקוב בס ודיאנה המילטון במתקן הליבה של ציטומטריה של OMRF Flow. אנו מודים גם לבית החולים לילדים של אוניברסיטת אוקלהומה ובמיוחד שרה ג'ונסון וג'וסו מדינה על כך שהם זמינים דגימות שקדים. ליסה רידג'ווי סיפקה עזרה פקידותית. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענקי NIH P20RR018758-01 ו- P20RR15577-02 ל- P.C. ווילסון.

השתמשו בקיצורים לא סטנדרטיים: ANA, אנטיגן אנטי-גרעיני Cδ-CS, מחלקה עברה ל-Cδ CDR, אזור הקובע משלימות dsDNA, DNA דו-גדילי HEp-2, שורת תאי אפיתליומה אנושית 2 ssDNA, DNA חד-גדילי.

ניגוד עניינים: המחברים הצהירו כי אין ניגוד אינטרסים.

מידע התייחסות: ג'יי קלין. להשקיע.117: 1558–1565 (2007). doi:10.1172/JCI27628


תיקון קולטן מקומי ומעבר כיתה ל-IgE ברינוסינוסיטיס כרונית עם פוליפים באף

דלקת אף כרונית עם פוליפים באף (NP) ונזלת אלרגית (AR) מאופיינת בדלקת Th2 מקומית ובוויסות עלייה של IgE, עם זאת, IgE ב-NP הוא 'רב-שבטי' וספציפי לאלרגן, בעוד ש-IgE ב-AR הוא 'אויגוקלונלי' וספציפי לאלרגן. . תגובות מרכז נבט (GC) מתרחשות ב-AR, בעוד שרק היווצרות של מבנים דמויי GC ב-NP מתוארת. מטרת מחקר זה הייתה לחקור את המעורבות של ייצור IgE מקומי, רקומבינציה של מתגי מחלקה ותיקון קולטן ב- NP.

שיטות

השווינו את רמות ה-IgE המקומי, תעתיקי גנים של קו הנבט וביטוי mRNA של Ig בוגר, גן מפעיל רקומבינציה (RAG1 ו-RAG2), סמני מפתח של דלקת Th2 ותגובות GC ברקמת NP לעומת AR ורקמת בקרה. רירית האף הוכתמה לחיסון לביטוי משותף של RAG1 ו- RAG2 בתאי B, בתאי פלזמה ותאי T, תוך שימוש באימונופלואורסצנטי כפול או משולש (IF).

תוצאות

ב- NP, רמת IgE המקומית וסמני המפתח של מיתוג המעמד המקומי גדלים בהשוואה ל- AR ולבקרות רגילות (NC). ב- NP, תמלילי מעגל מתג חושפים רקומבינציה מתמשכת של מחלקות מקומיות ל- IgE. עד 30% מתאי B, תאי פלזמה ותאי T בפוליפים באף מבטאים מחדש את RAG1 ו- RAG2, הנדרשים לשינוי הקולטן. ריכוזי mRNA RAG1 ו- RAG2 גדלים ב- NP ומתואמים עם גודל הדלקת ונוכחות S. aureus אנטרוטוקסין (סופר-אנטיגן) ספציפי IgE ברירית הפוליפים באף.

סיכום

התוצאות שלנו מספקות את העדות הראשונה לשינוי קולטן מקומי ולמעבר בכיתה ל- IgE, והתמיינות של תאי B לתאי פלזמה המפרישים IgE ב- NP.


תַקצִיר

תאי פלזמה הם תאי האפקטור המובחנים באופן סופי, שאינם מתחלקים משושלת תאי B. הם מפעלים תאיים המוקדשים למשימה של סינתזה והפרשת אלפי מולקולות של נוגדנים clonospecific בכל שנייה. כדי להגיב לפתוגנים מיקרוביאליים עם הספציפיות והמהירות הדרושים, תאי B מוסדרים להפליא ביחס הן להתפתחות במח העצם והן להפעלה בפריפריה. סקירה זו מתמקדת בבידול הסופי של תאי B לתאי פלזמה, כולל תת-קבוצות שונות של תאי B שהופכות לתאי פלזמה, מנגנון ויסות המעבר הזה, גורמי התעתיק השולטים בכל שלב התפתחותי ומאפייני פלזמה ארוכת שנים. תאים.


תאי B בוגרים שהועברו ל-IgD הם אוטו-ריאקטיביים אצל אנשים בריאים

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

מצא מאמרים מאת Koelsch, K. בתוך: JCI | PubMed | Google Scholar

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

מצא מאמרים מאת מתיאס, מ .: JCI | PubMed | Google Scholar

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

1 תוכנית אימונוגנטיקה מולקולרית, קרן המחקר הרפואי באוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. 2 המחלקה לפתולוגיה ו-3 המחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה, מרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב.

כתוב התכתבות אל: Patrick C. Wilson, Molecular Immunogenetics, Oklahoma Medical Research Foundation, 825 NE 13th St., Oklahoma City, Oklahoma 73104, USA. טלפון: (405) 271-7393, שלוחה. 34556 פקס: (405) 271-8237 דואר אלקטרוני: [email protected]

קביעת המקור והגורל של תאי B אוטו-ריאקטיביים היא קריטית להבנה וטיפול במחלות אוטואימוניות. אנו מדווחים כי למרות שמקורם באנשים בריאים, נוגדנים מתאי B שהחלפו ל- IgD באמצעות רקומבינציה גנטית (ובכך הופכים למחלקה לתאי Cδ [Cδ-CS]) מגיבים מאוד לאנטיגנים עצמיים. יותר ממחצית הנוגדנים מתאי Cδ-CS B נקשרים אוטואנטיגנים על תאי קו אפיתלומיה 2 (HEp-2) אנושיים או אנטיגנים אנטי-גרעיניים, ורבע נקשרים ל- DNA דו-גדילי שתי קבוצות הנוגדנים הן לעתים קרובות פולי-אקטיביות. למרבה הפלא, כמה תאי Cδ-CS B צברו שאריות בסיסיות באזורים המשתנים של נוגדנים המתווכים תגובתיות אנטי-דנ"א באמצעות היפר-מוטציה סומטית ובחירה, בעוד שתאים אחרים של Cδ-CS B הינם אוטוריאקטיביים באופן טבעי. למרות שהאחוז הכולל היה נמוך במידה ניכרת מאשר עבור תאי Cδ-CS, 31% מפתיעים מנוגדנים לתאי זיכרון IgG היו אוטו-ריאקטיביים במידה מסוימת, וכצפוי, כ-24% מהנוגדנים התאיים היו אוטו-ריאקטיביים. אנו מפרשים ממצאים אלה כדי להצביע על כך שניתן לגרום לתאי B autoreactive למעבר בכיתה ל- IgD או שתאי B autoractive שמשתמשים ב- IgD כקולטן תא B אינם נמחקים ביעילות. קביעת המנגנון שבו מרבית תאי Cδ-CS B הם אוטוריאקטיביים עשויה להיות חשובה בהבנת מנגנוני הסובלנות ההיקפיים ועשויה לספק תובנה לגבי הפונקציה האניגמטית של נוגדן IgD.

תאי B ספציפיים נשלטים בדרך כלל על ידי מחיקה משובטת (1, 2), עריכת קולטן (3, 4) ואנרגיה משובטת (5, 6). למרות מנגנונים אלה, לימפוציטים מסוג B המבטאים אימונוגלובולין פני השטח שיכולים להיקשר לאנטיגנים עצמיים נפוצים למדי ברפרטואר תאי B הבוגר (7, 8). רוב הידע אודות מנגנוני הסובלנות לתאי B נגזר מניסויים עם עכברים מהונדסים הנושאים נוגדנים עצמיים משולבים מראש פחות ידוע על גורלם של תאי B המגיבים עצמית בבני אדם. מכיוון שתאי B אוטו-ריאקטיביים עשויים להיות המבשרים ליצירת נוגדנים עצמיים פתולוגיים במחלות אוטואימוניות שונות כגון זאבת אדמנתית מערכתית (SLE) או דלקת מפרקים שגרונית, הבנת גורלם בבני אדם בריאים היא קריטית. מוצגות כאן עדויות לכך שאצל אנשים בריאים, תאי B שעוברים בכיתה לאיזוטיפ IgD הם בעיקר אוטוריאקטיביים.

בתאי B בוגרים שלא הופעלו על ידי אנטיגן (תאים נאיביים), נוגדני IgM ו- IgD מקודדים בו זמנית על ידי אקסונים Cμ ו- Cδ באמצעות שחבור mRNA דיפרנציאלי של תמליל יחיד של VDJ-Cμ-Cδ. לאחר ההפעלה, ניתן לגרום לתאי B נאיביים לעבור למעמד. מיתוג מחלקות אימונוגלובולין מתמחה בתפקוד הנוגדנים באמצעות החלפת אקסונים גנים IgM ו- IgD (Cμ ו- Cδ) באקסונים IgG (Cγ), IgA (Cα) או IgE (Cε) על ידי רקומבינציה גנטית. עם זאת, חלק קטן מתאי B (1%-3%) למעשה עוברים מחלקה מ- Cμ ל- Cδ ברמה הגנטית באמצעות אזורי מתג קריפטיים בין האקסונים Cμ ו- Cδ וכתוצאה מכך פנוטיפ IgM - IgD +. אלה מכונים כיתת תאי B המועברת לתאי Cδ (Cδ-CS) (9, 10) ונראה כי הם נבעו מתגובה חיסונית המופעלת על ידי אנטיגן מכיוון שניתן לבודדם כתאי GC, הם משובטים מאוד (מה שמרמז חלוקת תאים), ולגנים המשתנים יש מוטציות סומטיות נרחבות (11, 12). תאי Cδ-CS B גם מבטאים בעיקר שרשראות l-light ויכולים להתמיין לתאי זיכרון ותאי פלזמה (13, 14). השימוש השולט בשרשראות L-light מצביע על כך שרוב נוגדני ה-IgD המופרשים בסמים אנושיים (

1% מכלל הנוגדנים) הוא מתאי Cδ-CS B, שכן גם IgD בסרום מקודד בעיקר לשרשרת קלה (15). תאי Cδ-CS B משתמשים בתת-קבוצה של גנים באזור משתנה של אימונוגלובולינים הקשורים לאורך זמן עם אוטו-ריאקטיביות (16) וייתכן שהיו נתונים לעריכת קולטן במהלך התפתחות תאי B (12, 16, 17). תצפיות שונות אלה מצביעות על כך שתאי Cδ-CS B נוצרים על ידי מנגנון של סובלנות חיסונית או שהם מתחמקים מסבילות חיסונית. כאן יצאנו לקבוע אם אכן תאי Cδ-CS B פועלים באופן אוטומטי בבני אדם בריאים.

מצאנו שלימפוציטים מסוג Cδ-CS B אנושיים היו אוטו-ריאקטיביים, מכיוון שהם מקודדים לנוגדנים שלעתים קרובות קושרים תאי אפיתליומה אנושית קו 2 (HEp-2), אנטיגנים אנטי-גרעיניים (ANAs), DNA חד-גדילי (ssDNA), DNA דו-גדילי ( dsDNA), והם היו לעתים קרובות פולי -אקטיביים. בהתאם לדוח שנערך לאחרונה מאת טילר ועמיתיו, לתאי זיכרון IgG אנושיים הייתה תגובתיות עצמית בעצימות נמוכה והיו פולי-ריאקטיביים בתדירות גבוהה באופן מפתיע (8), אם כי התדירות והעוצמה של קישור האוטואנטיגן היו נמוכות משמעותית מאלו של תאי Cδ-CS B. . באופן מעניין, תגובתיות אנטי-DNA הקודדה באופן טבעי על ידי הגנים המשתנים ללא מוטציה או נרכשה במהלך תגובה חיסונית באמצעות מוטציות סומטיות. לפיכך, נוגדנים אנטי-דנ"א הנובעים כנראה מתגובה חיסונית עלולים להיווצר אצל אנשים בריאים. ממצאים אלה מספקים התקדמות חשובה בהבנת מנגנוני הסובלנות השולטים בתאי B המגיבים עצמית שעלולים להפריע בחולים עם מחלות אוטואימוניות.

קביעת הספציפיות של נוגדנים עצמיים של תאי Cδ-CS B. תאי Cδ-CS B הם שושלת ייחודית שנמצאת בשקדים ובדם שהם IgD + IgM - וניתן לבודד כתאים GC (CD38 +) או פלזמה (CD38 ++) משקדים אנושיים (11, 14) (איור 1A) או כתאי זיכרון (CD27 +) מדם היקפי (13) (איור 1 ב). על מנת לבדוק את הספציפיות של תאי Cδ-CS B, נוצרו נוגדנים חד שבטיים רקומביננטיות מגנים מהאזור המשתנה של תאים בודדים. השתמשנו באסטרטגיה שונה הדומה לזו שתוארה בדוחות קודמים (7, 18), שבה תאי B בודדים מוינו על ידי ציטומטריית זרימה לתוך צלחות של 96 בארים והגנים המשתנים הוגברו על ידי מרובה, RT-PCR חד תאי לזיהוי ושיבוט הגנים של השרשרת הכבדה והשרשרת הקלה של אימונוגלובולינים ממבחר אקראי של תאים (הגנים המשתנים שבהם נעשה שימוש מופיעים בחומר משלים בטבלה 1 הזמין באינטרנט עם מאמר זה doi:10.1172/JCI27628DS1). גנים משתנים אלה שוכפלו לאחר מכן לתוך וקטורי ביטוי ובאו לידי ביטוי באזורים קבועים של IgG בשורת התאים האנושית 293A. סך של 100 נוגדנים הופקו מתאי Cδ-CS GC B (IgD + IgM-CD38 + איור 1 א) המבודדים משלושה תורמי שקדים (על ידי תורם, נ = 45, 34 ו-21 נוגדנים) ובהשוואה ל-78 נוגדנים מתאי B תמימים מ-3 תורמים (IgD + IgM + CD38 - לפי תורם, נ = 37, 27 ו-14 נוגדנים) ו-64 נוגדנים מתאי זיכרון IgG מ-4 תורמים (IgD – IgM – CD27 + על ידי תורם, נ = 25, 12, 7 ו -20 נוגדנים). ראוי לציין כי תאי B נאיביים כהגדרתם כאן הכילו אולי אוכלוסייה קטנה של תאי B שהיו תאי מעבר אך עדיין ייצגו בעיקר את הרפרטואר הנאיבי של תאי B אנושיים. היה חשוב להימנע מזיהום תאי B הנאיביים בתאי זיכרון IgM + D+ - מכיוון שתאי זיכרון IgM מבני אדם הם לעתים רחוקות אוטו-ריאקטיביים (19), זיהום יגרום לנו להמעיט בערכו של התדירות האמיתית של נוגדנים עצמיים שזוהו. בנוסף לניתוח תאי CD27, כדי למנוע עוד יותר מזיהום תאי זיכרון IgD + IgM +, השתמשנו רק בנוגדנים מהתאים התמימים שלא היו להם מוטציות סומטיות (כלומר, שהיו להם פחות מתדירות הרקע של חילופי בסיס 1 לכל גן משתנה) . הזהות של תאי Cδ-CS B הממוינים אומתה על סמך מאפיינים ידועים של רפרטואר הגנים המשתנה כולל מוטציות סומטיות נרחבות (איור 1C) (11) ושימוש שופע ב-Jח6 קטע גנים (איור 1D) (16). התעניינו לדעת האם, כפי שנחזה על ידי הממצאים של קליין ועמיתיו (13), גנים משתנים מתאי זיכרון דם היקפיים Cδ-CS דומים לתאי Cδ-CS GC ותאי פלזמה. ואכן, לגנים משתנים המשוכפלים באקראי מתאי זיכרון Cδ-CS היו גם מוטציות סומטיות מוגזמות והעדפה לשימוש ב- J הקשור לאוטואימוניות.ח6 מקטע גנים (איור 1, C ו-D) (7, 16, 20). כפי שמתואר להלן, נוגדנים מתאי זיכרון Cδ-CS GC, תמימים ו-IgG נבדקו עבור תגובתיות לתאי HEp-2 על ידי אימונופלואורסצנטי וקשירה ל-ANA על ידי מבחני אימונוסורבנט מסחריים ונבדקו על ידי ELISA עבור תגובתיות ל-DNA או לריאקטיביות.

פנוטיפ של תאי Cδ-CS B. (א ו ב) שערי מיון ציטומטריית זרימה המשמשים לבידוד סוגי תאי B השונים שנותחו מדם או שקדים, כולל תאי Cδ-CS GC (IgD + IgM - CD38 + ), תאי B תמימים (IgD + IgM + ו-CD38 - שקדים או CD27 - דם ), ותאי זיכרון B (IgD - CD27 + מתיבה "זיכרון" ב ב). מחשב, תא פלזמה. ניתוח של תדירות מוטציות סומטיות (ג) והשימוש ב- Jח6 מקטע גנים (ד) להדגים שכל תת-קבוצות תאי Cδ-CS B ואלו המובעים כאן ייחודיים באופן דומה מתאי IgG ו-IgM B. (ג) מוצג האחוז של Vח גנים עם מספר המוטציות המצוין עבור כל תת-קבוצה שניתחה. (ד) שימוש במגוון Jח מקטעי גנים. כלולים תעתיקים מ-625 גנים משתנים של תאי Cδ-CS GC מ-11 תורמים (לפי תורם, נ = 44, 44, 57, 44, 62, 34, 225, 59, 16, 21 ו-19), 78 גנים משתנים של תאי פלזמה Cδ-CS מתורם אחד, 124 גנים משתנים של תאי זיכרון Cδ-CS מ-4 תורמים (על ידי תוֹרֵם, נ = 20, 20, 28 ו- 56), 620 IgG GC, זיכרון ותאי פלזמה מגנים משתנים מ -14 תורמים (לפי תורם, נ = 18, 28, 174, 40, 108, 37, 25, 21, 18, 22, 15, 24, 19 ו -71), 681 IgM GC, זיכרון ותאי פלזמה גנים משתנים מ -18 תורמים (לפי תורם, נ = 18, 91, 51, 158, 17, 10, 16, 48, 30, 19, 28, 11, 36, 29, 13, 22, 20 ו-64), ו-267 גנים משתנים תמימים מ-6 תורמים (לפי תורם) , נ = 47, 30, 24, 15, 24 ו-127).

נוגדנים שמקורם בתאי Cδ-CS B קושרים אנטיגנים עצמיים. מבחן ה- HEp-2 Slide הוא מבחן האבחון הקליני הקלאסי המשמש לאיתור אוטוריאקטיביות ומחייבות ANA על ידי נוגדני סרה כפי שניתן לראות במחלות אוטואימוניות כגון SLE. Assay זה מעסיק את השימוש בתאים מקו תאי האפיתליום האנושי המודבק לשקופית מיקרוסקופ, ולאחר מכן זוהה על ידי אימונופלואורסצנטי לאחר הדגירה עם הסרה (21). כדי לקבוע אם נוגדנים מתאי Cδ-CS B נקשרים לאנטיגנים עצמיים בתדירות גבוהה יותר מאלה של תאים B נאיביים או זיכרוןיים, נוגדנים מכל אוכלוסייה נבדקו לגבי תגובתיות לאנטיגנים בקו התא HEp-2. בנוסף, כל הנוגדנים נבדקו לצורך קישור ל- ANA באמצעות מבחן חיסוני חיסוני מסחרי המיועד לאיתור תגובתיות ANA קלינית (ערכת QUANTA Lite ANA, INOVA Diagnostics Inc.). נוגדנים שהייתה להם כריכה ניתנת לגילוי גדולה מזו של סרטן שליטה שלילית במבחן החיסוני החיסוני HEp-2 זכתה לחיוב. עבור assay ANA, נוצר ערך ספיגה שאיפשר הערכה כמותית יותר. מכיוון שהתאים הנאיביים היו אוכלוסיית הביקורת, חשבנו שנוגדנים חיוביים ל- ANA אם הם מייצרים ספיגה בריכוז של 25 מיקרוגרם/מ"ל שהיו גדולים מהממוצע ± SD של הספיגה של כל הנוגדנים לתאים נאיביים. ממוצע ± ספיגת SD של הנוגדנים הנאיביים היה 0.4293 ± 0.2235 OD415כך שלבדיקות חיוביות היו ספיגות של 0.6829 ומעלה. דיווחים קודמים הוכיחו כי בריכוזים של 25 עד 50 מיקרוגרם/מ"ל, כ-70% מהנוגדנים מתאי B לא בוגרים מוקדם (לפני הבחירה) קושרים אנטיגנים של תאי HEp-2, בעוד שרק 18% מהנוגדנים מתאי B נאיביים בוגרים תגובתיות ניכרת של HEp-2 (7). מצאנו תדירות דומה של נוגדנים תגובתיים ל- HEp-2 ו- ANA מתאים נאיביים שנבדקו (16 מתוך 70, או 23% איור 2 א). באופן מפתיע, אך עקבי עם דיווח אחרון על תגובתיות של נוגדני IgG אנושיים (8), 27% (17 מתוך 64) מהנוגדנים מתאי זיכרון IgG B היו תגובתיים ל-HEp-2 או ANA. לעומת זאת, 60% (53 מתוך 89) מהנוגדנים שמקורם ב-Cδ-CS הגיבו עם אנטיגנים HEp-2 או ANA. העלייה בתדירות נוגדנים תגובתיים לתאי HEp-2 מתאי Cδ-CS בהשוואה לאלו של תאים נאיביים או תאי זיכרון IgG הייתה משמעותית ביותר הן כאשר כל הנוגדנים הושוו כמכלול (איור 2 א 2, פ & lt 0.0001) ובהשוואה לתדירות ממוצעת בין התורמים (איור 2 ב 'של סטודנטים t מִבְחָן, פ & lt 0.05 לעומת נוגדנים נאיביים או IgG).

נוגדנים מתאי Cδ-CS B הם לעתים קרובות אוטו-ריאקטיביים. (א) נוגדנים שמקורם ב- Cδ-CS מגיבים מאוד לאנטיגנים HEp-2 ו- ANA בהשוואה לנוגדנים נאיביים ונגיפים מסוג IgG. נוגדנים שנבדקו כללו 89 נוגדנים Cδ-CS (מ-3 תורמים, נ = 37, 18 ו- 34), 70 נוגדנים תאי B תמימים (מ -3 תורמים, נ = 39, 14 ו -17), ו -64 נוגדנים מתאי זיכרון IgG (מ -4 תורמים, נ = 25, 5, 12 ו- 20). התדירות של נוגדנים תגובתיים ל- HEp-2 נקבעה על ידי סינון הנוגדנים על ידי אימונו-פלואורסצנטיות באמצעות שקופיות HEp-2 שהוכנו באופן מסחרי (איור משלים 1), ותדירות נוגדנים תגובתיים של ANA באמצעות מבחני חיסוני ANA מסחריים (ראה שיטות). נוגדנים שקשרו את שקופיות HEp-2 באופן אינטנסיבי יותר מאשר סרומי בקרה שליליים שסופקו על ידי היצרן או שקשרו את ANA באופן אינטנסיבי יותר מהממוצע ± SD של כל הנוגדנים התאים הנאיביים נחשבו חיוביים בשני המבחנים. התוצאות הצביעו על כך ששכיחות האוטור-אקטיביות הייתה גבוהה יותר באופן משמעותי בנוגדנים שמקורם ב- Cδ-CS מאשר בנוגדנים נאיביים או IgG (χ 2, פ < 0.0001). (ב) תדירות תגובתיות HEp-2 ו- ANA על ידי התורם. נוגדני Cδ-CS נקשרו לעתים קרובות יותר מאשר IgG או נוגדנים נאיביים שמקורם בתאים (התלמידים t מִבְחָן, פ < 0.05). (ג) למרות שתאי IgG היו בדרך כלל יותר תגובתיים במבחני ANA מאשר תאים תמימים, התגובתיות הייתה בעוצמה נמוכה. לעומת זאת, יותר נוגדנים מסוג Cδ-CS נקשרים ל- ANA בעוצמה גבוהה. קווים אדומים מצביעים על ספיגות מחייבות ANA ממוצעות. קווים מקווקווים מציינים את ספי הציון החיובי (קו מקווקו תחתון מציין ANA + כלומר ממוצע התא הנאיבי ± קו מקווקו עליון SD מציין גבוה ANA) רמת הספיגה הגבוהה הושגה בשכיחות רבה יותר עבור נוגדני Cδ-CS.

נוגדני Cδ-CS נקשרים גם ל- ANA (איור 2C) ולאנטיגנים HEp-2 (איור משלים 1) בעוצמה גדולה יותר מאשר נוגדני תאי הזיכרון הנאיביים או IgG. 11 אחוז מהנוגדנים Cδ-CS שנבדקו קשרו ANA בעוצמה גבוהה במיוחד (ANA high ) בהשוואה ל-3% מה-IgG ואף אחד מהנוגדנים התמימים (איור 3C χ 2 , פ = 0.05). ראוי לציין שכמחצית מנוגדני ה-IgG היו בעלי קשירה נמוכה לאנטיגנים ANA שהייתה גדולה מזו של הנוגדנים הנאיביים אך לא מעבר ל-SD של הממוצע ולכן קיבלו ציון שלילי. לאחרונה הוכח כי תגובתיות קלה זו של תאי זיכרון IgG נובעת ממוטציות סומטיות שהצטברו (8) וגרמה לספיגה ממוצעת מוגברת הכוללת. לתאי Cδ-CS בתורו הייתה עוצמת הקישור ANA הממוצעת הגדולה ביותר (איור 2C 0.4593 ± 0.2235 OD415 עבור תאים תמימים, 0.6691 ± 0.5092 OD415 עבור IgG ו- 0.8004 ± 0.6906 OD415 עבור נוגדנים Cδ-CS). לבסוף, האוטואנטיגנים של HEp-2 הקשורים היו משתנים וכללו דפוסי ציטופלזמה כמו גם דפוסי ANA קלאסיים (איור משלים 1), ולכן התגובתיות העצמית אינה מכוונת לאוטואנטיגן בודד. לסיכום, נוגדנים מתאי Cδ-CS B נקשרים בדרך כלל אנטיגנים שונים בתאי HEp-2 ובמבחני ANA מסחריים, מה שמדגים שהם בדרך כלל אוטוריאקטיביים.

ההיקשרות ל- ssDNA, dsDNA, LPS או אינסולין על ידי הנוגדנים המתבטאים נמדדה על ידי ELISA. מידת הקישור לצלחות מיקרוטיטר מצופות אנטיגן (ספיגה [OD415]) נמדד בריכוזי נוגדנים של 6.67 × 10–8, 1.67 × 10–8, 4.17 × 10–9, ו -1.04 × 10–9 M (שהם 1 מיקרוגרם/מ"ל ושלוש דילולים סדרתיים פי 4, איקס צִיר). כל ELISA כוללים 3H9 (קווים אדומים עם יהלומים) ו- H241 (קווים אדומים עם ריבועים) נוגדנים חד שבטיים עם אנטי-דנ"א גבוהים או בינוניים, בהתאמה. המבחנים נורמלו על סמך יכולת הספיגה של הנוגדן 3H9. אחוזים מציינים את מספר הנוגדנים שקיבלו ציון חיובי. בסך הכל 78 נוגדנים מתאי B תמימים מבודדים משלושה תורמים (על ידי תורם, נ = 37, 27 ו -14 נוגדנים) הושוו עם 100 נוגדנים מתאי Cδ-CS B משלושה תורמים (לפי תורם, נ = 45, 34 ו -21 נוגדנים) ו -64 נוגדנים מתאי תאי זיכרון מ -4 תורמים (לפי תורם, נ = 25, 12, 7 ו -20 נוגדנים). קווים כחולים מייצגים את הספים החיוביים המשוערים שנקבעו על ידי חישוב ממוצע ± 2 SD של הנוגדנים הנאיביים (ראה תוצאות).

נוגדנים מתאי Cδ-CS B אנושיים נקשרים לעתים קרובות ל-DNA חד-גדילי ודו-גדילי. סימן ההיכר של פעילות אקטיבית ב- SLE הוא ייצור נוגדנים המגיבים ל- DNA, במיוחד dsDNA. על מנת להעריך עוד יותר את התגובתיות האוטומטית הפוטנציאלית של שושלת Cδ-CS בהשוואה לתאי זיכרון B נאיביים או IgG, קישור DNA הוערך על ידי ELISA. כריכת DNA נבדקה עבור הנוגדנים השונים ב 1 מיקרוגרם/מ"ל ו -3 דילולים סדרתיים נוספים פי 4. עקומות מחייב הרוויה מוצגות באיור 3. זיקה מחייבת אנטי- DNA נקבעה על ידי התאמת עקומות. נוגדנים עם ספיגה מחושבת עבור ריכוז 1 מיקרוגרם/מ"ל שהיו 2 SD מעל הספיגה הממוצעת של 95% מהנוגדנים התמימים בריכוז זה, קיבלו ניקוד כחיובי נגד DNA (איור 3). לשם השוואה באמצעות אותה מערכת ביטוי, הגנים המשתנים המקודדים ל-2 נוגדנים מאופיינים היטב המשמשים בדרך כלל לחקר תגובתיות אנטי-DNA הופקו כמונוקלונלים רקומביננטיים של עכבר/אדם IgG-κ (איור 3), כולל 3H9, המשמשים כטרנסגן. לגלות עריכת קולטן (3), ו-H241 (22). לפיכך, ניתן היה להשוות ישירות את הנוגדנים האנטי-DNA והפולי-ריאקטיביים הללו עם ריאגנטים זהים לזיהוי לנוגדנים האנושיים שנבדקו כאן. כל ה-ELISA נורמלו לנוגדן הבקרה 3H9 שנכלל בכל צלחת ELISA.

נוגדנים המגיבים ל- ssDNA שכיחים יותר בקרב אנשים עם מחלות אוטואימוניות מאשר אצל אנשים בריאים, אולם הם אינם מאבחנים מצב פתולוגי. כפי שצוין באיור 3, 8 מתוך 78 (10%) מהנוגדנים שנוצרו מתאי B תמימים היו מגיבים ל-ssDNA. זה עולה בקנה אחד עם דו"ח קודם של Wardemann et al. בהם נותחו נוגדנים מ-93 תאי B תמימים, מתוכם כמה קשרו ssDNA (7). תדירות גבוהה יותר (9 מתוך 64, או 14%) של נוגדנים מתאי זיכרון IgG קשרו ssDNA. לעומת זאת, 21% (21 מתוך 100) מנוגדני Cδ-CS הגיבו ל- ssDNA (איור 3, 2, פ = 0.05 עבור Cδ-CS לעומת נאיבי פ = לא משמעותי עבור Cδ-CS לעומת זיכרון IgG).

נוגדנים חשובים יותר מאשר נוגדנים ל- ssDNA הינם נוגדנים ל- dsDNA, כיוון שהם יותר מעידים על פתולוגיה (23, 24). נוגדנים המגיבים ל- dsDNA היו פחות תכופים מתאי B (6%או 5 מתוך 78) ותאי B מסוג זיכרון IgG (14%, 9 מתוך 64 איור 3) מאשר מתאי Cδ-CS B. נוגדנים מתאי Cδ-CS היו בעלי סיכוי גבוה פי 2 לקשור dsDNA מאשר נוגדנים מתאים נאיביים (21 מתוך 100, או 21% χ 2, פ = 0.006 עבור Cδ-CS לעומת נאיבי). שוב, מכיוון שנוגדני IgG נוטים להיות פולי-אקטיביים במידה מסוימת (8), אם כי 50% עלו, נוגדני Cδ-CS לא נקשרו ל- dsDNA באופן משמעותי יותר. השונות בין התורמים לכל מבחני האוטור -אקטיביות מתוארת באיור 4 א. כפי שצוין בעבר על ידי טילר ועמיתיו, לתא הזיכרון של IgG יש רמות שונות מאוד של תגובתיות אנטי-DNA (8). נוגדנים שקושרים dsDNA נבדקו גם לקשירה לקינטופלסטים של Crithidia luciliae, מכיוון שמבחן זה מחמיר יותר ונחשב לתקן הזהב לאיתור תגובתיות dsDNA באבחון הקליני של SLE. באופן כללי, הייתה התאמה טובה לתוצאות שלנו מה- ELISA, בכך שנוגדנים בעלי זיקה גבוהה יותר ל- dsDNA על ידי ELISA קשורים גם הם קריטידיה kinetoplasts (נתונים לא מוצגים). לפיכך, בדומה לתוצאות מבחני ה-ELISA, אחד מהנוגדנים התמימים וכמה מנוגדני IgG אנטי-DNA קשורים קריטידיה קינטופלסטים בעלי עוצמה גבוהה ועוד אחד מנוגדני ה- IgG היו בעלי קשר קל לגילוי קל. כמו כן, כפי שנחזה על ידי מבחני ELISA, 10 מנוגדני Cδ-CS נקשרו קריטידיה לקינטופלסטים ולכמה אחרים היו קשירה ניכרת אך בעוצמה נמוכה. מניסויים אלה, אנו מסיקים שתאי Cδ-CS B מגיבים לעתים קרובות יותר ל-ssDNA ו-dsDNA מאשר תאי B תמימים, ותאי Cδ-CS B נוטים להיות תגובתיים יותר מנוגדני IgG.

שונות בין התורמים ותדירות הפוליאקטיביות. (א) ממוצע ± SEM לתורמים עבור המבחנים השונים שבוצעו. (ב) אחוז הנוגדנים מכל קבוצה (תאי B Cδ-CS, תאי B תמימים, או תאי זיכרון B של IgG) שקושרו 0-1, 2, 3 או כל 4 האנטיגנים שנבדקו (ssDNA, dsDNA, LPS ואינסולין) . פולי -אקטיביות מוגדרת כקישור של יותר מ -1 אנטיגן. החלק הצהוב של התרשים מציין את האחוז שנקשר לאנטיגן אחד ולכן לא היו פולי-ריאקטיביים. מובהקות סטטיסטית (χ 2, פ = 0.04) הושגה עבור Cδ-CS לעומת נוגדנים תאי B תמימים.

נוגדנים מתאי Cδ-CS B הם בדרך כלל פולי-אקטיביים. כדי לקבוע אם תאי Cδ-CS B נוטים לבטא נוגדנים פולי-ריאקטיביים המקיימים אינטראקציה עם מספר אנטיגנים עצמיים ולא-עצמיים, בדקנו גם תגובתיות לאינסולין אנושי רקומביננטי וליפופוליסכריד ה. coli. כפי שצוין באיור 4B, יותר תאי Cδ-CS משמעותית-מאשר נוגדנים נגזרים של תאים-הציגו פולי-ריאקטיביות, אך לא יותר מאשר נוגדנים שמקורם בתאי IgG. בעוד 20% (20 מתוך 100) מהנוגדנים שמקורם בתאי Cδ-CS קשרו לפחות 2 מהאנטיגנים על ידי ELISA, פחות פחות נוגדנים מתאי נאיביים (9% או 7 מתוך 79 χ 2, פ = 0.039) אינטראקציה עם 2 או יותר אנטיגנים. עבור תאי זיכרון IgG שכיחות הפולי-ריאקטיביות הייתה נמוכה מזו של Cδ-CS (16% לעומת 20%, או 10 מתוך 64 מול 20 מתוך 100) אולם לא הושגה משמעות. לסיכום, נוגדנים מתאי B אשר התחלפו בכיתה ל-IgD או IgG היו בדרך כלל פולריאקטיביים.

בסך הכל, בהתחשב בתדירות הגבוהה של תגובתיות HEp-2 ו- ANA ותדירות אנטי-דנ"א ופולי-ריאקטיביות, הגענו למסקנה כי 56% נוגדני Cδ-CS היו אוטואקטיביים. לפיכך תאי Cδ-CS היו בתדירות אוטומטית של פי 2 יותר מנוגדנים לתאים תמימים (24% אוטו-ריאקטיביים, χ 2 , פ & lt 0.0001) פי 1.8 יותר מאשר נוגדנים שמקורם בתאי IgG (31% אוטוריאקטיביים, χ 2, פ < 0.001). מניתוח זה, הסקנו שתאי Cδ-CS B הם בדרך כלל אוטו-ריאקטיביים.

מיתוג IgD מתרחש הן בתאי B עם נוגדנים עצמיים טבעיים והן עבור תאים עם פעילות אקטיבית הנוצרת על ידי היפר -מוטציות סומטיות. יתכן כי מעבר קלאסי ל- IgD התרחש רק עבור פעילות אקטיבית שהוצגה במהלך תגובות חיסוניות בשל מוטציות סומטיות מוגזמות האופייניות לתאי Cδ-CS B (איור 1C) (11). דיווח עדכני של טילר ועמיתיו מצא תדירות גבוהה באופן מפתיע של תאי זיכרון B מסוג IgG שהם פוליריאקטיביים, והתגובתיות נגרמה בדרך כלל מהיפרמוטציות סומטיות שהצטברו (8). לחלופין, סביר שמעבר כיתה ל- IgD עשוי להתרחש לפני מוטציה סומטית וללא תלות בתגובת GC רגילה. בהתאם להשערה זו, הוכחנו בעבר שתאי Cδ-CS B צוברים מוטציות סומטיות ממוקדות המשבשות את האוטורקטיביות הטבעית של נוגדנים המקודדים על ידי ה- Vחקטע גנים 4-34 (16). ממצא זה הצביע על כך שהצטברות של היפר-מוטציות סומטיות מוגזמות בגנים המשתנים של תאי Cδ-CS B עשויה לנבוע מלחץ סלקטיבי לשינוי חומצות אמינו הגורמות לאוטוראקטיביות טבעית, כמו גם להגברת הזיקה לאנטיגנים זרים. על מנת לקבל תובנה לגבי מקורם של תאי B אוטו-ריאקטיביים שהועברו בכיתה ל-IgD, אפיינו את תפקידה של מוטציה סומטית בתיווך האוטו-ריאקטיביות. העובדה ש-11 מתוך 100 (11%) מנוגדני Cδ-CS שהובעו היו מגנים משתנים ללא מוטציה אפשרה לנו לקבוע אם תאי B שהוחלפו ל-IgD יכולים להיות בעלי אוטו-ריאקטיביות טבעית (לא בגלל מוטציות). שים לב שהגנים המשתנים המקודדים לתמלילים אלה היו דומים אחרת לזה של רוב נוגדני Cδ-CS עם שימוש מועדף ב-Jח6 מקטע גנים, אזורים 3 הקובעים השלמה ארוכה [CDR3s], ושימוש בשרשרת קלה (נתונים לא מוצגים). כפי שצוין באיור 5A, התדרים של אוטריאקטיביות אנטיגן HEp-2, התחברות ל- dsDNA ופולי-תגובתיות היו דומים בנוגדנים מוטציות ובלתי מוטציות מתאי Cδ-CS B והיו גבוהים יותר מתדירות נוגדנים עצמיים מתאי נאיבים ותאי זיכרון IgG . ניתוח זה גם סיפק אימות כי שיבוטי Cδ-CS אלה עם גנים ללא מוטציה באזור משתנה אינם מזהמים תאים תמימים. בנוסף, השוואת כותרות אנטי-דנ"א עם תדירות החלפות חומצות האמינו הצביעה על כך שאין מתאם בין הזיקה ל- dsDNA לבין הצטברות של מוטציות סומטיות, שכן טיטרים אף נוטים להיות גבוהים יותר עבור מספר השיבוטים ללא מוטציות (איור 5 ב) ). מתצפיות אלה, הגענו למסקנה כי מחלקת התאים שהוחלפה ל- IgD יכולה לבטא נוגדנים אוטואקטיביים (המקודדים על ידי germline) באופן טבעי ללא תלות בהיפרמוטציה סומטית.

Cδ-CS יכול להופיע עבור תאים המבטאים נוגדנים אוטו-ריאקטיביים (טבעיים) של קו הנבט, כמו גם כאלה שרכשו תגובתיות אוטומטית באמצעות מוטציות סומטיות. (א) נוגדני Cδ-CS המקודדים על ידי גנים משתנים ללא מוטציה (קו הנבט) מציגים רמות של תגובתיות אוטומטית של HEp-2, קישור ל-DNA ופוליריאקטיביות הדומות לאלו של גנים משתנים שעברו מוטציה סומטית. מוצגים אחוזי הנוגדנים מכל תת-אוכלוסיה. (ב) עקומות מחייבות של 1 מיקרוגרם/מ"ל נוגדני אנטי-DNA מתאי Cδ-CS B ל-DNA שימשו לחישוב ספיגה (נקודות כחולות). השוואה בין ספיגות אלו לבין תדירות החלפות חומצות האמינו (ברים אדומים) הראתה כי אין מתאם בין הזיקה ל- dsDNA לבין הצטברות מוטציות סומטיות. הגנים המשתנים של שיבוטים 14 ו -17 (כוכביות) הוחזרו לרצפי קו החיידקים שלהם כדי לקבוע אם המוטציות הסומטיות עלולות לגרום לקשירת DNA. (ג) הקישור ל-DNA אובד כאשר 2 נוגדנים אנטי-DNA Cδ-CS (שיבוט 14, שיבוט מרובע כחול 17, עיגול כחול) באו לידי ביטוי מגנים משתנים שהוחזרו לרצפים ללא מוטציה של קו הנבט (שיבוט 14, שיבוט ריבועי שחור 17, עיגול שחור). הכריכה נגד DNA הוערכה על ידי ELISA (ספיגה [OD415]) ביחס לנוגדן החד שבטי 3H9 בעל שליטה גבוהה ל- DNA (קו אדום). GL, germline.

ארגינין נחשב לשריד החשוב ביותר לקשירת אנטי- DNA (25, 26). הנוגדנים בעלי תגובתיות טבעית ל- DNA ולמספר הנוגדנים האחרים הכניסו ארגינינים ל- CDR3 על ידי רקומבינציה של VDJ (שיבוטים Cδ-CS 1 ו- 2 היו germline, שימו לב גם כי ארגינינים הוכנסו ל- CDRs של שיבוטים 4, 6, 8 , 10, 11, 12, 14 ו- 21 איור משלים 2). תצפית חשובה הייתה שלרוב שיבוטים Cδ-CS עם תגובתיות אנטי- DNA היו גם ארגנינים שהוכנסו בגלל שינויי קודון שנבעו ממוטציה סומטית (איור משלים 2). למעשה, ל-15 מתוך 22 (68%) מהשיבוטים המקושרים ל-Cδ-CS dsDNA הללו היו עד 7 ארגינינים שהוכנסו על ידי מוטציה לשרשראות הכבדות ו/או הקלות (לשיבוט 18 הוצגו הכי הרבה ארגינינים איור 2). זה הציע כי ייתכן שהפעילות הסמכותית שראינו התעוררה כתוצאה ממוטציות סומטיות שהוצגו במהלך תגובות החיסון. על מנת לחקור אפשרות זו, יצרנו וביטאנו את המקבילים ללא מוטציה של הגנים המשתנים של 2 מנוגדנים אנטי-DNA מתאי Cδ-CS (שיבוטים 14 ו-17 איור 5B). אף אחת מהווריאציות הבלתי מוטציות קשרה את ה- dsDNA, והדגימה שהתגובתיות האנטי-דנ"א שראינו התעוררה כתוצאה מהיפר-מוטציה סומטית (איור 5C). לפיכך, נוגדנים אנטי- DNA הגורמים בסופו של דבר למחלות אוטואימוניות עלולים להתעורר בדרך כלל כתוצאה מתגובות חיסון ספציפיות לאנטיגן אצל אנשים בריאים. ביחד, ניתוחים אלה מצביעים על כך שתאי Cδ-CS B יכולים להיות אוטו-ריאקטיביים באופן טבעי או שהאוטו-תגובתיות שלהם יכולה להתעורר עקב שינויים בחומצות אמינו המוכנסות על ידי היפרמוטציה סומטית.

קיימות מספר אפשרויות לשיעורים הגבוהים של תגובתיות עצמית המצויים בתאי Cδ-CS B. הוא האמין כי המעבר למחלקה ל- IgD ולתאי Cδ-CS B המתקבלים מתעוררים במהלך תגובות GC מכיוון שהם בדרך כלל מבטאים גנים משתנים בעלי מוטציה גבוהה, הם מורחבים משובטים, והם יכולים להיות מבודדים רק כתאי GC, זיכרון או תאי פלזמה (11 , 13, 14, 16). לא הצלחנו להבחין אם תאי B שהם אוטו-ריאקטיביים מושרים לעבור מחלקה ל-IgD או אם תאי B המבטאים IgD שהם אוטו-ריאקטיביים נבחרים באופן מועדף. בכל מקרה, ניתן לדמיין מספר מודלים היפותטיים. ראשית, יתכן שיש מנגנון מכוון שבאמצעותו אזור מתג Cδ הקריפטי ממוקד בתאי B אנושיים מופעלים אשר מגיבים בעצמם. ייתכן שמנגנון כזה התפתח כדי להציל תאי B אוטו-ריאקטיביים עבור תפקיד מיוחד או מופחת בחסינות המערבת IgD. מעניין לשקול כי הפונקציה החמקמקה של IgD עשויה להיות מעורבת באופן ייחודי בסובלנות עצמית (נסקרת בפניה 15). עם זאת, ניתוחים של עכברים מהונדסים המבטאים IgD או IgM בלבד כנוגדנים אוטואליים מצאו הבדל קטן בין IgD ו- IgM בסובלנות תאי B או בחירה שלילית (27). למעשה, מספר מחקרים מצביעים על כך ש- IgD מגביר את איתות ה- IgM לבחירה חיובית של תאי B לרפרטואר התפקודי (נסקרו בפניות 15 ו -28). עם מחקרים אלה בחשבון, ניתן לדמיין מספר מודלים אחרים שבהם ל-IgD אין תפקיד ספציפי בסובלנות. אחת האפשרויות היא שתאי B אוטוריאקטיביים עשויים להיות מעוכבים ממעבר המעבר לאיזוטיפים Ig במורד הזרם (כלומר, IgG, IgA, IgE), ומשאירים רק את אזור מתג Cδ ההצפנה זמין למתג בתאים שקשרו בעבר אנטיגן עצמי. עיכוב זה של החלפת מעמדות עשוי להתרחש כביטוי של אנרגיה. שני המודלים לעיל מעניינים מכיוון שכל אחד מהם מציע שמנגנוני סובלנות יכולים לשלוט ישירות על מתג מחלקת אימונוגלובולינים.

השערה חלופית היא שמעבר מחלקה ל-IgD הוא אקראי (כלומר, כל תא יכול לעבור), ושבחירה של תאי Cδ-CS B מתרחשת לאחר החלפת מחלקה, מה שגורם להישרדות מועדפת של השיבוטים האוטו-ריאקטיביים. לדוגמה, הוצע כי בהשוואה לקולטני IgM בלבד, ביטוי של IgD מספק הישרדות מועדפת (29) וגיוס של תאי B לתגובות חיסוניות שעשויות לאפשר הצלה על ידי גירוי כרוני עם אנטיגן עצמי (30). הסבר אפשרי נוסף הוא שכאשר הוא מגורה על ידי אנטיגנים עצמיים או ללא האותות הנלווים הנדרשים בדרך כלל, ביטוי של IgD רק על פני תאי B עלול לא לגרום למוות של תאי B. הבהרת המנגנון האמיתי הגורם לתאי Cδ-CS B להיות אוטוריאקטיביים עשויה לספק תובנות חשובות לגבי תפקידו של IgD כקולטן לתאי B ולמנגנונים היקפיים של סובלנות חיסונית.

תאי B זיכרון IgG מבטאים בדרך כלל נוגדנים עצמיים בעלי זיקה נמוכה (8), בעיקר כתוצאה משינויים ממוטציות סומטיות שהצטברו. במחקר שלנו, ל -31% מנוגדני ה- IgG הייתה פעילות אקטיבית ניתנת לגילוי. ראוי לציין כי ניתוחים אחרונים מצאו כי נוגדנים מתאי IgM + זיכרון B היו לעיתים רחוקות אוטואקטיביות, אך כאשר נמצאה אוטוריאקטיביות היא נגרמה על ידי מוטציות סומטיות שהצטברו (19). באופן דומה, רוב התגובה האוטומטית הנראית בתאי IgG + זיכרון B מאנשים בריאים נגרמת על ידי מוטציות סומטיות (8). ידוע שתאי IgG + זיכרון B צברו בקירוב פי 2 מהתדירות של מוטציות נקודתיות כמו תאי זיכרון IgM (31) ובהתאמה הם לעתים קרובות יותר אוטו-ריאקטיביים (8). תאי Cδ-CS B בתורם צברו הכי הרבה מוטציות נקודתיות, בממוצע של 21 ± 7 חילופי בסיס לכל Vח הגן לעומת 14 ± 5 ​​לגן עבור IgG ו- 8 ± 4 מוטציות לגן עבור IgM GC ותאי זיכרון (איור 1C). במקביל, תאי Cδ-CS B הם גם הפעילים באופן אוטומטי לרוב, אם כי בניגוד לתאי זיכרון IgG ו- IgM, 10% מתאי Cδ-CS B שאינם מוטציה עדיין פעילים באופן אוטומטי (איור 5 א). תא הזיכרון מסוג IgM שעבר מוטציה קלה עשוי להזכיר יותר את רפרטואר תאי B הנאיבי שנבחר לאחר מכן לאחר אינטראקציה של אנטיגן, ובכך להפחית את התדירות הכוללת של נוגדנים עצמיים (19).לעומת זאת, תאי B המופעלים יתר על המידה המצטברים יותר מוטציות ובסופו של דבר מתג מחלקות עשויים להיבחר כדי להימנע מפעילות אוטואולוגית פתולוגית, כפי שמעידה התמיינות מועדפת לתאי Cδ-CS B, אך עם זאת, התערבות נוספת מקו החיידקים גורמת לתדירות מוגברת של IgG תאי זיכרון B שהם אוטוריאקטיביים ופולי -אקטיביים. קולטון ועמיתיו דיווחו לאחרונה כי קיימת מחסום סלקטיבי המסיר שיבוטים תאי B אוטומטיים במהלך המעבר לתאי פלזמה (32). מחסום זה יכול לדכא את היכולת של תאי זיכרון IgG אוטומטית להפוך לתאים מפרישי נוגדנים אצל אנשים בריאים. השערה אחרונה היא כי ייתכנו הבדלים איכותיים בין נוגדנים אוטרגטיביים ל- IgG ו- Cδ-CS, כפי שהציע האינטנסיביות הגדולה יותר של נוגדני Cδ-CS ל- ANA (איור 2C) ו- HEp-2 אנטיגנים (איור משלים 1). לדוגמה, העוצמה הפוטורית בעוצמה נמוכה של הנוגדנים הפולי-אקטיביים של IgG עשויה להיספג או מוסווה על ידי אינטראקציה לא ספציפית עם מולקולות אחרות בסרום ולכן אינה מהווה איום משמעותי על העצמי אך עדיין מהווה איום על האנטיגן שלשמו נבחרו נקשרים עם זיקה גבוהה. לעומת זאת, ספציפיות שנבחרו בתאי Cδ-CS B עשויות להיות אוטומטיות יותר באופן בוטה. ניתוח מעמיק יותר של סגוליות IgG בהשוואה לספציפיות של Cδ-CS וזיקה לאוטואנטיגנים נדרש להבהיר אפשרות זו.

לסיכום, הממצאים במסמך זה מוכיחים כי לתאי Cδ-CS (IgD בלבד) יש שיעור גבוה של אוטוריאקטיביות בקרב אנשים בריאים. אפיון המנגנון שגורם לרוב תאי Cδ-CS B להיות אוטוריאקטיביים עשוי לספק התקדמות חשובה בהבנתנו את המנגנונים ההיקפיים של סובלנות חיסונית ואולי הבנה טובה יותר של תפקודו החמקמק של איזוטיפ IgD.

בידוד לימפוציטים B וציטומטריה. לימפוציטים מסוג B היו מבודדים משקדים אנושיים או מדם כפי שתואר לעיל (11, 14, 31). כל הרקמות והדם בודדו בהתאם להנחיות ה-NIH שנקבעו עם אישור מועצת הביקורת המוסדית מהמועצה לביקורת מוסדית של Oklahoma Medical Research Foundation (IRB) (דם ושקדים) ומרכז מדעי הבריאות של אוניברסיטת אוקלהומה IRB (שקדים). שקדים התקבלו מבית החולים לילדים באוניברסיטת אוקלהומה במהלך כריתת שקדים שגרתית והדם היה ממכון הדם של אוקלהומה, אוקלהומה סיטי, אוקלהומה, ארה"ב. שימוש ברקמת שקדים ודם היה פטור מהסכמה בכתב. כל תורמי השקדים היו ילדים בריאים עם היסטוריה של שקדים דלקתיים (אך ללא כל דלקת נוכחית). דם היה מתנדבים צעירים. בקצרה, תאים בודדים הקניטו את השקדים. חלקים מועשרים בתאי B טוהרו באמצעות ריאגנטים של RosetteSep (StemCell Technologies Inc.) ושיפוע לימפופרפ (CellGro Mediatech Inc.) עם תוספת rbc של כבשים. תאי B מועשרים לאחר מכן לטוהר קרוב על ידי התדלדלות חרוזים מגנטיים באמצעות ערכת בידוד תאי B Miltenyi Biotec B II. תאי B נאיבים בודדו כ- IgD + IgM + CD38-(שקד) או CD27-(דם) ותאי Cδ-CS B בודדו כ- IgD + IgM-CD38 +, ותמלילי תאי זיכרון מסוג IgG בדם היקפיים הוגברו על ידי RT-PCR מתוך תאי זיכרון ממויינים (IgD - IgM - CD27 + איור 1 ב) באמצעות ציטומטר זרימה של Dako Cytomation MoFlo או BD FACSAria. לוחות של Igκ + ו-Igλ + מתאי תמימים ו-Cδ-CS מוינו מ-2 מהתורמים. מכיוון ששברי Igκ ו-Igλ היו דומים עבור כל המבחנים, השברים קובצו עבור הניתוחים כאן. כפי שחזה, רוב תאי Cδ-CS B היו שליליים Igκ (Igλ +). תאים בכמויות גדולות של 3 הפנוטיפים ממוינו ונכנסו ללוחות PCR עם 96 טובות על מנת להבטיח טוהר של תאים בודדים (98% -99% טוהר זוהה בסוג התאים הבודדים). נוגדנים המשמשים לציטומטריית זרימה היו אנטי- IgM מצומדים ל- APCs (Southern Biotechnology Associates), אנטי IgD מצומדים ל- PE (BD), ביוטיניליטים נגד CD38 ואחריהם סטרפטאווין מצומדות לטריקולור (Invitrogen), אנטי Igκ מצומדות ל-FITC (Invitrogen), ואנטי-CD27-מצומד ל-PE (Invitrogen).

תא יחיד RT-PCR ו- PCR. תאי B יחיד ממוינו לצלחות PCR המכילות 10 מ"מ Tris-HCL עם 40 יחידות/μl של מעכב RNase (Promega). הצלחות הוקפאו מיד על קרח יבש ואוחסנו ב -80 מעלות צלזיוס. כל תא הוגבר בתגובת RT-PCR חד-שלבית (Qiagen) תוך שימוש בקוקטייל של פריימר סנס ספציפי לאזורי המנהיג ופריימרים אנטי-סנס ספציפיים ל-Cμ- (נאיבי), Cδ- (Cδ-CS), או Cγ- אזורים קבועים עבור שרשראות כבדות ואזורים קבועי C or או קבועים ב- Cl עבור השרשראות הקלות. מיקרוליטר אחד מכל תגובת RT-PCR הוגבר בתגובות PCR נפרדות למשפחות הגן הכבדות והקלות בשרשרת הגן באמצעות פריימרים מקוננים. כל רצפי הפריימר פורסמו בעבר (7, 18) למעט הפריימרים נגד Cδ (חיצוניים, 5'-GTGTCTGCACCCTGATATGATGG-3 ', מקוננים, 5'-GGGAACACATCCGGAGCCTTG-3') והפריימרים אנטי-Cγ (חיצוניים, 5 ′ -TCTTGTCCACCTTGGTGTTGCT-3 ′, מקונן, 5′-AGGTGCTCTTGGAGGAGGGT-3 ′). מוצרי ה- PCR היו ברצף (Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer). לאחר זיהוי הגנים המשתנים, נעשה שימוש בפריימר סנס ייחודי לגנים המשתנים המסוימים ובפריימרים אנטי-סנס הקושרים את הגנים הצמתים המסוימים שימשו להגברת 1 μl של תגובת RT-PCR כדי לשלב אתרי הגבלה בקצוות הגנים המשתנים לשיבוט וביטוי. . חלק מרצפי הגנים המשתנים המוצגים להשוואה באיור 1, C ו- D, היו מנתונים היסטוריים שפורסמו בעבר על ידי המעבדה שלנו (12, 16, 33, 34). כדי ליצור את הגנים המשתנים שהוחזרו עבור הניסויים באיור 5, השתמשנו ב-PCR עם הארכת חפיפה של גדילים של תבניות כבדות משתנות, משתנה-אור ו-J ללא מוטציה ופריימרים חופפים המקודדים את אזורי CDR3 עם פריימרים V ו-J ספציפיים לגנים.

ביטוי נוגדן חד שבטי רקומביננטי. לאחר טיהור ועיכול, cDNAs המוגברים של הגנים המשתנים של נוגדנים מכל תא בודד היו משובטים לתוך וקטורי ביטוי המכילים אזורים קבועים של IgG, Igκ או Igλ כפי שתואר לעיל (7). פלסמי הכנה מקסי פלסמיד מקסי קיט (Qiagen) המכיל את גני Ig הכבדים והקלים בשרשרת הועברו לקו התאים 293A באמצעות סידן פוספט או מגיב תמצית Roche Applied Science FuGENE 6 בהתאם לפרוטוקול המוצע של היצרן. תאי 293A שעברו נגיעה הורשו להפריש נוגדנים ב-DMEM נטול סרום בתוספת 1% Nutridoma-SP (Roche) למשך 4 עד 5 ימים. נוגדנים טוהרו באמצעות עמודי חלבון A (לא פירומטיים). ביטוי וטוהר נוגדנים נאותים אומתו על ידי אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד, וריכוזי נוגדנים מטוהרים נקבעו באמצעות ערכת EZQ Protein Quantitation (Invitrogen).

ניתוחי ELISA ו- HEp-2 לאקטראקטיביות. כדי לסנן את הנוגדנים המובעים עבור תגובתיות או פולי-ריאקטיביות של DNA, לוחות המיקרוטיטר של ELISA (Costar Corning Inc.) צופו ב-10 מיקרוגרם/מ"ל תימוס עגל ssDNA או dsDNA (Invitrogen), LPS (Sigma-Aldrich), או אינסולין אנושי רקומביננטי (Fitzgerald) . צימוד IgG-peroxidase של עיזים ספציפי ל-y-שרשרת (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) שימש לזיהוי קישור של הנוגדנים הרקומביננטיים, ואחריו פיתוח עם מצע פרוקסידאז של חזרת (Bio-Rad). ספיגות נמדדו ב- OD415 על קורא מיקרופלט (התקנים מולקולריים).

הנוגדנים נבדקו לאיתור תגובתיות HEp-2 על ידי אימונופלואורסצנטי באמצעות שקופיות HEp-2 מסחריות לפי הפרוטוקול המוצע על ידי היצרנים (BION Enterprises Ltd.). שקופיות HEp-2 נותחו באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט של Zeiss Axioplan II. הנוגדנים נבדקו לקשירת ANA באמצעות ערכת QUANTA Lite ANA (INOVA Diagnostics Inc.) וזוהו באמצעות פרוקסידאז-מצומד של IgG (ספציפי לשרשרת γ) של עיזים (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) ולאחר מכן פיתוח עם מצע פרוקסידאז של חזרת (ביו-ראד). כל תגובתיות HEp-2 ו- ANA הושוותה לסרטי בקרה חיוביים של חולה זאבת ולסרה לא-תגובתית מתורם דם בריא. מבחני ה-QUANTA Lite ANA נורמלו לנוגדן ANA + חד שבטי בבית (mAb: 050504P181L+B09).

סטָטִיסטִיקָה. ניתוחים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת Microsoft Excel 2003 או GraphPad Prism 4. לניתוחים באיור 1, A ו- B, ואיור 2 ב, סטודנטים דו-זנביים t בוצעו בדיקות. עבור הניתוחים באיור 2, A ו- C, איור 3 ואיור 4 ב, בוצעו 2 בדיקות.

אנו מודים לג'ודית א. ג'יימס על הקריאה הביקורתית של כתב היד ועל מתן הצעות חשובות. אנו מודים לארי ויסוצקי על שסיפקו, ולמרטין וייגרט ודייויד סטולר על שאיפשרו לנו להשתמש במונוקלונים השליטה החיובית 3H9 ו- H241 נגד DNA. סיוע טכני ניתנו על ידי לני אברהם ושריל כריסטופרסון ממתקן רצף הדנ"א של אוקלהומה (OMRF), צוות מתקן ליבת ההדמיה של OMRF, וג'ייקוב בס ודיאנה המילטון במתקן הליבה של ציטומטריה של OMRF Flow. אנו מודים גם לבית החולים לילדים של אוניברסיטת אוקלהומה ובמיוחד שרה ג'ונסון וג'וסו מדינה על כך שהם זמינים דגימות שקדים. ליסה רידג'ווי סיפקה עזרה פקידותית. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענקי NIH P20RR018758-01 ו- P20RR15577-02 ל- P.C. ווילסון.

השתמשו בקיצורים לא סטנדרטיים: ANA, אנטיגן אנטי-גרעיני Cδ-CS, מחלקה עברה ל-Cδ CDR, אזור הקובע משלימות dsDNA, DNA דו-גדילי HEp-2, שורת תאי אפיתליומה אנושית 2 ssDNA, DNA חד-גדילי.

ניגוד עניינים: המחברים הצהירו כי אין ניגוד אינטרסים.

מידע התייחסות: ג'יי קלין. להשקיע.117: 1558–1565 (2007). doi:10.1172/JCI27628


רקומבינציה של החלפת מחלקות של נוגדנים מתרחשת לפני היווצרות המרכז החיידקי.

דגשים: תעתיקי קו הנבט מגיעים לשיא לפני היווצרות GC ויורדים במהירות ב-GCs.
שיבוטים הנשלטים על ידי IgM נמצאים ב-GCs מאוחרים, בטענה נגד החלפת Ig מתמשכת
CSR נפסק במידה רבה עם הופעת היפר -מוטציה סומטית
ירידת CSR עקב ביטוי נמוך של GLT ו- APE1 מתוזמנת על ידי BCL6 (מקור: Roco et al., Abstract Graphical. Immunity)

מאמינים שעם החיסון מתרחשים שני תהליכים חשובים שמשנים את התפקוד והתגובתיות של נוגדנים (אימונוגלובולינים, Ig) וכתוצאה מכך הגנה חיסונית ארוכת טווח. תהליך אחד הוא שינוי בתגובתיות האנטיגן של תאי B עקב עריכה של צד זיהוי האנטיגן של הנוגדן (תהליך שנקרא היפר-מוטציה סומטית, SHM) עם בחירה משובטת שלאחר מכן, התהליך השני הוא רקומבינציה של מתג כיתות (CSR). רקומבינציה של מתגי כיתות היא סידור מחדש של מוקד השרשרת הכבדה של האימונוגלובולין (Ig). תאי B בוגרים מסוגלים בזאת לעבור מאיזוטיפ IgD-IgM לכיתות איזוטיפ IgA, IgG או IgE בעלות פונקציות אפקטור שונות, תוך שמירה על סגוליות האנטיגן שלהם. האמינו כי שני התהליכים מתרחשים במרכזים נבטיים (GCs), מיקרו -סביבה מיוחדת באיברים לימפואידים משניים. במאמר האחרון של Roco et al., הם מראים כי CSM מתרחש למעשה לפני היווצרות GC ומשנה את ההבנה הנוכחית שלנו לגבי תגובות נוגדנים.

המחברים השתמשו במודל חיסון שבו עכברים קיבלו תאי B ספציפיים של ביצת תרנגולת (HEL) וחלבון HEL ומצאו כי עדויות לרקומבינציה של CSR התרחשו כבר 1.5 ימים לאחר החיסון (בתא T: גבול תאי B), לפני כן. להיווצרות GC לאחר 3.5 ימים. כדי לטפל בתופעה זו ברפרטואר פוליקלונאלי, הם ניתחו מרכזי נבט מבודדים של עכברים מחוסנים והעריכו את מספר המוטציות שהושגו ואת איזוטיפ האימונוגלובולינים הספציפי. ניתוחים פילוגנטיים הראו כי החלפת מחלקות התרחשה לפני קבלת מוטציות באזור המשתנה של הנוגדן. ייתכן שה-CSR המופחת עם היווצרות GC נובעת מוויסות העל של מדכא התעתיק BCL6, החיוני להיווצרות מרכז נבט, שכן BCL6 נקשר לאזור המקדם של APEX1 (נדרש עבור CSR) ולא APEX2 (נדרש עבור SHM), ובכך עלול לחסום. הפעולה של APEX1.

ממצאים אלו שופכים אור חדש על העיתוי של CSR, שכן אחריות CSR מתמשכת בתוך ה-GC תטה את התפלגות האיזוטיפים ואינה תומכת ב-GCs הנשלטים על ידי IgM שדווחו על ידי Roco et al. בנוסף, תחזוקה של תאי B בזיכרון IgM+ עשויה למעשה לייצג מאגר של זיכרון תאי B שיכול לעבור CSR מאוחר יותר עם הפעלה מחדש כדי להסתגל לתגובות שונות. חולים עם הפרעות חיסוניות בתיווך תאי B עשויים להפיק תועלת מתובנות אלה לגבי האופן שבו תא B מווסת CSR מכיוון שזה מזהה חלון מסוים להתערבות קלינית אפשרית.


6. הפעלת תאי B והתמיינות תאי פלזמה

איור 1: השלבים התאיים של התמיינות מאוחרת של תאי B. רוב תאי B הבוגרים ממוקמים בזקיקי איברי הלימפה וידועים כתאי B זקיקים. תת-קבוצות מיוחדות אחרות של תאי B כוללות תאי אזור שוליים B, המתמקמים לאזור שבין העיסה האדומה והלבנה בטחול, ותאי B1, שנמצאים בחלל הצפק והפלאורלי. כל קבוצות המשנה של תאי B מבטאות את גורמי התעתוק המשויכים חלבון קופסא 5 (PAX5). גורם 8 אינטרפרון רגולטורי PU.1 (IRF8) ו- BTB ו- CNC הומולוג 2 (BACH2), בעוד שרמות נמוכות של IRF4 נגרמות על ידי איתות קולטן אנטיגן. תאי B המופעלים על ידי אנטיגן (המכונים גם לימפובלסטים B) מסוגלים להתרבות מהירה, רקומבינציה של מתג אימונוגלובולינים והתמיינות לפלסמבלאסטים קצרי מועד המבטאים רמות גבוהות של IRF4 ו-X-box-binder חלבון 1 (XBP1), ובינוניים. רמות (אמצע) של חלבון התבגרות המושרה על ידי לימפוציטים מסוג B (BLIMP1) והופרד נוגדן. תאי B הזקיקים יכולים גם לווסת את לימפומה של תאי B 6 (BCL-6) ולהדחיק את ביטוי IRF4 במהלך תגובת המרכז הנבט (GC) כאשר מתרחשת התבגרות זיקה של קולטן האנטיגן. תאי B עם קולטני אנטיגן בעלי זיקה גבוהה יוצאים מה-GC ומתמיינים לתאי זיכרון B, המבטאים חתימה תעתיק דומה לתאי B בוגרים, או לתאי פלזמה ארוכי חיים, המבטאים רמות גבוהות של BLIMP1, IRF4 ו-XBP1 ומייצרים גדולות כמויות של נוגדנים. למרות שתאי פלזמה BLIMP1h נובעים מתאי BLIMP1mid, לא ידוע אם תאי פלזמה נגזרים מפלסמבלסטים (המסומנים בחץ המקווקו) או משלב מוקדם יותר של תאי פלזמה. התרומה של תאי B השוליים ותאי B1 לתא תאי הפלזמה ארוכי החיים מתאפיינת גם היא בצורה גרועה. [Nutt et al., Nature Reviews Immunology, 2015]

תגובת מרכז הנבט (GC).

  • מרכזי נבטים (GCs) הם אזורים בתוך איברים לימפואידים משניים המתפתחים בעקבות תאי T וחשיפה לאנטיגנים תלויים בשפות. אזורים אלה הם מקורות לנוגדנים בעלי זיקה גבוהה.
  • אחד המסלולים הבסיסיים הדרושים לתגובת GC הוא האינטראקציה בין תאי עוזר זקיקים פעילים CD4 T (Tfh) לבין תאי B.
  • תאי Tfh חיוניים לתגובת ה- GC מכיוון שהם ממלאים תפקיד בהגברת היעילות של תגובות נוגדנים
  • תאי GC Tfh מבטאים IL-21 ברמות גבוהות. ציטוקין זה חשוב לבידול ולתפקוד של תאי Tfh. תאים אלו מייצרים גם IL-4, IFN-&gamma ו-IL-2 ברמות מתונות/משתנה. Bcl-6 הוא גורם שעתוק וסמן חשוב של תאי Tfh. גורם שעתוק זה חשוב להתפתחות תאי Tfh ותאי B מרכז.
  • תאים Tfh הוכחו כממלאים תפקידים מכריעים בייצור תגובות נוגדנים בעלות זיקה גבוהה ועמידות לאורך זמן לחיסונים, מחלות אוטואימוניות, אלרגיות ואפילו סרטן. תאים אלו חשובים ב-HIV מכיוון שהם מסייעים בפיתוח של נוגדנים מנטרלים באופן נרחב שיכולים למנוע כניסה של וירוסים על פני תת-הסוגים השונים של ה-HIV.
  • תאי B מחויבים ל-GC עוברים לזקיק המרכזי עקב אובדן EBI2 ומתחילים את תגובת ה-GC.
  • תגובת ה- GC מייצגת מחסום שבו הרפרטואר BCR ספציפי לאנטיגן משתנה באופן אקראי בתאי GC B המתרבים מאוד באזור החשוך (DZ) באמצעות היפר-מוטציה סומטית (SHM) הנגרמת על ידי הפעלה המושרה על ידי cytidine deaminase (AID).
  • תאי B מוטציה שרכשו מוטציות לשיפור זיקה נבחרים על ידי תאי T באזור האור (LZ) של ה- GC או עלולים להעביר חזרה ל- DZ ולעבור סיבוב נוסף של SHM כאשר הזיקה שלהם אינה תחרותית.
  • לפיכך, תאי B נבחרים באופן חיובי באמצעות מחזורים איטרטיביים והבהרת המנגנונים הבסיסיים תספק מידע חשוב להתפתחות החיסונים.
  • תגובת ה- GC נדרשת גם עבור רקומבינציה של מתגים בכיתה (CSR). תאי פלזמה בעלי זיקה גבוהה הנודדים חזרה ל- BM הם נקודת הסיום של תגובת ה- GC.

איור 2: הטרוגניות והתמיינות של תאי T מרכזיים נבטיים. המחויבות של תאי T בקידום תגובות תאי B ממרכז החיידקים כנגד חיסונים של אנטיגנים תלויה במידה רבה לפחות בתחילה במעורבות TCR ובקוסמולציה של CD28 על ידי תאים דנדריטים המציגים אנטיגן. עם זירוז BCL6 חולף לאחר ההפעלה, תאי T4 נאיביים CD4+ (Tnaive) מולידים תאי T (pre-Tfh) עוזרים במרכז הזרעים הזרעיים, הדורשים לאחר מכן מגע עם תאי B קוגנים כדי לקבל אותות אכיפה חוזרת באמצעות ICOS, PD1 ו- איתות SAP לייצוב BCL6 ומחויבות למסלול ההתמיינות של תאי Tfh של מרכז הנבט (GC). צימוד תאי B ואיתות SAP חשובים גם ליצירת תאי NK Tfh מתאי NKT (iNKT) בלתי משתנה ותגובתם לאנטיגנים המכילים גליקוליפידים. דיכוי בתיווך תאי T של תאי B ממרכז נבט אוטו-ריאקטיבי ו/או שאינם ספציפיים לאנטיגן מתווך על ידי תאי CD8+ מווסתים של CD8+ (CD8+ Treg) (שמעכבים ישירות תאי Tfh) ורגולטורים זקיקים (Tfr) תאים. תאי Tfr מתפתחים מתאי T רגולטוריים טבעיים (nTregs) התלויים ב-BCL6 (nTregs) המקבלים אותות TCR ו-CD28 וגם אותות בתיווך SAP במהלך אינטראקציות קוגנטיות של תאי B. Fo B, תאי B זקיקיים GC B, מרכז B נבט זיכרון B תא, זיכרון B תא. [R, Ramiscal & amp C, Vinuesa. סקירות אימונולוגיות 2013 כרך 252: 146�]


האם החלפת מחלקות מתרחשת הן בתאי B והן בתאי פלזמה? - ביולוגיה

תאי פלזמה הם תאי דם לבנים מסוג B-לימפוציטים המובחנים המסוגלים להפריש אימונוגלובולין, או נוגדן. לתאים אלה יש תפקיד משמעותי בתגובה החיסונית ההסתגלותית, כלומר היותם התאים העיקריים האחראים לחסינות ההומורלית. ללא נוכחותם, נאמר כי לאדם יש אגמגלובולינמיה והוא רגיש מאוד לזיהום חוזר. כאן נסקרים השושלת ההמטופואטית, המבנה והתפקוד של תאי פלזמה, יחד עם המצגים הקליניים הנובעים מצמיחה והתפתחות לא נכונה של תאי פלזמה.

פוּנקצִיָה

תאי פלזמה מתפתחים מלימפוציטים B המופעלים על ידי אנטיגן באיברים לימפואידים משניים, כגון הטחול ובלוטות הלימפה, לאחר גירוי אנטיגני.ידוע כי גורמי שעתוק Blimp-1, IRF4 ו-XBP-1 חיוניים להתמיינות של תאי B בוגרים לתאי פלזמה.[1][2] BLIMP-1 ו-XBP-1 נתפסים לעתים קרובות כמווסתים מרכזיים של התמיינות תאי פלזמה, כאשר Blimp-1 פועל במעלה הזרם של XBP-1. ] [7]   הפעלת UPR מסייעת לתא הפלזמה ויכולת ההסתגלות של כל הזמן לסביבה המשתנה למרות שתפקוד UPR & rsquos עדיין בבדיקה, האמונה היא שה- UPR ממלא תפקיד במעקב אחר ריכוז אימונוגלובולין וסינון ו/או דיכוי הפרשת אימונוגלובולינים.[8]

הדם הבלתי בוגר ביותר ותא הפלזמה של תא הפלזמה ושושלת#160 הוא הפלזמה   פלסמאלים יכולים להתרבות ולהפריש כמויות קטנות של נוגדנים. תאי הפלזמה המובחנים או בוגרים אינם מתרבים, גדולים בהרבה מתאי B ויכולים להפריש כמויות גדולות של נוגדנים. במהלך אורך חייהם של 2  עד 3 ימים, הם מסנתזים ומפרישים נוגדנים באופן רציף עם ספציפיות לאנטיגן שעורר את מבשר תאי הפלזמה להתרבות ולהתמיין. ההערכות הן שתא פלזמה יחיד יכול להפריש מאות לאלפי מולקולות נוגדנים בשנייה, מדד יוצא דופן לכוחה של התגובה החיסונית למאבק בפתוגנים. תאי פלזמה, כמפעלי נוגדנים, הם תורמים חשובים לחסינות הומורלית.

למרות שייצור והפרשת נוגדנים נחשבו זמן רב לתפקידם הבלעדי של תאי פלזמה, מחקרים עדכניים מצביעים על מעורבות תאי פלזמה בוויסות התגובה החיסונית. במסגרת יכולת זו, מחקר מצא כי תאי פלזמה מעכבים התפתחות של תאי T-helper פוליקולריים.[9] עכברים נטולי תאי פלזמה, באמצעות נוק-אאוט של הגן BLIMP-1, ביטאו רמות גבוהות של T-helper פוליקולרי. תאים, אשר בתורם מייצרים IL-21, חלבון קריטי לתהליכי התבגרות זיקה, אריכות ימים ותפקוד מרכז נבט, והבחנה סופנית B- לימפוציטים. [1] [10]   העלייה ב- IL-21 הנובעת מ היעדר תאי פלזמה יכול, אם כן, לשנות את פעילות המרכז החיידק יחד עם גורל שונה ו/או רמות לימפוציטים מסוג B. לעומת זאת, נראה שתאי T- עוזר זקיקיים מוגבלים ו- IL-21 מעלים סביבה תחרותית לפיזיולוגיה של מרכז נבט פעיל, וכתוצאה מכך זיקה והבשלה של לימפוציטים B מוגברים. ביחד, ממצאים אלה מציעים שקיימת לולאת משוב שלילי ספציפית לאנטיגן, המווסתת את ייצור תאי הפלזמה, ובכך מפחיתה מספרי עודף של תאי פלזמה מיותרים ועלולים להיות פתולוגיים.[9][10]

היסטוכימיה וציטוכימיה

כל תאי הפלזמה, אם כי תקינים או ממאירים, נבדלים על ידי ביטוים של CD38 ו- CD138. #160 לעומת זאת, CD138, הידוע גם בשם סינדקן-1, מאפשר לתא הפלזמה להיצמד לחלבוני המטריצה ​​החוץ-תאיים. מחקר שנערך לאחרונה מצא כי בנוסף לתפקידו בהיצמדות תאי פלזמה, CD138 ממלא תפקיד נוסף בפעולה כקולטן משותף לגורם גדילה אפיתל (EGF), במיוחד בהקשר של מיאלומה נפוצה.[11][12]& #160 למרות שתאי פלזמה ממאירים מבטאים CD38 ו- CD138 לצד עמיתיהם הרגילים והלא ממאירים, מאפיין ייחודי לתאי פלזמה ממאירים הוא אובדן ביטוי CD19 לצד הביטוי החריג האפשרי של CD56, סמן המאפיין תאים הרוצחים (NK) טבעיים . [11] [13] עם זאת, יש לציין שלא כל תאי המיאלומה מבטאים CD56.

סמן ראוי לציון נוסף של תאי פלזמה הוא CD79a. החלבון ממלא תפקיד קריטי בהעברת האותות של אנטיגן B-לימפוציטים ובהתפתחות והתייצבות הכוללת של לימפוציטים מסוג B [14] למרות ש- CD79a קיים בציטופלזמה של שני לימפוציטים מבשרי B ותאי פלזמה בוגרים ומובחנים, אובדן חריג שלו. של ביטוי צוין בדגימות מסוימות של ניאופלזמות של תאי פלזמה.

אור מיקרוסקופיה

תאי הפלזמה משתנים בגודלם בין 14 ל -20 מיקרומטר. הם תאים עגולים לביצים המכילים שפע של ציטופלזמה כחולה עמוקה עם אזור פרינו-גרעיני חיוור המתאים למנגנון הגולגי. יש להם גרעין עגול, הממוקם באקסצנטריות, עם כרומטין גס המסודר בדוגמת שעון. הם עשויים להכיל תכלילים ציטופלזמה הנקראים גופי ראסל או תכלילים כדוריים מרובים ארוזים בציטופלזמה שלהם (מוט, ענבים או תאי מורול). גופי ראסל והתכלילים של תאי Mott הם cisternae אנדופלזמטיים מורחבים המכילים אימונוגלובולינים מעוכים.

מיקרוסקופיה אלקטרון

מיקרוסקופ אלקטרוני מגלה שתאי הפלזמה מכילים גרעין עגול אקסצנטרי עם כרומטין מעובה וגרעין מפותח היטב. הכרומטין הקשור לממברנה הגרעינית נותן לגרעינים של תאי פלזמה בוגרים מראה גלגל עגלה בקטעים היסטולוגיים. הציטופלזמה מכילה מערכים מקבילים של רטיקולום אנדופלזמי מחוספס, סיבים ציטופלזמיים ומיטוכונדריות פולמורפיות רבות. הציטופלזמה מכילה גם קומפלקס גולגי בצמוד לגרעין. תכליות תוך-ציטופלסמיות מסוגים שונים והווה גבישי mdashelliptical, עגול או דמוי מחט. הצטברות משמעותית של אימונוגלובולינים יוצרת תכלילים אלה.

משמעות קלינית

סטייה משגשוג תקין של תאי פלזמה עלולה להוביל למספר פתולוגיות קליניות.

ניאופלזמות של תאי פלזמה הן באופן אופייני ריבוי חריג של תאי פלזמה משובטים המייצרים אימונוגלובולין חד-שבטי, בעל שרשרת כבדה, המכונה חלבון M. על ידי ריבוי כזה, גידולים בתאי פלזמה יכולים לסווג למספר מצבים פתולוגיים מוגדרים. קביעת היקף הניאופלזמה כרוכה בהערכה אבחנתית מלאה, הכוללת את הבדיקות והתצפיות הספציפיות הבאות: CBC מלא עם אלקטרופורזה דיפרנציאלית של חלבון בסרום (להערכת חלבון M) אימונופיקציה (לקביעת כמות וסוג האימונוגלובולין) שרשרת קלה נטולת סרום ניתוח סקר שלד מלא (כדי להעריך את נוכחותם של נגעים ליטיים) וביופסיה של מח עצם (כדי לקבוע את אחוז תאי הפלזמה המשובטים וניתוח ציטוגנטי פוטנציאלי).[17]

ניא פלזמות של תאי פלזמה

גמופתיה מונוקלונלית בעלת משמעות לא ידועה, הידועה גם בשם MGUS, היא הביטוי הפחות חמור של ניאופלזמה של תאי פלזמה. MGUS מסווג כאוכלוסייה משובטת של תאי פלזמה המפרישים אימונוגלובולין, אם כי ריכוז חלבון M בסרום אינו עולה על 3 גרם/ד"ל. [18]   כך גם תאי הפלזמה המשובטים אינם עולים על 10% ממח העצם. מטופלים לרוב אינם סימפטומטיים וחולים רבים עם MGUS אינם מתקדמים לממאירות. 160 גברים מושפעים לעתים קרובות יותר מנשים, והתדירות עולה עם הגיל. יתרה מכך, מחקר זיהה שכיחות גבוהה יותר אצל אנשים ממוצא אפריקאי.[20]

מחקרי אימונופיקציה של חלבון חד שבטי מצביעים על כך שכ-70% ממקרי ה-MGUS הם IgG, 15% הם IgM, 12% הם IgA ו-3% הם דו-שבטיים. עם התקדמות קלינית פוטנציאלית ברורה. חולים עם IgM MGUS עשויים להתקדם ללימפומה לימפופלסמטית או ל- Waldenstr & oumlm macroglobulinemia. לעומת זאת, התקדמות מקרי MGUS שאינם IgM מתבטאת כמיאלומה נוגעת או מיאלומה נפוצה.

מיאלומה עזה

כאשר תאי פלזמה ממשיכים להתרבות באופן חריג, אדם עשוי להתקדם מעבר לקריטריונים של MGUS בשלב המוגדר קלינית כמיאלומה עשן. בניגוד ל-MGUS, רמות חלבון M בנסיוב שוות או יותר מ-3 גרם/ד"ל, ותאי פלזמה משובטים מהווים 10% עד 59% ממח העצם.[18] לפי הגדרה, חולה עם מיאלומה מעושנת. אינו מופיע עם נגעי CRAB. נגעי CRAB מדגימים עלייה בסידן, חוסר יעילות כלייתית, אנמיה ומחלת עצם (נגע(ים) ליטיים). הם ביטוי פוטנציאלי הנראה במיאלומה נפוצה, כפי שהוסבר בסעיף קטן הבא.

בדומה ל- MGUS, נוכחותם של קריטריונים למיאלומה דולקת באה לידי ביטוי באופן אסימפטומטי. [22]   בניגוד ל- MGUS, עם זאת, אנשים הסובלים ממיאלומה דולקת הם בעלי סיכוי גבוה יותר להתקדם לשלב של מיאלומה נפוצה סימפטומטית: קצב ההתקדמות מעיבוי. מיאלומה עד מיאלומה נפוצה היא 10% בשנה בחמש השנים הראשונות 3% בשנה בחמש השנים הבאות ו -1% בכל שנה ואילך. [22]

מיאלומה נפוצה

ההצגה החמורה ביותר של ניאופלזמה של תאי פלזמה היא זו של מיאלומה נפוצה. אף על פי שדומה למיאלומה עזה בריכוזי חלבון M בסרום של לפחות 3 גרם/ד"ל, קריטריונים של מיאלומה נפוצה דורשים נוכחות של מאפיין נוסף אחד לפחות. אלה כוללים נוכחות של עוד אחד מנגעי CRAB, תאי פלזמה משובטים של מח עצם העולים על 60%, יחס שרשרת אור ללא סרום שווה ל -100 או יותר, ולפחות נגע מוקד אחד שהתגלה ב- MRI. [18]  

מיאלומה נפוצה מייצגת כ -10% מכלל הניאופלזמות ההמטופויטיות. [19] והתסמינים משתנים מאדם לאדם ונעים בין סימנים מוקדים ולא ספציפיים למעורבות מערכתית. התסמינים הנפוצים כוללים אנמיה, בדרך כלל כאבי עצמות נורמוכרומיים ונורמוציטים, במיוחד באי ספיקת כליות בחזה ובגב (קריאטינין מוגבר) עייפות, זיהום וירידה במשקל. מוות הנובע מזיהום או אי ספיקת כליות. חציון ההישרדות נע בין 2.5 ל -5 שנים ומשתנה מאוד.

ניאופלזמות אחרות של תאי פלסמה

עמילואידוזיס מסווגת כתצהירתם של סיבי שרשרת קלה של אימונוגלובולין מתאי פלזמה משובטים, לעיתים קרובות מהרכב למבדה. כאלה יכולים להתרחש באופן עצמאי או כתוצאות של MGUS, מיאלומה בוערת או מיאלומה נפוצה. [19]   התערבות של סיבי עמילואיד מתרחשת לרוב בכליות, בלב, במערכת העצבים ובמערכת העיכול. כתם חיובי בקונגו אדום מאשר את קיומו של עמילואיד, המתבטא בצבע אדום/ורוד תחת מיקרוסקופית אור והזרמה כתפוח ירוק-תפוח כאשר הוא מקוטב. גידולים נוספים של תאי פלזמה כוללים פלסמציטומה בודדת של עצם ופלסמציטומה חוץ -גופית.

חסרים בתאי פלזמה

בניגוד להפרעות הקודמות, המתאפיינות בתאי פלזמה מוגזמים או מתוצרי הלוואי שלהן, נובע מחוסר חיסוני משתנה נפוץ (CVID) מחוסר במספר תאי פלזמה הולם. האבחנה של ההפרעה נקבעת על ידי רמות מופחתות של IgG, IgA ו/או IgM. [23]   באופן ספציפי, CVID מצוין ברמת IgG של> 400 מ"ג/ד"ל. המחסור באימונוגלובולין גורם לרגישות משמעותית יותר ויותר לזיהומים חיידקיים. יתר על כן, אנשים עם CVID נוטים למספר פתולוגיות כרוניות, כולל מחלת ריאות כרונית, מחלות מעי דלקתיות, הפרעות אוטואימוניות והיפרפלזיה לימפואידית. מכיוון שאבחנה זו תישאר אצל אדם לאורך כל חייו, כיילון נוגדנים לפתוגנים נפוצים (כלומר,  Haemophilus influenzaeבדיקות עקביות. [23]   אם רמות IgG יורדות מעבר ל -200 מ"ג/ד"ל, טיפול תחליפי אימונוגלובולינים הוא ההמלצה.

בנוסף ל-CVID, למעלה מ-100 ליקויים חיסוניים ראשוניים מיוחסים להתפתחות ו/או תפקוד לא תקין של לימפוציטים B, כולל ייצור לא תקין של אימונוגלובולינים. אגמגלובולינמיה מקושרת X (XLA) מאופיינת במוטציה BTK הגן (Bruton & rsquos tyrosine kinase), המעכב היווצרות תאים לפני B. בהתחשב בירושה של XLA & rsquos, זכרים מושפעים כמעט אך ורק. לעומת זאת, מחסור סלקטיבי ב- IgA (SIGAD), החסר החיסוני העיקרי הנפוץ ביותר, משפיע על זכרים ונקבות באופן שווה. [24]   למרות שהמוטציה הספציפית הקשורה ל- SIGAD עדיין לא מובנת במלואה, ידוע שהמחלה מופיעה בדפוס משפחתי. , והרעיון של מוטציות מרובות הגורמות ל- SIGAD נמצא בבדיקה. כפי שמשתמע מהשם, חולים עם מחסור סלקטיבי ב-IgA חסר IgA הקיים בסרום וברירית IgM ו-IgG רמות תקינות. לכן נראה כי המצב נובע ממעבר לא תקין של איזוטיפ ל- IgA ו/או התבגרות תאי B המפרישה IgA. [24]   בהתחשב בכמות העצומה של חסרונות ראשוניים נוספים המיוחסים ללימפוציטים מסוג B ותאי פלזמה, הבנה מתמשכת. של תאים אלה, הפיזיולוגיה חיונית לקידום נכון של מדעי הבריאות.


עמידה בהנחיות האתיקה

ניגוד עניינים

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך והמחקר הפדרלי הגרמני (BMBF 01 EO 0803) למרטה ריצי, הקרן הגרמנית לחקר הסרטן באמצעות מענק 109138 וה-DFG באמצעות TRR130 להרמן אייבל והלן קראוס אן-קתרין קינצלר נתמכה על ידי מרכז המחקר הביו -רפואי NIHR אוקספורד.

הייקו סיק מצהיר כי אין לו ניגוד עניינים.

זכויות אדם ובעלי חיים והסכמה מדעת

מאמר זה אינו מכיל מחקרים בנושא בעלי חיים שבוצעו על ידי אף אחד מהמחברים. בכל הנוגע למחקר של המחברים המצוטט במאמר זה, כל הנהלים בוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים של הוועדה האחראית לניסויים בבני אדם ועם הצהרת הלסינקי משנת 1975, כפי שתוקנו ב-2000 וב-2008.


דִיוּן

המאפיינים של תאי B תמימים נותרו מעורפלים. המחקר שלנו מוכיח שתאי B נאיביים, שאינם מבטאים CD27 ונושאים את הרצפים הבלתי מושתקים של הגן Ig-region V, יכולים לעורר CSR, AID, וכל איזוטיפים Ig מלבד IgA. תאי B נאיביים, כמו תאי B27 וזיכרון B, נמצאו מתרבים ומתמיינים לתאי פלזמה ללא היפר -מוטציה סומטית ניכרת, דבר המצביע על כך שהנוגדנים המיוצרים הם בעלי זיקה נמוכה.

ניתן לגרום לייצור של IgG ו-IgM אך לא של IgA מתאי B תמימים בניסוי שלנו על ידי גירוי של קולטני Ig על ידי איתות SAC ו-CD40 בשילוב עם ציטוקינים כמו IL-2 ו-IL-10. מספר חוקרים 15,26 דיווחו שתאי IgD + B המשמשים כתאי B נאיביים ייצרו Igs, למרות שהאוכלוסייה מכילה תאי CD27 + B. התוצאות שלהם מצביעות על כך שתאי IgD + B של פני השקד מייצרים IgG1, IgG2 ו-IgM בנוכחות SAC + IL-10 + CD40/CD32T27 ובעלי הנטייה הייחודית ליצור IgM בתגובה לקישור צולב סימולטני של Igs ו-CD40 על פני השטח. .15

הן איתותי IL-4 והן CD40 נחוצים לסינתזת IgE. עם זאת, בניסוי זה, לא רק תאי B27 של זיכרון CD27 + אלא גם תאי B27 נאיביים יכולים לייצר IgE כאשר תאי B מגורים עם IL-4 + CD40/CD32T. נבדלה בין תאי CD27-B לתאי פלזמה, אם כי במידה מועטה, בנוכחות IL-4 + CD40/CD32T. בהקשר זה, we9 ואחרים 30 הוכיחו שניתן לייצר IgE על ידי תאי B נאיבים בחולי תסמונת היפר-IgM המקושרים ל- X. לפיכך, ברור שגם לזיכרון CD27+ וגם לתאי B תמימים של CD27 יש את היכולת לייצר IgE בתגובה ל-IL-4 ומספיק איתות CD40. עם זאת, איתות IL-4 ו-CD40 גרמו רק לרמות שוליות של ייצור IgG ו-IgM על ידי תאי CD27 - ו-CB B בוגרים (נתונים לא מוצגים).

TGF-β נמצא כמעכב את צמיחת הלימפוציטים והפרשת IgG ו- IgM מתאי B.31,32 לאחר מכן, דווח כי TGF-β עורר את הפרשת IgA מטחול מגורה ליפופוליסכריד או תאי Peyer B ב עכברים systems23,24 וכן החלפת מחלקת IgA מכוונת TGF-β בתאי B אנושיים בנוכחות שיבוטים של PWM + CD4 + פעילים של תאי T.33 דו"ח אחד קובע כי TGF-β ו-IL-10 משתפים פעולה בהגברת ה-IgA ייצור מתאי IgD + מופעלים מסוג IgD + B אנושי ובעיכוב ייצור IgA מתאי IgD-B.15 במחקר אחר, 34 ייצור IgA נגרם מתאי IgD + B עם תאים דנדריטים בנוכחות IL-10 + TGF-β + CD154 transfectants. אותו מחקר מצא כי TGF-β הפחית באופן בלתי צפוי את הייצור של IgA כמו גם של IgG ו- IgM מתאי B מבוגרים או תאי B זיכרון בנוכחות SAC + IL-10 + IL-2 + CD40/CD32T, בעוד CD27 -תאי B לא ייצרו כל IgA במחקר שלנו גם לאחר הוספת TGF-β בנוכחות SAC + IL-10 + IL-2 + CD40/CD32T. הסיבות לאי התאמה זו בממצאי ייצור IgA בין נתונים שפורסמו בעבר לנתונים שלנו אינן ברורות. הסבר אפשרי אחד הוא שתאי B הנאיביים המשמשים בניסויים השונים שונים. החוקרים האחרים15,34 השתמשו בתאי IgD + B כתאי B תמימים למרות שתאי IgD + B מכילים תאי B בזיכרון IgD + CD27 + בתאי B המבוגרים.

לסינתזה של Ig של תאי B קודמת שעתוק של mRNA של קו הנבט, ו-mRNA בוגר התבטא לאחר CSR. CSR מחליף את הגנים של האזור הקבוע של השרשרת הכבדה של Ig לביטוי מ-Cμ לגנים CH אחרים. CSR מתרחש בין 2 אזורים רחבים המקיפים אזורי S, וכתוצאה מכך מחיקה בלולאה של מקטע DNA מתערב.16 מכיוון שתאי B תמימים במחקר שלנו יצרו IgG, IgM ו-IgE, חקרנו עוד את יכולת השראת CSR על ידי תאי B תמימים לאחר גירוי. הממצאים שלפיהם תאי B תמימים הביעו תעתיקי נבט ותעתיקי γ בוגרים הוכיחו שלתאים יש יכולת להתרחש CSR עם הגירויים המתאימים. בניגוד לתאי B תמימים, תאי זיכרון B, שיש להם קולטני Ig כגון IgA, IgM, IgG ו-IgE על פני השטח שלהם, ביטאו באופן מכונן תעתיקי γ בוגרים ללא גירוי.

תאי הטחול -/ - תאי הטחול לא הצליחו לעבור CSR למרות שהם הביעו תמלילי זרעים. כדי להבהיר נקודה זו, חקרנו ביטוי AID על ידי תאי B נאיביים. תאים B תמימים הביעו AID להפליא בעת גירוי, ככל הנראה מעורבים בדיוק של CSR כתוצאה מכך. מכיוון ש-CD27, שהוא סמן תאי B בזיכרון, הושרה גם על ידי תאי B תמימים, AID עשוי להיות מעורב בביטוי CD27 ועשוי לווסת את ההתמיינות לתאי זיכרון B עם היפרמוטציה סומטית.

מכיוון שעלולה להתרחש היפרמוטציה סומטית ב-GCs, שבהם תאי B מופעלים ומתרבים, ואיתות CD40 או BCR מעודדים באופן משמעותי את התפשטות תאי B, האינטראקציה CD40-CD154 או BCR-antigen עדיין נשארת כמועמדת לגורם לגורם להיפרמוטציה סומטית. . בנוסף, הצמדה של CD40 על ידי anti-CD40 mAb + CD32T עם או בלי IL-4 שיפרה מאוד את התפשטות תאי B וייצור IgE בהשוואה ל- anti-CD40 mAb בלבד. כדי להבהיר את ההשפעות של האינטראקציה CD40-CD154 ושל מעורבות BCR על השראת מוטציה סומטית, השתמשנו בתאי CB B ובתאי B בוגרים PB CD27 - תאי B תמימים, שניהם נשאו רצפים ללא מוטציה ב-Ig Vחגנים של 5 אזורים. איתות CD40 לא גרם למוטציות סומטיות מ- CB ותאי B מסוג NaD מבוגר טהור-מין + CD27. בנוסף, היפרמוטציות סומטיות לא נגרמו על ידי תאי CB B בנוכחות תאי T בוגרים המופעלים על ידי CD40/CD32T ו-CD3 ביד שלנו (לא מוצגים נתונים). תאי CD5 + B מדווחים כי הם עוסקים בעיקר בייצור נוגדנים בעלי זיקה נמוכה, ביטוי 35 ו- CD5 על CB ותאי CD27-PB תאים שונים. מכאן שתפקודם של תאי CB27 ומבוגרים CD27 - B עשוי להיות שונה, ותאי CB B עשויים שלא לייצג יעד אידיאלי לחקר ההיפר -מוטציה הסומטית. בהקשר זה, מעניינת התוצאה שלנו שלא היה הבדל באינדוקציה של היפרמוטציה סומטית בין תאי B מבוגרים CD27 - תמימים ותאי CB B (נתונים לא מוצגים).

במהלך זיהומים רלוונטיים מבחינה קלינית, נוגדנים נטרליים נוצרים בקרוב, ונוגדנים כאלה נטולי היפר-מוטציה סומטית בגנים שלהם באזור Ig V. פקטור של 30 באמצעות מוטציה סומטית.37 נשאלת השאלה אם לנוגדנים המיוצרים על ידי תאי B תמימים במערכת החוץ גופית שלנו יש כושר קישור גבוה. לכן ניתחנו היפרמוטציה סומטית בגנים של אזור V Ig שהתקבלו מתאי פלזמה שנוצרו מתאי B תמימים עם גירוי SAC + IL-10 + IL-2 + CD40/CD32T. ניתוח רצף הגנים של אזור Ig V חשף שתאי פלזמה שנוצרו מתאי B נאיביים במערכת שלנו היו מורכבים ברובם מתאים ללא מוטציה, דבר המצביע על כך שהם מייצרים נוגדנים בעלי זיקה נמוכה (טבלה 4). למדנו גם היפר -מוטציה סומטית של תאי פלזמה המושרה לאחר 14 ימי גירוי בתרבית. בניסוי זה, תדירות המוטציות של תאי פלזמה שנגרמו מתאי CB B משופעלים לא הייתה שונה בין תרבית של 8 ימים לתרבית של 14 ימים (לא מוצגים נתונים). כמה דיווחים הוכיחו כי היפר-מוטציה סומטית של תאי B וחלק מתאי לימפומה מסוג B ניתנים לניבול במבחנה בעזרת תאי T ועם מעורבות BCR. 38-40

מוצגת תוכנית היפותטית של CSR, היפר -מוטציה סומטית וייצור תאי פלזמה מתאי B תמימים (איור 8). תאי B נאיביים עוברים CSR והיפרמוטציה סומטית ב- GCs in vivo. עם זאת, תקנה עצמאית של מיתוג כיתתי והיפרמוטציה סומטית הוכחה במערכות שונות, על ידי שימוש בדברים כגון קו תאים של לימומה של בורקיט, 41 תאי GC B אנושיים, 42 או מערכת עכבר במבחנה. היכולת לגרום להחלפת מחלקות והיפרמוטציה סומטית באמצעות IgD + CD27 אנושי - תאי B נאיביים נקיים. במערכת CSR שלנו במבחנה, ייצור Ig והבחנת תאי פלזמה, אך היפר -מוטציה סומטית לא ניכרת הושגו על ידי IgD + CD27 - תאי B נאיביים, המעידים על התהליך השונה של החלפת מחלקות והיפרמוטציה סומטית בתאי B נאיביים. תצפית זו מבהירה כמה מנגנונים של הרגישות לזיהומים אצל תינוקות וליקויים חיסוניים ראשוניים מסוימים.

התהליך השונה של החלפת מחלקות והיפרמוטציה סומטית והצעה של תאי פלזמה בבני אדם.

לאחר שמבשרי תאי B מצליחים לייצר קולטני אנטיגן פונקציונליים במח העצם, הם משתחררים למאגר תאי B כתאי B תמימים. תאי B נאיבים ללא CD27 עוברים התרחבות אוליגוקונלית, החלפת מחלקות והיפרמוטציה סומטית ב- GCs, ו- CD27 מתבטא על פני השטח שלהם, וכתוצאה מכך התמיינותם לתאי B זיכרון. תאי פלזמה הנוצרים מתאי זיכרון B, הנושאים עומס גבוה של מוטציה סומטית, עשויים לייצר נוגדנים בעלי זיקה גבוהה (IgG, IgM, IgA, IgE). תאי פלזמה מתאי B ללא מוטציה מחוץ ל-GCs או דרך GCs לפני שנושאים היפרמוטציה סומטית עשויים לייצר נוגדנים בעלי זיקה נמוכה (IgG, IgM, IgE).

התהליך השונה של החלפת מחלקות והיפרמוטציה סומטית והצעה של תאי פלזמה בבני אדם.

לאחר שמקדמי תאי B מצליחים לייצר קולטני אנטיגן פונקציונליים במח העצם, הם משתחררים לבריכה של תאי B כתאי B נאיביים. תאי B נאיבים ללא CD27 עוברים התרחבות אוליגוקונלית, החלפת מחלקות והיפרמוטציה סומטית ב- GCs, ו- CD27 מתבטא על פני השטח שלהם, וכתוצאה מכך התמיינותם לתאי B זיכרון. תאי פלזמה הנוצרים מתאי זיכרון B, הנושאים עומס גבוה של מוטציה סומטית, עשויים לייצר נוגדנים בעלי זיקה גבוהה (IgG, IgM, IgA, IgE). תאי פלזמה מתאי B שאינם מושתקים מחוץ ל- GC או דרך GCs לפני נשיאת היפר-מוטציה סומטית עשויים לייצר נוגדנים בעלי זיקה נמוכה (IgG, IgM, IgE).

המחברים מודים לד"ר ס. נויויאמה, ט 'קובאטה, ס' איטו וג 'מורימוטו על תמיכתם.


צפו בסרטון: Արվեստի դասի եզրափակիչ ցուցահանդեսը (אוֹקְטוֹבֶּר 2022).