מֵידָע

מהם נתונים טובים על המודל המטבולי האנושי והיכן ניתן להשיג אותם?

מהם נתונים טובים על המודל המטבולי האנושי והיכן ניתן להשיג אותם?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

מנסה להשיג ייצוג SBML טוב של המודל המטבולי האנושי לשימוש בניתוחי איזון שטף והדמיית מיקוד תרופות (כלומר נוקאאאוט גנים).

מהם מקורות טובים לנתונים אלו?

תודה רבה!


עד כמה שידוע לי, אין דגם אחד המכונה רשמית "המודל המטבולי האנושי", אלא דגם Recon 2, המתואר כדגם "קונצנזוס" והמקיף ביותר עד כה ב Thiele et al. 2013, שחזור עולמי מונע הקהילה של חילוף החומרים האנושי (http://www.nature.com/nbt/journal/v31/n5/full/nbt.2488.html) זמין בכתובת http://humanmetabolism.org/?page_id=75

זמינים גם דגמים ספציפיים לרקמות. ראה למשל וואנג ואחרים: שחזור מודלים מטבוליים בקנה מידה גנום עבור 126 רקמות אנושיות באמצעות mCADRE. BMC מערכות ביולוגיה 2012, 6: 153:


א C. elegans מודל לחקר ויסות חילוף חומרים אנושי

הפרעה מטבולית ליפידית היא גורם סיכון קריטי לתסמונת מטבולית, המעוררת מחלות מתישות כמו השמנת יתר וסוכרת. השמנת יתר וסוכרת הן מוקד הסוגיות הרפואיות החשובות, המהוות איום בינלאומי גדול על בריאות הציבור. הצטברות שומן ברקמות השומן, השרירים והכבד ו/או הליקויים ביכולת לחילוף חומצות שומן, גורמת לעמידות לאינסולין. זה מעורר פתוגנזה מוקדמת של סוכרת מסוג 2 (T2D). ביונקים, חילוף החומרים של שומנים מעורב במספר איברים, כולל המוח, רקמת השומן, השרירים, הכבד והמעי. איברים אלה הם חלק ממערכת הומאוסטטית מורכבת ומתקשרים באמצעות הורמונים, נוירונים ומטבוליטים. המחקר שלנו מנתח את חשיבותם של גורמים דמויי קרופל ביונקים בכל ההומאוסטזיס האנרגטי. גורמים השולטים במטבוליזם האנרגיה נשמרים בין יונקים ו Caenorhabditis elegans מתן אסטרטגיה חדשה ורבת עוצמה לתיחום המסלולים המולקולריים המובילים להפרעה מטבולית. ה C. elegans המעי הוא מערכת המודל שלנו שבה משתמשים בגנטיקה, ביולוגיה מולקולרית וביולוגיה של תאים לזיהוי והבנת גנים הנדרשים במטבוליזם של שומן. עד כה, מצאנו תפקיד חשוב של C. elegans KLF בביוסינתזה של FA, שגשוג מיטוכונדריה, הפרשת שומנים וחמצון β. המנגנון שבו KLF שולט באירועים אלה במטבוליזם של שומנים אינו ידוע. לאחרונה הבחנו בכך C. elegans KLF-3 פועל באופן סלקטיבי על רכיבי אינסולין כדי לווסת את פעילות מסלול האינסולין. ישנם גורמים רבים השולטים בהומאוסטזיס האנרגטי ופגמים במערכת בקרה זו מעורבים בפתוגנזה של השמנה אנושית וסוכרת. בסקירה זו אנו דנים בתפקיד של KLF בוויסות מטבולי אנושי.


מאמר MINI REVIEW

  • 1 מעבדת מפתח מדינה בהנדסת ביואקטור, אוניברסיטת מזרח סין במדע וטכנולוגיה, שנחאי, סין
  • 2 שנגחאי מרכז חדשנות שיתופי לטכנולוגיית ייצור ביולוגי, שנגחאי, סין

מודלים מטבוליים בקנה מידה גנום (GEM) הפכו לכלי פופולרי לביולוגיה של מערכות, והם שימשו בתחומים רבים כגון ביוטכנולוגיה תעשייתית ורפואת מערכות. מאז יותר ויותר מחקרים נערכים באמצעות GEMs, הם זכו לאחרונה לתשומת לב רבה. בסקירה זו, אנו מציגים את הרעיון הבסיסי של GEMs ומספקים סקירה כללית של היישומים שלהם בביוטכנולוגיה, רפואת מערכות ועוד כמה תחומים. בנוסף, אנו מתארים את העיקרון הכללי של היישומים והניתוחים הבנויים על GEMs. מטרת סקירה זו היא להציג את היישום של GEMs בניתוחים ביולוגיים ולקדם את השימוש הרחב יותר על ידי ביולוגים.


תוצאות ודיון

תיאור הרשת המטבולית של הכבד האנושי

השתמשנו במודל מטבולי של הכבד האנושי המיוצג על ידי מערך תגובות מטבוליות [8], המכיל 1360 מטבוליטים ו -1826 תגובות. המודל המטבולי האנושי נוצר על בסיס אלגוריתם MBA [8], שהוא אלגוריתם לבניית מודלים המשמש להפקת מודלים מטבוליים ספציפיים לרקמות ממודל כללי [6] על ידי שילוב של מגוון מקורות נתונים מולקולריים ספציפיים לרקמות, כולל ספרות ידע מבוסס, נתונים טרנסקריפטיים, פרוטאומיים, מטבולומיים ופנוטיפיים. במודל מטבולי של הכבד האנושי, כל מטבוליט מיוצג בצורה של א[איקס], איפה א הוא שמו של מטבוליט ו איקס בסוגריים [] הוא הקיצור של תא התא שבו המטבוליט א מופיע (ראה קובץ נוסף1). מטבוליט א עשוי להופיע בתאי תאים שונים איקס,…,y, אז יש א[איקס],…,א[y] עבור אותו מטבוליט אך תאים שונים, הנספרים כמטבוליטים שונים.

בהתבסס על העיקרון שניתן לתרגם קבוצה של תגובות מטבוליות לייצוג רשת[25], ניסחנו מחדש את מודל הכבד באופן הבא: ציון כל מטבוליט באמצעות צומת המסומן ב- א[איקס], וחיבור שני צמתים על ידי א[איקס] → ב[y] אם יש תגובה כימית היכן א[איקס] הוא מצע ו ב[y] הוא מוצר. ה- HLMN הנגזר מכיל 1360 צמתים ו- 6501 קישורים (ראה קובץ נוסף 1). על מנת להמחיש את תהליך ניסוח מחדש של ה- HLMN, דוגמה עם שלוש תגובות מטבוליות ניתנת באיור 1.

דוגמה להראות כיצד ה- HLMN מעוצב מחדש ממודל הכבד. א) שלוש תגובות מטבוליות במודל הכבד מוצגות בצד שמאל, כאשר hgentis, o2, 4mlacac, h, hco3 ו-h2co3 הם מטבוליטים, [c] ו-[m] הם הקיצורים של תאי התא "ציטופלזמה" ו"מיטוכונדריון" המציינים היכן המטבוליטים המתאימים מופיעים. התגובה המטבולית הראשונה מייצגת כי הומוגנטיזאט בציטופלזמה (hgentis [c]) מתחמצן ל- 4-Maleylacetoacetate (4mlacac [c]) ויוני מימן (h [c]) המשמעות השנייה היא יון המימן בציטופלזמה (h [c] ) מועבר למיטוכונדריון (h [m]) השלישי מייצג שיון המימן במיטוכונדריון (h [m]) מגיב עם ביקרבונט (hco3 [m]) ליצירת חומצה פחמנית (h2co3 [m]). הרשת שפורמטה מחדש משלוש התגובות המטבוליות הללו מוצגת בצד ימין, כאשר כל צומת מציין מטבוליט עם המידע של תא התא שבו הוא מופיע, לשני צמתים יש קישור אם יש תגובה כימית כך שמטבוליט אחד הוא מצע ואחר אחד הוא מוצר. ב) הקיצורים של תא התא ושמותיהם המתאימים.

מטעמי נוחות וללא עמימות, לא נבחין בין צמתים למטבוליטים להלן כאשר מתייחסים למאפיינים של HLMN. לדוגמה, כאשר אנו אומרים צומת נהג ב- HLMN, אנו עשויים להתכוון למטבוליט נהג ב- HLMN.

סיווג וניתוח של מטבוליטים של נהגים

מטבוליטים של נהגים ב-HLMN הם מטבוליטים שבהם מוזרקים תשומות. אם מטבוליטי הדרייבר במטבוליטים מינימליים של מנהל התקן (MDMS, בקיצור) נשלטים כולם על ידי כניסות שונות, ניתן לנווט את ה-HLMN מכל מצב נתון למצב רצוי בזמן סופי. "מינימום" פירושו שאם האותות מוזנים רק על קבוצת משנה מתאימה של ס, אז לא ניתן להנחות את ה-HLMN לכמה מצבים סופיים רצויים בזמן סופי. MDMS נקבעים על ידי גילוי התאמות מרביות ב- HLMN (ראה שיטות).

התאמה מקסימלית היא קבוצה מקסימלית של קישורים שאינם חולקים צמתי התחלה או סיום[16]. ישנם התאמות מקסימליות שונות ברשת [26], מה שעלול לגרום ל- MDMS שונים ב- HLMN. ספירת מספר כל ההתאמות המקסימליות ברשת שרירותית הוכחה כשייכת למחלקת הבעיות ♯P-complete (חד P-complete) של בעיות[27]. אין כיום אלגוריתם ידוע בזמן פולינומי לפתרון בעיה מלאה ב- ♯P. מספר ההתאמות המקסימלי יכול לגדול באופן אקספוננציאלי עם גודל הרשתות, ומכאן שרשת עם רק מאות צמתים מובילה לרוב למיליוני התאמות מקסימליות. ספירת ההתאמות המרביות היא אסורה מבחינה חישובית עבור רשתות גדולות [28]. לפיכך, קשה להשיג את ספירת ההתאמות המקסימליות ב-HLMN (המכיל 1360 צמתים).

סיווג מטבוליטים של נהגים

זיהינו באקראי 5,000 התאמות מקסימליות שונות (ראה קובץ נוסף2) וה-MDMS התואמים להם (ראה שיטות). ב-HLMN, צומת עשוי להופיע ב-MDMSs שונים. לכל צומת v, ספרנו את מספר ה-MDMS של הצומת v מופיע ב ולאחר מכן מנרמל את המספר (כלומר, המספר מחולק ב- 5000). הערכים המנורמלים מאפיינים את התדר ו ד של כל צומת המופיע ב-5000 MDMSs. על פי התדירות של כל צומת, סיווגנו את המטבוליטים לשלוש קבוצות: מטבוליטים של נהג קריטי עם ו ד = 1, מטבוליטים של נהג בתדירות גבוהה עם 0.6 ≤ ו ד < 1, מטבוליטים של נהג בתדירות נמוכה עם 0 ≤ ו ד < 0.6.

צומת עם ו ד = 1 פירושו שהצומת מופיע בכל ה- MDMS. צמתים כאלה עשויים להיות בעלי מאפיינים או פונקציות ספציפיים שיכולים לספק מידע רב ערך על ה- HLMN. אז סיווגנו את הצמתים עם ו ד = 1 צמתים נהגים קריטיים. הסיבה שבחרנו בסף 0.6 להפריד בין מטבוליטים של נהגים בתדירות גבוהה לבין מטבוליטים של נהגים בתדירות נמוכה, היא שברצוננו לעשות את ההבדל בין תפקידי המטבוליטים בשתי הקבוצות האלה גדול ככל האפשר (לניתוח מפורט, ראו תת הסעיף "התפקידים של מטבוליטים של נהגים בתדירות גבוהה").

על מנת לבדוק אם הסיווג של מטבוליטים המבוסס על 5000 MDMSs הוא אמין, חישבנו את התדרים של מטבוליטים ב-51 משפחות שונות של MDMSs בגדלים של 5000,5100,5200,...,10000. התדירות של כל מטבוליט המחושב על בסיס משפחות שונות של MDMS נשארת באותו אזור, בו נמצאים האזורים ו ד = 1, 0.6 ≤ ו ד & lt 1 ו- 0 ≤ ו ד < 0.6 (ראה קובץ נוסף3). במילים אחרות, הסיווגים של כל מטבוליט זהים בהתבסס על משפחות שונות אלה. מכאן שסיווג המטבוליטים על בסיס 5000 MDMS הינו אמין. יתר על כן, השתמשנו בשיטת דגימה אקראית ללא משוא פנים [28] כדי לאמת את התוצאות על בסיס 5000 MDMS (לניתוח מפורט, ראה סעיף קטן "אימות לסיווג ומאפייני מטבוליטים של נהגים").

ניתוח טופולוגי של מטבוליטים של נהגים ב-HLMN

חישבנו מרכזיות שונה של כל מטבוליט אני בהלמ"ן, הכוללים תואר חוץ OutD, בתואר InD, תואר ד, בין השניים לִפנֵי הַסְפִירָה, קרבה CC, בקרבה CCI והקרבה החוצה CCO (להגדרות, ראה שיטות). התדירות ו ד נמצא כי הוא יורד במהירות עם התואר (ראה קובץ נוסף 4) בעוד שדפוס זה אינו תקף עבור ריכוזים אחרים, וזה תואם את התוצאה ב- [28]. עבור כל מרכזיות, כל המטבוליטים ב- HLMN מחולקים לשלוש קבוצות בגדלים דומים, בהתבסס על ציוני המרכזיות שלהם (נמוכים, בינוניים וגבוהים). באופן זה התקבלו שבע משפחות של קבוצות: FD = , F OutD = < OutD l , OutD m , OutD h >, F InD = < InD l , InD m , InD h >, F BC = < BC l , BC m , BC h >, F CC = < CC l , CC m , CC h >, F CCI = < CCI l , CCI m , CCI h >, F CCO = < CCO l , CCO m , CCO h >, כאשר כל משפחה מכילה שלוש קבוצות, והכתובות המשנה ל,M,ח מייצגים בהתאמה נמוכה, בינונית וגבוהה.

השתמשנו בסט א לציון איחוד המטבוליטים מ- 5000 MDMSs, ונקבע ב לציון מערך האיחוד של מטבוליטים קריטיים ובתדירות גבוהה של נהגים. עבור כל אחת מהמשפחות F D, F OutD, F InD, F BC, F CC, F CCI, F CCO, שברי המטבוליטים מהסט א השייכים לשלושת הסטים במשפחה חושבו (ראה איור 2 (א)), ושברי המטבוליטים ממערכה ב השייכים לשלושת הסטים במשפחה חושבו גם כן (ראה איור 2 (ב)). לדוגמה, עבור המשפחה F D, חישבנו |אד ל|/|א|, |אד M|/|א|, |אד ח|/|א|, ו- |בד ל|/|ב|, |בד M|/|ב|, |בד ח|/|ב|, איפה | ∗ | מציין את גודל הסט ∗ .

ניתוח טופולוגי של מטבוליטים הנהג. א) המטבוליטים בקבוצה A (איחוד המטבוליטים מ -5000 MDMS) ב) המטבוליטים בקבוצה B (קבוצת המטבוליטים הנהג הקריטיים ותדירות גבוהה). עבור התוויות בציר האופקי, "D", "InD", "OutD", "BC", "CC", "CCI", "CCO" מייצגות בהתאמה את התואר, התואר, החוץ, הבדלנות, הקרבה , בקרבה, בחוץ-קרבה. הגובה של פסים כחולים, ירוקים וחום בהתאמה מייצגים את השברים של מטבוליטים של הנהג עם ציוני מרכזיות גבוהים, בינוניים ונמוכים. ההבדל בין השברים לכל מרכזיות ב- B) גדול מזה ב- A). פרט לסמיכות החוצה ב- B), הסורגים החומים כולם נמוכים יותר מהכחולים והירוקים לאותה מרכזיות, מה שמעיד על כך שמטבוליטי הנהג נוטים להימנע מצמתים בעלי הרמה הגבוהה (resp., Out-grade, in -מעלות, בין סמיכות, קרבה וקרבה), בעוד שמטבוליטי הנהג הקריטיים והתדירים גבוהים נוטים להיות קרובים החוצה.

בהשוואת התוצאות המוצגות באיור 2 (א) ובאיור 2 (ב), אנו מוצאים כי לכל מרכזיות, ההבדל בין השברים המחושבים בערכה ב גדול מזה בסט אהמשמעות היא שההבדלים המאפיינים הטופולוגיים גדולים יותר במכלול מטבוליטי הנהג הקריטיים והתדירים. בדרגה ובקרבה מודדים את הרגישות של מטבוליט להיות מושפע ממטבוליטים אחרים. דרגות גבוהות יותר וקרבה גבוהה יותר מרמזות שהמטבוליט יכול להיות מושפע ביתר קלות מאחרים. סגירת חוץ מודדת את יכולתו של מטבוליט להשפיע על מטבוליטים אחרים. קירבה גבוהה יותר מרמזת שהמטבוליט יכול להשפיע על אחרים ביתר קלות. המטבוליטים בסט ב נוטים להיות בעלי תואר נמוך, קרבה נמוכה וקרבה החוצה גבוהה. לכן, מטבוליטי הנהג, במיוחד מטבוליטים קריטיים ובתדירות גבוהה של הנהג, נוטים להיות בעלי יכולת חזקה להשפיע על המצבים של מטבוליטים אחרים ורגישות חלשה להיות מושפעים ממצבים של מטבוליטים אחרים. יתר על כן, הזרקת תשומות שליטה (תרופות, אותות מהסביבה או בתוך האורגניזם וכו ') למטבוליטים של נהגים קריטיים ותדירים גבוהה יכולה להסדיר את כל מצב ה- HLMN, מה שמעיד על כך שחילוף החומרים של הנהג הקריטי והתדר גבוה עשוי להיות פוטנציאלי. מטרות סמים.

לכל מרכזיות, השתמשנו בבדיקת צ'י-ריבוע (ראה שיטות) כדי לקבוע אם התפלגות השברים במערך A ובמערכת B שונה מזו בכל הרשת (הסיבה שבחרנו בבדיקת צ'י-ריבוע ניתנת בשיטות) . ערכי הסטטיסטיקה הצ'י-מרובעים לכל מרכזיות בערכה A ובערכה B מוצגים בטבלה 1. בעוד ערך הטבלה לנתון הצ'י-מרובע הוא 5.99, בהתבסס על החופש 2 ורמת המשמעות היא 0.05. חוץ מ ה CCO, ערכי צ'י ריבוע אחרים גדולים מערך הטבלה בקבוצה A, והערכים הסטטיסטיים של צ'י ריבוע עבור כל המרכזים גדולים יותר מערך הטבלה בקבוצה B. זה אומר שפרט ל- CCO בקבוצה A, עבור מרכזיות אחרות בקבוצה A וכל המרכזיות בקבוצה B, התפלגויות השברים שונות מזו שברשת כולה. לפיכך, התוצאה של התכונות הטופולוגיות של מטבוליטים של נהגים היא בעלת מובהקות סטטיסטית.

מאפיינים של מטבוליטים הנהג הקריטיים

ב-HLMN, זיהינו 36 מטבוליטים של נהג קריטי (ראה טבלה 2). התארים שלהם כולם אפס, וזה תואם את התוצאה ב- [29] ומשמעותו ש -36 מטבוליטים הנהגיים הקריטיים הם כל מטבוליטי ההתחלה של נתיבים (נתיבים ב- HLMN הם תגובות עוקבות בין מטבוליטים). לפי משפט השליטה המבנית של לין [18, 30], אם מערכת ניתנת לשליטה, אין צמתים בלתי נגישים (כלומר, צמתים שלא ניתן לגשת אליהם או "להשפיע" על התשומות החיצוניות). מכיוון שלא ניתן להשפיע על מטבוליטים התחלתיים אלה מהקלט החיצוני דרך מטבוליטים אחרים, יש לשלוט עליהם ישירות על ידי תשומות חיצוניות.

36 מטבוליטי הנהג הקריטיים נמצאים כולם חוץ-תאיים (כל אחד מ-36 מטבוליטי הנהג הקריטיים קשור לקיצור של מידע תאים "[e]", שפירושו חוץ-תאי). על ידי בדיקת הפעילויות הביוכימיה של 36 המטבוליטים החוץ-תאיים הקריטיים, אנו מוצאים שכולם משתתפים בתגובות התחבורה מהתא החוץ-תאי לתא, מה שמרמז שהצריכה של מטבוליטים חוץ-תאיים אלו ממלאת תפקידים חשובים בפעילות הביולוגית של תאי הכבד. לדוגמה, הגדלה נכונה של צריכת המטבוליט הקריטי של נהג גמא-טוקופרול יכולה לסייע בהורדת רמת הכולסטרול, והגברת צריכת המטבוליט הקריטי של אלפא-טוקופרול יכולה להפחית את חמצון השומנים ואת הפעלת תאי הכוכב בכבד, מה שיכול להגן על תאי הכבד ועל למנוע פיברוזיס בכבד [51].

בדקנו את המהות הביולוגית של 36 מטבוליטים הנהגיים הקריטיים. המהותיות של מטבוליט מודדת עד כמה חשוב המטבוליט בכל המערכות המטבוליות או בתהליכים מטבוליים מסוימים. למרות מטבוליט יכול להתקיים בתאים שונים, המטבוליט מוכר כחיוני כל עוד הוא נמצא חיוני בכל אחד מהתאים [33]. בהתבסס על החיוניות השונה של המטבוליטים, המטבוליטים סווגו לשלוש קבוצות:

מטבוליטים אוניברסליים (UM): כמה מטבוליטים אנאורגניים או קופקטורים, כגון CMP ו- ATP, שנמצאו קיימים באופן אוניברסאלי ביותר מ -90% אורגניזמים. המטבוליטים האוניברסליים מטופלים בדרך כלל כאל מטבוליטים חיוניים מכיוון שרוב החומר החי אינו יכול לשרוד בלעדיהם [33, 52].

מטבוליטים חיוניים פונקציונאליים (FEM): המטבוליטים שאינם UM ובעלי תפקידים חיוניים בכמה פונקציות ביולוגיות. לדוגמה, חומצה פולית חיונית לתפקודים גופניים רבים, ונדרשת על ידי גוף האדם לסנתז, לתקן ולמתיל DNA וכן לפעול כקו-פקטור בתגובות ביולוגיות מסוימות[31] Hyaluronan חיוני לעוברות[37] גוף האדם דורש חומצה פנטותנית לסינתזת קואנזים-A (CoA), כמו גם לסינתזה וחילוף של חלבונים, פחמימות ושומנים [44].

מהות המטבוליטים (ESM): המטבוליטים שחשיבותם לא התגלתה. מטבוליטים אלה עשויים להיות המטבוליטים החיוניים הפוטנציאליים, הדורשים אימות ניסיוני נוסף.

בין 36 מטבוליטים הקריטיים לנהג, אנו מוצאים כי 10 מטבוליטים הם מטבוליטים UM 17 הם מטבוליטים FEM 9 הם EUM. לכן, בין 36 מטבוליטים הנהגיים הקריטיים לנהג, 27 מטבוליטים חיוניים, דבר המצביע על כך שמטבוליטים הנהג הקריטיים ממלאים תפקידים חשובים בחילוף החומרים של הכבד האנושי.

תפקידי מטבוליטי הנהג בתדירות גבוהה

השתמשנו באלגוריתם חישול מדומה (SA) [53] כדי לזהות מודולים ב-HLMN. הסיבה שבחרנו באלגוריתם SA היא שזוהי טכניקה נפוצה לזיהוי מודולים, ואמות מידה לאימות האפקטיביות של האלגוריתמים לזיהוי מודולים שפותחו לאחרונה [54, 55]. בהשוואה לאלגוריתמים אחרים לזיהוי מודולים, כמו שיטת clustering markov, אלגוריתם ה-SA מתפקד טוב יותר בזיהוי מודולים ברשתות מטבוליות בקנה מידה גדול והמודולים המזוהים בעלי משמעות ביולוגית יותר[56], מאחר שאלגוריתם ה-SA פחות רגיש לרעשים כגון כשגיאה נסיונית או נתונים לא מלאים.

על פי שני הפרמטרים בתוך התואר ומקדם החלוקה של כל צומת ב-HLMN המודולרי, הצמתים חולקו לשבע מחלקות: R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 (לפרטים, ראה שיטות).

מכיוון שאלגוריתם ה- SA הוא סטוכסטי, ניתן היה להשיג תוצאות שונות של מודולריזציה בריצות שונות. הרצנו את אלגוריתם ה-SA כבר 100 פעמים. בהתבסס על התוצאה של כל ריצה, הצמתים של HLMN סווגו לשבע המחלקות R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7. בין 100 תוצאות הסיווג נספרת ההסתברות שכל צומת מסווג לכל מחלקה. כפי שמוצג באיור 3, רוב הצמתים מסווגים תמיד לאותה מחלקה, דבר המצביע על כך שסיווג התפקידים של הצמתים ב- HLMN המבוסס על אלגוריתם ה- SA הוא אמין.

ההסתברות של כל מטבוליט עבור כל תפקיד בין 100 מחיצות. הצבע הוא בעיקר אדום כהה (ההסתברות המתאימה שווה ל-1) או כחול כהה (ההסתברות המתאימה שווה ל-0). המשמעות היא שרוב המטבוליטים ב- HLMN מסווגים תמיד לאותה מחלקת תפקידים בין 100 מחיצות, מה שמעיד על סיווג התפקידים של מטבוליטים מהימן.

נמצא כי הרכזות שאינן רכזות המחברות מודולים שונים אחראיות לשטפים בין מודולים המשפיעים על מצב הרשתות המטבוליות [57], בעוד שהצמתים בתדירות גבוהה ו ד בעלי יכולת חזקה להשפיע על מצבי מטבוליטים אחרים, מה שגורם לנו לחשוב האם הצמתים בתדירות גבוהה ו ד נוטים להיות לא-רכזות המחברים מודולים שונים. ב-HLMN, יותר מ-92% צמתים הם בתפקידים R1 ו-R2, שהם שניהם לא רכזות ולצמתים R1 אין קשר עם מודולים אחרים בעוד שלצמתי R2 יש קשרים עם מודולים שונים. כפי שמוצג באיור 4 (א), עם סף התדרים ו dt הגדלת, החלק של צמתים R1 בין קבוצת הצמתים עם ו dtו ד & lt 1 פוחת בעוד החלק של צמתים R2 עולה. השברים של צמתים בעלי תפקידים שונים משתנים כאשר ו dt ≥ 0.7 בשל הגודל הקטן של קבוצת הצמתים עם ו dtו ד < 1. מתי ו dt < 0.7, ההבדל בין השברים של צמתים R1 וצמתי R2 הוא הגדול ביותר בסביבות ו dt = 0.6. לכן בחרנו את הסף ו dt = 0.6 להבדיל בין מטבוליטי הנהג בתדירות גבוהה לבין מטבוליטים של נהג בתדירות נמוכה. העובדה שתפקידי מטבוליטים של נהגים בתדירות גבוהה נוטים להיות R2, מעידה על כך שמטבוליטי הנהג בתדירות גבוהה נוטים להיות רכזות שאינן מחברות מודולים שונים. ניתן למפות מודולים שונים למסלולים שונים [56], כלומר מטבוליטי הנהג בתדירות גבוהה נוטים להשתתף במסלולים מטבוליים שונים. לדוגמה, מטבוליט הנהג בתדירות גבוהה מחזורית אדנוזין מונופוספט ממלא תפקידים רגולטוריים במסלולי חילוף החומרים של גלוקוז, חלבון ושומן בו זמנית[58]. זה מצביע על כך שמטבוליטי הנהג בתדירות גבוהה ממלאים תפקידים חשובים ברשת חילוף החומרים של הכבד האנושי.

חלקי המטבוליטים בעלי תפקידים שונים בהתבסס על סף תדירות שונה. א) ו ב) הצג בהתאמה את התוצאות המבוססות על המודולים שזוהו על ידי אלגוריתם החישול המדומה והאלגוריתם החמדני המהיר. כל נקודה המחוברת בקווים מנוקדים היא חלק המטבוליטים עם תפקיד ספציפי בין קבוצת המטבוליטים של הנהג שתדירותם ו dtו ד & lt 1, בעוד שכל קו מוצק פירושו החלק של המטבוליטים עם כל תפקיד בקרב ה- HLMN. ב- HLMN, רוב המטבוליטים הם בעלי תפקידים R1 ו- R2. עם סף התדר ו dt הגדלת, החלק של מטבוליטים R1 מבין קבוצת המטבוליטים עם ו dtו ד < 1 יורד בעוד חלקם של מטבוליטים R2 עולה. שברי המטבוליטים בעלי תפקידים שונים משתנים כאשר ו dt ≥ 0.7 בשל הגודל הקטן של קבוצת המטבוליטים עם ו dtו ד & lt 1. מתי ו dt < 0.7, ההבדל בין השברים של מטבוליטים R1 ומטבוליטים R2 הוא הגדול ביותר בערך ו dt = 0.6. לפיכך, אנו בוחרים את הסף ו dt = 0.6 להבדיל בין מטבוליטי הנהג בתדירות גבוהה לבין מטבוליטים של נהג בתדירות נמוכה, ומטבוליטים של נהג בתדירות גבוהה נוטים להיות בעלי תפקיד R2.

כדי לאמת שהתוצאה של מטבוליטי הנהג בתדירות גבוהה אינה תלויה באלגוריתם שיטת זיהוי המודולים SA, השתמשנו בשיטה נוספת לאיתור מודול תאוות בצע [59] כדי לזהות מודולים ב- HLMN ולסווג את הצמתים לשבע כיתות: R1 , R2, R3, R4, R5, R6, R7. עם סף התדרים ו dt הגדלת, השברים של צמתים R1 וצמתי R2 בין קבוצת הצמתים עם ו dtו ד & lt 1 מציגים את הדפוס הדומה לזה שהתבסס על אלגוריתם ה- SA, שמוצג באיור 4 (ב). הגענו לאותה מסקנה כי מטבוליטי הנהג בתדירות גבוהה נוטים להיות הרכזת שאינה מחברת מודולים שונים.

אימות לסיווג ולמאפיינים של מטבוליטים של נהגים

תוצאות המאפיינים על מטבוליטים של הנהג, מטבוליטים קריטיים של נהגים ומטבוליטים של נהגים בתדירות גבוהה מבוססות כולם על 5000 MDMSs. כדי לאמת שהתוצאות הללו אינן תלויות ב- 5000 MDMS, יישמנו שיטת דגימה ללא משוא פנים המוצעת על ידי Jia et al. [28] כדי לחשב את התדר ו ד שכל צומת פועל כצומת מנהל התקן (ראה קובץ נוסף5).

בהשוואה לתוצאות המבוססות על 5000 MDMS, קבוצת הצמתים הנהגים הקריטיים שנקבעו בשיטה זו זהה, בעוד שמערכת הצמתים של הנהג בתדירות גבוהה שנקבעו בשיטה זו אינה זהה לחלוטין, מה שעלול להיגרם על ידי אקראיות של הדגימה. עם זאת, התוצאה הבאה מתקיימת עבור שתי השיטות: צמתי הדרייבר בתדר גבוה נוטים להיות רכזות שאינן מחברות מודולים שונים. (ראה קובץ נוסף 4). יתר על כן, הניתוח הטופולוגי הוחל על קבוצת A (קבוצת המטבוליטים עם ו ד > 0) וקבוצה B (קבוצת המטבוליטים עם 1 ≤ ו ד > 0.6) זוהה על ידי השיטה ב[28]. המסקנה עדיין גורסת כי מטבוליטי הנהג, במיוחד מטבוליטי הנהג הקריטיים והתדירים, נוטים להיות בעלי יכולת חזקה להשפיע על מצבי מטבוליטים אחרים ורגישות חלשה להיות מושפעת ממצבי מטבוליטים אחרים (ראה קובץ נוסף 4).

לסיכום, למרות שסיווג וניתוח מטבוליטים של נהגים מבוססים על 5000 MDMS, התוצאות על המאפיינים של מטבוליטים שונים של נהגים אינם מסתמכים על 5000 MDMS.

סיווג חלופי של צמתים לנהג ומצב הבקרה של ה- HLMN

מאמר שפורסם לאחרונה[29] נתן סיווג חלופי של צמתים על סמך השתתפותם בשליטה. צומת הוא קריטי, תמציתי או מיותר אם הוא פועל כצומת נהג בסך הכל, חלק או אף אחת מהערכות המינימליות של צמתי הנהג. על ידי מדידת השבר נ r של הצמתים המיותרים לרשת עם תואר ממוצע משתנה, התגלו ב- [29] שני מצבי בקרה מובחנים. מבוסס על ערך ההפרש של השבר נ r ומס 'T לרשת השידור שלה (שתרשים החיווט שלה זהה לרשת המקורית אך הכיוון של כל קישור הפוך), ניתן לזהות את מצב הבקרה של רשת: אם Δ nr = nr - nr T & gt 0 הרשת היא מרוכז ואם Δנ r < 0 הוא מופץ.

יישמנו את הכלים ב[29] ב-HLMN, וגילינו שמצב הבקרה של ה-HLMN מופץ. בעוד שב [29] לא ניתן לזהות את מצבי הבקרה של שלוש הרשתות המטבוליות המעורבות, הנגרמות בשל חוסר השלמות של הרשתות המטבוליות, שהמעלות הממוצעות שלהן נמצאות באזור 'טרום פיצול' (שבו לא קיימים מצבי בקרה מובחנים) . כאשר מידע נוסף על רשתות מטבוליות אלה נחשף, התארים הממוצעים עולים ומביאים למצבי בקרה ניתנים לזיהוי. לדוגמה, הרשת המטבולית של E. coli [11] שנחקרה ב- [29] הורכבה בשנת 2000, אולם לא ניתן לזהות את מצב השליטה בה, כאשר החלנו את הכלים לרשת המטבולית של E. coli iJO1366 [60], שהייתה להרכיב בשנת 2011, אנו יכולים לגלות כי מצב הבקרה של רשת iJO1366 הוא ריכוזי. לא קל להבין את הסיבה שבגללה מופץ מצב הבקרה של רשת חילוף החומרים של הכבד האנושי והרשת המטבולית E. coli iJO1366 מרוכזת, עקב חוסר השלמות של שתי הרשתות הללו, שמצב השליטה שלהן עשוי להשתנות עם הגידול של סולם הרשת.

תפקיד התגובות בחוסן של השליטה ב- HLMN

כשלים בתגובה עלולים לקרות במערכות מטבוליות, ולכשלים בתגובה שונים יש השפעות שונות על החוסן של התפקוד המטבולי. החוסן מאפיין את יכולתן של מערכות מטבוליות להתנהג בדרך כלל בכשלים בתגובה. כמה כשלים בתגובה ישברו את ההומאוסטזיס התאי, וכתוצאה מכך השפעה אנטי-פרוליפרטיבית[61] או אפופטוזיס[62], בעוד שלחלקם כמעט אין השפעה על התפקודים התאיים[63]. בהמשך, אנו מתמקדים בהשפעות של כשלים בתגובה שונים על החוסן (בין אם ניתן לשלוט ברשת עם אותם MDMS תחת כשלים בתגובה) של יכולת השליטה ב- HLMN.

בהתבסס על השפעות שונות על החוסן של יכולת השליטה הנגרמת כתוצאה מהיעדר קישורים, הקישורים סווגו לשלוש קטגוריות[16]: "קריטי" אם היעדרם גורם להגדלת המספר המינימלי של צמתי נהג כדי לשמור על שליטה מלאה "מיותרת" אם ניתן להסיר אותו מבלי להשפיע על הסט הנוכחי של צמתים של מנהלי התקנים "רגילים" אם הוא לא קריטי ולא מיותר. מהחלקים של קישורים קריטיים, רגילים ומיותרים ב-HLMN, המוצגים באיור 5, אנו יכולים לגלות שרק מעט קישורים הם קריטיים ורוב הקישורים הם רגילים, שהיעדרם עשוי לשנות את קבוצת צמתי הנהג הנוכחית, אך הרשת עדיין יכולה להיות נשלט עם אותו מספר צמתים של נהגים. בחילוף החומרים של הכבד האנושי, יש רק תגובות מעטות המיוצגות על ידי קישורים קריטיים, המספקות מדוע מטבוליזם של הכבד האנושי יכול לתפקד היטב בנסיבות שונות.

שברי הקישורים מסוגים שונים. חלקי הקישורים הקריטיים, הרגילים והמיותרים בין כל מערך הקישורים ב-HLMN מוצגים ב- א). קישורים מעטים הם קריטיים ורוב הקישורים הם רגילים, מה שמרמז על כך שיש רק תגובות מעטות שכישלונן עלול לגרום לעלייה במספר הצמתים הנהגים המינימליים. השברים של קישורי התגובה הגבוהים (CH), הליבה המתונה (CM) והלא ליבה (NC) בין קבוצת הקישורים הקריטיים, הרגילים והמיותרים, או קבוצת כל הקישורים (אנסמבל) מוצגים ב- ב). חלקם של קישורי התגובה הגבוהים הליבה הוא הקטן ביותר והחלק של קישורי התגובה שאינם ליבה הוא הגדול ביותר במכלול הקישורים הקריטיים, מה שאומר שהתגובות המיוצגות על ידי קישורים קריטיים נוטות להיות התגובות שאינן ליבות אצל האדם רשת מטבולית של הכבד.

במודל חילוף החומרים של הכבד האנושי [8], התגובות סווגו לשלוש סוגים: תגובות ליבה גבוהות לתגובות אלה כלולות במסלולים ספציפיים לרקמות האנושיות, שהן חיוניות לגרעיני חילוף החומרים של הכבד האנושי תגובות מתונות לתגובות אלה העידו. לפי נתוני מולקולות תגובות שאינן ליבות עבור האחר, שרובן אינן קשורות לגנים במודל ו -50% הן תגובות תחבורה. חישבנו את חלקי הקישורים המייצגים את תגובות הליבה הגבוהות, הליבה המתונות ולא-הליבה בין קבוצת הקישורים הקריטיים, הרגילים והמיותרים וקבוצת כל הקישורים ב-HLMN, המוצגים באיור 5. בהשוואה לשברים בין קבוצות הקישורים הרגילים, המיותרים וקבוצת הקישורים המלאה ב-HLMN, חלק הקישורים המייצגים תגובות ליבה גבוהות הם הנמוכים ביותר וחלק הקישורים שאינם הליבה הם הגבוהים ביותר בקבוצת התגובות הקריטיות. קישורים, מה שמצביע על כך שהתגובות המיוצגות על ידי קישורים קריטיים נוטות להיות התגובות שאינן הליבה.

תגובות תחבורה מעבירות מטבוליטים על פני תאים, רבים מהם מעבירים מטבוליטים מהסביבה לתא. חלקם של קישורי תגובת התחבורה בין קבוצת הקישורים הקריטיים הוא 47.5%, בעוד שבכלל מערך הקישורים ב-HLMN הוא 20.8%. Moreover, we computed the fraction of links representing transport reactions which transfer metabolites from the environment into the cell among the set of critical links and that among the whole link set in the HLMN, which are 33.6% and 12.2%, respectively. These comparisons indicate that transport reactions and the environment are important in influencing the robustness of controllability of the HLMN. The metabolites carried in by transport reactions could activate a series metabolic reactions in human liver cells, which could change the state of the liver metabolism and influence the controllability of the HLMN.

Validation for the result that the reactions represented by critical links tend to be the non-core reactions

We used chi-square test (see Methods) to test whether or not the differences between the fractions of the core high, core moderate and non-core reaction links among the whole network and those among the set of critical links are out of chance. The observed data are the number of core high, core moderate and non-core reaction links among each of the sets of the critical links, which are 132, 59 and 226 respectively. The expected percentages are the fractions of core-high, core moderate and non-core reaction links among the whole network, which are 60.14% and 14.55% and 25.3% respectively. The chi-square statistic value was computed based on the chi-square formula (see Methods), which is 193.9. With the freedom degree being 2 and the significance level being 0.05, the table value for chi-square statistic is 5.99. The chi-square statistic value is bigger than the table value, so there is a significant difference between the fractions among the set of critical links and those among the whole network, which means that the reactions represented by critical links tend to be the non-core reactions.


תַקצִיר

One element of classical systems analysis treats a system as a black or grey box, the inner structure and behaviour of which can be analysed and modelled by varying an internal or external condition, probing it from outside and studying the effect of the variation on the external observables. The result is an understanding of the inner make-up and workings of the system. The equivalent of this in biology is to observe what a cell or system excretes under controlled conditions — the 'metabolic footprint' or exometabolome — as this is readily and accurately measurable. Here, we review the principles, experimental approaches and scientific outcomes that have been obtained with this useful and convenient strategy.


Models of obesity with hyperlipidemia

Obese mouse models such as A y /a, Lep ob/ob and LepR db/db have increased total plasma cholesterol levels however, this is the result of increased HDL rather than increased VLDL and LDL levels (Nishina et al., 1994a Silver et al., 1999 Silver et al., 2000 Gruen et al., 2005 Gruen et al., 2006 Coenen and Hasty, 2007). The increase in HDL probably accounts for the resistance of these obese mice to atherosclerotic lesion formation (Nishina et al., 1994b). By contrast, human MetS is associated with obesity, increased levels of TG-rich VLDL and reduced levels of HDL. To generate obese mouse models with hyperlipidemia, our laboratory and others have crossed the Lep ob/ob , LepR db/db and A y /a mice onto LDLR −/− and apoE −/− backgrounds. The models described below are all on the C57BL/6J strain.

Lep ob/ob LDLR −/− and LepR db/db LDLR −/− mice

To develop a model that better reflects MetS-related hyperlipidemia, we crossed Lep ob/ob mice onto an LDLR −/− background (Lep ob/ob LDLR −/− ) (Hasty et al., 2001). These mice are obese and develop dramatic hypercholesterolemia characterized by elevated VLDL and LDL (Fig. 1D please note that the figure represents a LepR db/db LDLR −/− mouse, however, the Lep ob/ob LDLR −/− mice have a similar profile), as well as hypertriglyceridemia. Furthermore, these mice spontaneously develop atherosclerotic lesions, and are thus very useful for studying the role of obesity in cardiovascular disease. Our group and others have used this model to study therapeutic treatments for MetS, as well as to study mechanisms of obesity-related hyperlipidemia (Mertens et al., 2003 Verreth et al., 2004 Hasty et al., 2006 Verreth et al., 2006 Coenen et al., 2007a). LepR db/db LDLR −/− mice have a phenotype identical to that of the Lep ob/ob LDLR −/− mice with the exception that they have very high circulating leptin levels (Gruen et al., 2006). We have also crossed the Lep ob/ob and LepR db/db mice onto an apoE −/− background, and these mice are also obese, insulin resistant and hyperlipidemic (Gruen et al., 2006 Atkinson et al., 2008). The Lep ob/ob apoE −/− and LepR db/db apoE −/− mice have extreme elevations in VLDL and almost no HDL (Fig. 1D). Although these mice provide a better model for MetS than do Lep ob/ob and LepR db/db mice, because of their hyperlipidemia and susceptibility to atherosclerosis, the hyperlipidemia is quite extreme and the caveat remains that they are completely deficient in leptin signaling.

LDLR 3KO and apoE 3KO mice

Recently, Lloyd et al. crossed Lep ob/ob LDLR −/− and Lep ob/ob apoE −/− mice onto an apoB100 only background (named LDLR 3KO and apoE 3KO, respectively) (Lloyd et al., 2008). These mice are obese (>40 grams), hyperinsulinemic (>30 ng/ml), hyperlipidemic (total cholesterol >750 mg/dl and TGs >250 mg/dl) and hypertensive (systolic pressure >150 mmHg), as measured by the tail cuff method. Interestingly, the apoE 3KO mice are diabetic by 9–10 weeks of age, whereas the LDLR 3KO mice are not. This may be because of their apoE versus LDLR genotype, or the fact that the apoE 3KO mice were only 74.6% C57BL/6J, whereas the LDLR 3KO mice were 94.7% C57BL/6J in the original report. One unique aspect to these mice is that they only express apoB100 (and not apoB48) from their livers. In humans, apoB48 is expressed solely from the intestines and apoB100 is expressed solely from the liver, whereas, in rodents, both forms of apoB are expressed in the liver. Thus, expression of only apoB100 from the livers of these mice provides a lipoprotein metabolism setting which is similar to that seen in humans.

A y /aLDLR −/− and A y /aapoE −/− mice

To develop a model of MetS with delayed onset obesity and hyperlipidemia, we crossed the A y /a mice onto an LDLR −/− background (Coenen et al., 2007b Coenen and Hasty, 2007). In contrast to LDLR −/− mice, the A y /aLDLR −/− mice are obese, have an increased fat mass, and have slightly elevated plasma cholesterol and TG levels. Furthermore, when these mice are placed on a Western diet they become even more obese and hyperlipidemic, and also develop IR. The hyperlipidemia appears to be the result of both increased hepatic TG production and decreased VLDL clearance. The A y /aLDLR −/− mice do not develop overt hypertension however, on the Western-type diet they develop a fatty liver. Thus, these mice seem to have many different aspects of MetS and, to date, appear to be one of the best models for use.

The A y /a and apoE −/− mice have also been crossed to generate A y /aapoE −/− mice (Gao et al., 2007). Interestingly, the deficiency of apoE protects A y /a mice from obesity and hepatic steatosis, and improved their insulin sensitivity. Thus, the phenotype of A y /a mice differs in the presence of LDLR versus apoE deficiency.

Summary of obese hyperlipidemic mouse models of the MetS

By crossing models of hyperlipidemia onto obesity-prone backgrounds, it is possible to study several aspects of MetS simultaneously. The mouse models listed above are the most commonly used in this regard, and their use has shed light on the mechanisms by which obesity influences lipoprotein metabolism. In addition, these models have been useful in testing various agents for their therapeutic potential. One disappointment in the studies of these models is that the presence of IR does not appear to impact atherosclerotic lesion formation in most models unless there are concomitant changes in plasma lipid levels (Merat et al., 1999 Wu et al., 2006 Coenen and Hasty, 2007 and reviewed in Goldberg and Dansky, 2006).


חומרים ושיטות

תרבית תאים

Primed hiPSC IMR90-4 (RRID: CVCL_C437) were purchased from WiCell and WTC-11 (RRID: CVCL_Y803) were obtained from The J. David Gladstone Institutes, designated throughout the text by hiPSC 1 and hiPSC 2 respectively. Primed hiPSC were maintained under feeder-free conditions with Matrigel (Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix and Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, BD Biosciences) and fed daily with mTeSR1 medium (STEMCELL Technologies). Versene (Gibco Life Technologies) and Accutase (STEMCELL Technologies) were used to enzymatically dissociate hiPSCs into single cells for hiPSC 1 and hiPSC 2, respectively. At cell passage, mTeSR1 was also supplemented with 5 μM of ROCK inhibitor Y-27632 (Calbiochem). Complete medium exchange was performed every day. Cells were maintained under humidified atmosphere with 5% CO2, at 37°C.

hNSC 1 was derived from hiPSC 1 IMR90-4 using a dual SMAD inhibition protocol [40]. Briefly, hiPSC differentiation was induced by supplementing the culture media with 10 μM SB431542 and 1 μM LDN193189 (both from STEMCELL Technologies) for 10 days. hNSC 2 was originally derived from hiPSC line RIi001-A (RRID: CVCL_C888), as previously described [41] and designated throughout the text as hNSC 2. hNSC were expanded in DMEM/F12 (Invitrogen) with Glutamax, N2 and B27 supplements (Invitrogen), 20 μg/mL insulin and 20 ng/mL of bFGF (Peprotech) and of EGF (Sigma). Half of culture media volume was exchanged every other day [41]. hNSC were maintained under humidified atmosphere with 5% CO2 and 3% O2, at 37°C.

Stirred-tank bioreactor cultures

hiPSC and hNSC were inoculated in 200 mL of media as single cell suspensions of 0.25x10 6 cell/mL and 0.4x10 6 cells/mL, respectively, into software-controlled stirred-tank DASGIP Bioblock bioreactor system (Eppendorf). hiPSC 1, hiPSC 2, hNSC 1 and hNSC 2 were used for these experiments at cell passage number P40, P36, P12 and P34, respectively (four bioreactor runs in total). Bioreactor temperature was set to 37°C, dissolved oxygen to 15%, pH to 7.4, aeration rate to 0.1 vvm and the agitation rate to a range from 70 to 100 rpm [12,42]. Perfusion was initiated after inoculation and interrupted just before the perturbation experiment. Perfusion rates of hiPSC and hNSC were 1.3 day -1 and 0.33 day -1 , respectively. Cells were allowed to aggregate for 2 to 3 days before performing the perturbation experiment.

Perturbation experiments and sampling for metabolomics

Before initiating the perturbation experiment, perfusion was interrupted. Glutamine concentration in the culture medium was determined using an YSI 7100 MBS analyser (YSI Life Sciences, Yellow Springs, Ohio USA) offline. The glutamine pulse was induced by adding the required volume of glutamine concentrated solution (L-Glutamine, 200 mM, Gibco) to attain a concentration of 15 mM in the culture media. Changes in osmolarity of the culture medium of bioreactor cultures were later determined using a K-7400S Semi-Micro Osmometer (KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, Germany). Sampling was performed before the glutamine step and at several time-points after the step: immediately (0 min), 5 min, 10 min, 15 min, 30 min, 1 h and 2 h after. A sample of 15 mL of culture was collected per time-point sample and distributed equitably in three 50 mL tubes, containing ice-cold PBS to quench cell metabolism, generating three technical replicates that were processed independently. After centrifugation at 300xg for 3 min at 4°C, a sample of supernatant was stored for later quantification of extracellular glutamine, glucose, lactate and ammonia. The remaining supernatant was discarded and the cell pellet was washed with ice-cold PBS and centrifuged again. The supernatant was removed and a solution of 40:40:20 acetonitrile:methanol:water was added to extract intracellular metabolites from the cell pellet. Sonication was performed to guarantee a complete cell lysis. The extracts were transferred to microcentrifuge tubes and centrifuged at 20000 x g at 0°C for 15 minutes. Supernatant was collected, snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until metabolomic analysis. The pellet was also snap-frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C until protein quantification. Protein was dissolved in lysis buffer containing 2% SDS (v/v) and quantified using a Microplate BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific). Ammonia was quantified using the Ammonia Assay Kit (Megazyme).

כדאיות תאים

Cell viability in spheroids was analysed before the glutamine perturbation experiment by staining the spheroids with fluorescein diacetate (FDA) in PBS (0.02 mg/mL) and propidium iodide (PI) in PBS (0.002 mg/mL), followed by visualization by fluorescence microscopy using an inverted phase contrast microscope (Leica Microsystems GmbH).

ציטומטריית זרימה

Single-cell suspensions of hiPSC were prepared by Versene/Accutase treatment of cell spheroids. Cell density was determined and 0.5x10 6 cells were transferred to a microcentrifuge tube, centrifuged at 300xg for 5 min and washed with 2% FBS in PBS. The cells were resuspended in 50 μl of a solution containing the primary antibody: TRA-1-60 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21705, dilution 6:100) or SSEA4 (Santa Cruz Biotechnology, sc-21704, dilution 1:10). Cells were incubated with the primary antibody solution for 1 hour at 4°C, washed with 2% FBS in PBS and centrifuged twice, followed by 30 minutes at 4°C incubation with AlexaFluor 488 secondary antibodies (Invitrogen, A21042 for TRA-1-60 and A11001 for SSEA4, dilution 1:1000). Cells were washed and centrifuged twice with 2% FBS in PBS, and finally resuspended in 500 uL of 2% FBS in PBS for flow cytometry analysis. Data was collected on a CyFlow Space flow cytometer from Partec. Cells were gated on forward and side scatter dot plots. 10,000 events per sample were acquired and the data were analyzed with FloMax software (version 3.0).

Immunofluorescence microscopy

hNSC spheroids were plated on sterile glass coverslips inserted on 24-well plates and left for adherence at 37°C and 5% CO2. Each coverslip containing spheroids were washed once with cold PBS +/+ and then fixed in 500 μL of 4% paraformaldehyde + 4% sucrose in phosphate-buffered saline (PBS) for 20 min at room temperature. Before storage, fixed cells were washed twice with 500 μL PBS. Cells were blocked and permeabilized with 0.2% FSG (Gelatin from cold water fish skin, Sigma, G7765) + 0.1% TritonX-100 in PBS for 20 minutes at room temperature. Primary antibodies were diluted in 0.125% FSG in PBS + 0.1% TritonX-100 and added to fixed spheroids for an incubation of 2 hours at room temperature. Afterwards, cells were washed twice with PBS and incubated with secondary antibodies diluted in 0.125% FSG in PBS for 1 hour and protected from light. Primary and secondary antibodies were used as follows: anti-nestin (Merck Millipore, AB5922), anti-Sox2 (Merck Millipore, AB5603), anti-βIII-tubulin (Merck Millipore, 1:200, MAB1637), AlexaFluor 488 goat anti-rabbit IgG (Invitrogen, A11008), AlexaFluor 594 goat anti-mouse IgG (Invitrogen, A11005). Coverslips were mounted in ProLong Gold antifade reagent with DAPI (Invitrogen, P36935) for staining of cell nuclei. Preparations were visualized on an inverted microscope Leica DMI6000 B (Leica Microsystems). The obtained images were processed using FIJI software [43] and relying solely on linear adjustments.

Metabolomic analysis of intracellular extracts

Targeted and quantitative metabolomic analysis was performed using the AbsoluteIDQ p180 kit and the Energy Metabolism Assay (Biocrates Life Sciences AG, Innsbruck, Austria). The two assays quantify a total of 201 metabolites from different biological classes, including amino acids, biogenic amines, acylcarnitines, lysophosphatidylcholines, phosphatidylcholines, sphingomyelins and several metabolites of the energy metabolism. For the first assay, analyses were carried out after phenylisothiocyanate (PITC)-derivatization in the presence of internal standards by flow-injection tandem mass spectrometry (FIA-MS/MS, for quantification of acylcarnitines, (lyso-) phosphatidylcholines, sphingomyelins, hexoses) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS, for amino acids, biogenic amines) using a SCIEX 4000 QTRAP (SCIEX, Darmstadt, Germany) and a Xevo TQ-S Micro (Waters, Vienna, Austria) instrument with an electrospray ionization (ESI) source. The experimental metabolomics measurement technique is described in detail by patent US 2007/0004044 (accessible online at http://www.freepatentsonline.com/20070004044.html). For the second assay, after derivatization to their corresponding methoxime-trimethylsilyl (MeOx-TMS) derivatives, energy metabolites were determined by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) using an Agilent 7890 GC/5975 MSD (Agilent, Santa Clara, USA) system. Pretreated samples were evaporated to complete dryness and subjected to a two-step methoximation-silylation derivatization. N-methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamide (MSTFA) was used as silylation reagent. Split injection was performed and chromatograms were recorded in selected ion monitoring (SIM) mode. External standard calibration curves and ten internal standards were used to calculate concentrations of individual energy metabolites. Data were quantified using the appropriate MS software (Agilent, Masshunter) and imported into Biocrates MetIDQ software for further analysis.

Data pre-processing and statistical analyses

Absolute metabolic values were normalized by the protein content of the cell pellet for each replicated sample (S2 Table). Metabolites with more than 62.5% of missing values or with coefficients of variation greater than 15% were excluded.

For unsupervised analyses, normalized and averaged metabolic values per time-point were z-scored by subtracting to each value the mean for each metabolite-cell and then dividing by the respective standard-deviation. Principal component analysis and hierarchical clustering was performed in Matlab R2015b (MathWorks, Natick MA) and in Perseus software [44], respectively.

Steady-state fold changes were statistically tested by performing a two-sample t-test, two-sided, assuming the two samples comes from independent random samples from normal distributions with equal means and equal but unknown variances. The Benjamini-Hochberg method was used to correct for multiple testing errors using a false discovery rate of 5% [45]. These fold-changes were log2-transformed for depiction in volcano plots and in the Pearson Correlation matrices. These statistical tests and correlations were performed in Matlab R2015b (MathWorks, Natick MA).

Dynamic modelling and characterization of parameters

A classical model from process dynamics and control based on two liquid surge tanks placed in series [23] was used for modelling the dynamical metabolic profiles. The specific model, named second order with numerator dynamics, has different equations for two scenarios: one for an underdamped process and another for an overdamped process, displayed below with a complex variable ס.

Metabolic profiles were fit to these two equations by minimization of the sum of squared residuals. The scenario that presented the lowest residual was chosen. הפרמטר M was calculated based on the concentration of extracellular concentration of glutamine (S1 Table). Fitting of the four other parameters, the steady-state gain K, the numerator coefficient τא, the response time τ and the damping coefficient ζ, was performed in MATLAB using lsqnonlin and nlinfit functions. The former function was used to get a first estimation of model parameters which would serve as initial parameters to the latter, as the latter function accepts standard-deviations as weights for fitting. Fits with residual norm above 4% were not considered. The fitting of intracellular glutamine for the four cell lines, instantly subjected to the sudden extracellular glutamine step, using the same model parameters except one, display considerable resemblance and very low average fitting error (S6 Fig). So, to tackle randomness variable affecting the quantification of moles of metabolites per protein quantity between time-points, experimental values of hNSC (especially affected by the mentioned random variable) were normalized to the shared glutamine profile by multiplying the ratio of simulated value per experimental value of glutamine at that time-point and for that cell line (for all i, g and y, Met normalized i,cell line g, time-point y = Met i,cell line g, time-point y x (Gln simulated cell line g, time-point y / Gln experimental cell line g, time-point y).

The settling time of each fitting curve was determined by finding the time-point after which the metabolic pool value would remain inside a band whose width is equal to ±5% of the final metabolic pool concentration.

The damping coefficient in the overdamped case was calculated directly from the model parameters obtained for each metabolite:


Dynamic stability against short-term variation

Short-term fluctuations in input are inevitable in metabolic systems because inputs of metabolites can change dramatically after each meal. The role of the homeostatic mechanisms in damping the effect of fluctuating inputs can be illustrated by varying the amino acid input terms in the model to reflect the changes in their blood values during and after meals over a 24-hour period [29]. In Fig. 3 we see the effect of three meals on a few concentrations and reaction velocities in an enlarged model of the folate-mediated one carbon metabolism (FOCM) system that also includes the mitochondria and the synthesis of glutathione (GSH) [4]. The fluxes in different parts of the system vary enormously with meals, except for three critical reactions (e.g., thymidylate synthase, the rate-limiting step for DNA synthesis, and DNA methyl transferase), and the concentration of GSH (Fig. 3c), which vary little if at all. This system has the property that many reactions and substrate levels change dramatically in order to maintain stability of a few critical ones. This is typical of physiological homeostasis. By removing the feedbacks one-by-one, or in different combinations, one can study the degree to which each contributes to the stabilization of each of the four critical reactions. For instance, we showed that the inhibition of MTHFR by SAM has the biggest effect on stabilizing the DNMT reaction, whereas the stimulation of cystathionine β-synthase (CBS) by SAM has a smaller effect [2]. The well-known mechanism of product inhibition also has important stabilization effects. S-adenosylhomocysteine (SAH) inhibits all the methyl transferases. Figure 3d shows how this product inhibition helps stabilize the DNMT reaction.

Effect of short-term variation in amino acid input on metabolite levels and reaction velocities in the folate and methionine cycles. Three pulses of amino acids are shown by gray bars below the figures, corresponding to three meals over a 24-hour period. Variation in response is shown as percentage deviation from the mean. א Two metabolites (SAM and 5mTHF) and reaction velocities [cystathionine β-synthase (CBS) and MTHFR] that show complementary responses. ב Reaction velocities of mitochondrial and cytosolic serinehydroxymethyltransferase (SHMT values below −100 % are reversals of direction of the reaction). ג Dynamic variation of fluxes throughout the pathway stabilize the velocities of DNMT, TS, and AICART and the concentration of glutathione. ד Eliminating product inhibition by S-adenosylhomocysteine (SAH) increases the sensitivity of the DNMT reaction to variation in input is indicated by the greater amplitude of the response. After [28, 35]


רקע כללי

Recombinant protein production is a multibillion-dollar business, mainly comprised by therapeutic agents (i.e. recombinant biologic drugs) and industrial enzymes [1–3]. These compounds are commonly synthesized in אי קולי, Saccharomyces cerevisiae and Chinese Hamster Ovary cells (CHO) [1, 4–6] however, there is strong pressure to find cost-effective alternatives to overcome technical and economic disadvantages of the aforementioned cell factories, especially in downstream processing [7].

Among the unconventional cell factories used for recombinant protein production, the methylotrophic yeast Pichia pastoris (syn. Komagataella phaffii) has received special attention thanks to its convenient physiology and easy handling [8]. There are strong promoters for this cell factory which are commercially available and that allow for the controlled expression of heterologous proteins [8]. בניגוד אי - קולי, P. pastoris naturally performs post-translational modifications [6, 9], which are essential for most eukaryotic protein functionality [7, 10, 11]. בניגוד ל S. cerevisiae, P. pastoris exhibits a Crabtree-negative phenotype, showing a reduced synthesis of undesirable products, like ethanol, in glucose-limited conditions [12, 13]. It also shows a lower basal secretion of proteins when compared to other yeasts, which makes downstream processing easier [13, 14]. סוף כל סוף, P. pastoris can be efficiently cultivated up to high cell densities using fed-batch technology [8], achieving high titers and productivities. For these desirable features, P. pastoris has been widely used for the expression of recombinant proteins, reaching grams per liter concentrations in several cases [9, 15–18]. Most remarkably, and as proof of its technical feasibility and adequacy, two recombinant proteins produced in this cell factory have already been approved by the FDA for medical purposes [10, 19].

Despite its growing acceptance and actual successful applications, recombinant protein production in P. pastoris can be undermined by several cellular processes, where protein folding and secretion are the most recurrent bottlenecks [14, 20, 21]. In addition, limitations may also be caused by the codon usage of the recombinant protein [22], promoter selection [23], carbon and oxygen availability in the culture [24, 25] and fed-batch operational parameters [26], seriously hampering protein yield, productivity and the economic feasibility of the process.

Industrially, P. pastoris is commonly grown in fed-batch cultures in order to maximize the titer and volumetric productivity of a desired compound, often a recombinant protein [27, 28]. This is achieved by adding a culture medium in such a way that the microorganism grows at a desired specific growth rate, which is chosen to maximize the synthesis of the target product and to limit the formation of inhibitory compounds [29]. During this and other cultivation systems, the cells adapt constantly to the changing extracellular environment and to the limited mass transfer conditions observed at high densities [30, 31]. Therefore, it is critical to understand how the cell metabolism interacts with the nutritional and environmental stresses exerted by process conditions to improve bioreactor performance [32]. This is a complex task, however, since the strain’s characteristics and process variables often require significant amounts of time and money for characterization and fine-tuning [12]. Therefore, it is desirable to have a platform to integrate different levels of information from dynamic cultivations of P. pastoris that can be used to elaborate rational hypotheses to increase process productivity.

Systems biology offers a quantitative and comprehensive approach to address this task [33]. In particular, Genome-Scale dynamic Flux Balance Analysis (GS-dFBA) [34–36] is a modeling framework that allows the simulation of metabolism during non-stationary (batch or fed-batch) cultures. GS-dFBA models couple the dynamic mass balances of the extracellular environment of the bioreactor with comprehensive mathematical representations of cellular metabolism called Genome Scale Metabolic Models (GSMs). These structures represent the cell’s entire metabolism as a set of underdetermined constrained mass-balances [30, 37, 38]. GSMs have been employed to understand cellular behavior under different environmental conditions, to map over omics data, and to define a metabolic engineering targets [39, 40]. There are currently five published GSMs of P. pastoris [41–45] which have been developed to help the strain optimization process with a special emphasis on recombinant protein production. Moreover, one of these models has been successfully employed to improve recombinant protein production in P. pastoris [46], validating these frameworks as strain engineering tools for this particular yeast.

GS-dFBA models usually contain several parameters, whose values can be obtained by regression of experimental data. These parameters are used as inputs to obtain flux distributions throughout cultivations, so their values need to be reliable. To ensure this, pre- and post-regression diagnostics have been employed to determine if a certain parameter is supported by the observed data or not [47, 48]. These analyses consist in verifying the model’s capacity to explain the behavior of a system (goodness-of-fit) and the presence of the following parametric limitations: (i) low or no impact on the state variables (sensitivity), (ii) strong correlations with other parameters of the model (identifiability) and (iii) lack of statistical significance (significance). A model is considered robust if it has the capacity to explain different conditions, while containing only sensitive, identifiable and significant parameters.

Here, we present a robust dynamic genome-scale metabolic model of P. pastoris in glucose-limited, aerobic batch and fed-batch cultivations. To assemble the dynamic modeling framework, we started by selecting one of the available genome-scale metabolic models [43] and manually curated it to yield realistic flux distributions. Then, we included it in a set of mass balances representing the main compounds present in culture supernatant. Once assembled, the model was calibrated using experimental data from eight batch and three fed-batch cultivations. Next, we employed pre/post regression diagnostics to determine sensitivity, significance and identifiability problems in the model. In order to avoid the aforementioned statistical limitations, problematic parameters were fixed (i.e. removed from the adjustable parameter set) based on the pre/post regression diagnostics, yielding reduced and potentially robust model structures. Potentially robust model structures consisted in the original model formulation with less adjustable parameters. After evaluating these reduced models for each type of cultivation, we chose the one that presented fewer parametric limitations after being re-calibrated with the available data. These reduced models yielded no (or just a few) significance, sensitivity or identifiability problems when calibrating new data and they could predict bioreactor dynamics in conditions like the ones used for their determination. Finally, we carried out simulations to assess the potential of the model to study P. pastoris metabolism under industrially relevant conditions, and to select molecular and process engineering strategies to improve recombinant protein production.


הכרות

Martin Foltz (Unilever) is thanked for providing useful comments on the manuscript. We acknowledge the financial support of the European Community under the Framework 6 Marie-Curie Host Fellowships for the Transfer of Knowledge Industry-Academia Strategic Partnership scheme, specifically GUTSYSTEM Project MTKI-CT-2006-042786. Sam Possemiers and Tom Van de Wiele are postdoctoral research fellows of the Flemish Science Foundation (FWO-Vlaanderen). Part of this project was carried out within the research program of the Netherlands Metabolomics Centre, which is part of the Netherlands Genomics Initiative/Netherlands Organization for Scientific Research.


צפו בסרטון: מארק צוקרברג ויובל נח הררי בשיחה (אוֹקְטוֹבֶּר 2022).