מֵידָע

איך אני קורא דפוס ביטוי RNA?

איך אני קורא דפוס ביטוי RNA?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

כשקוראים על מחלות אפשר למצוא קישורים לחלבונים ולגנים הקשורים אליהם, דוגמה לכך היא כאן.

אני תוהה כיצד לפענח/לקרוא את הגרף הבא בתור איש מקצוע בתחום זה:

מה כל זה אומר?


תמונה זו מציגה ביטוי של גן (במקרה שלך Lamin A/C) ברקמות שונות. תמונה עם תוצאה גבוהה יותר עבור עכבר נראית כך (מכאן):

ניתן לראות את הביטוי החציוני (מחושב מכל הדגימות) וכן ניתן לראות באילו רקמות הגן הזה מתבטא בצורה גבוהה ובאילו יש פחות או אין ביטוי.

זה חשוב אם אתה רוצה לנתח את תפקוד הגן. דפוס הביטוי הספציפי לרקמות יכול להשתנות מאוד בין רקמות שונות (כפי שאתה יכול לראות באיור) שיכול לתת מידע על תפקוד הגן. הדבר נכון אם אתה מסתכל על התפלגות הזמן של ביטוי גנים, אתה יכול לזהות גנים שחשובים לשלבים שונים של בידול.


כיצד אוכל לקרוא דפוס ביטוי של RNA? - ביולוגיה

כדי שתא יתפקד כראוי, יש לסנתז את החלבונים הדרושים בזמן המתאים. כל התאים שולטים או מווסתים את סינתזת החלבונים מתוך מידע המקודד ב- DNA שלהם. נקרא תהליך הפעלת הגן לייצור RNA וחלבון ביטוי גנים. בין אם באורגניזם חד-תאי פשוט או באורגניזם רב-תאי מורכב, כל תא שולט מתי וכיצד הגנים שלו באים לידי ביטוי. כדי שזה יקרה, חייב להיות מנגנון לשלוט מתי מתבטא גן לייצור RNA וחלבון, כמה מהחלבון נוצר, ומתי הגיע הזמן להפסיק לייצר את החלבון כי אין בו עוד צורך.

ויסות ביטוי הגנים חוסך אנרגיה ומרחב. זה ידרוש כמות משמעותית של אנרגיה כדי שהאורגניזם יבטא כל גן בכל עת, כך שיעיל יותר באנרגיה להפעיל את הגנים רק כאשר הם נדרשים. בנוסף, רק ביטוי קבוצת משנה של גנים בכל תא חוסך מקום כיוון שיש לפרוט DNA מהמבנה הסליל שלו כדי לתמלל ולתרגם את ה- DNA. תאים יצטרכו להיות עצומים אם כל חלבון יתבטא בכל תא כל הזמן.

השליטה בביטוי הגנים מורכבת ביותר. תקלות בתהליך זה פוגעות בתא ועלולות להוביל להתפתחות מחלות רבות, כולל סרטן.


'דוגמה מרכזית'

ביחד, RNA, קיצור של חומצה ריבונוקלאית, ו DNA, קיצור של חומצה דאוקסיריבונוקלאית, מרכיבות את חומצות הגרעין, אחת משלושת או ארבעת המחלקות של "מקרומולקולות" עיקריות הנחשבות חיוניות לחיים. (האחרים כן חלבונים ושומנים. מדענים רבים גם ממקמים פחמימות בקבוצה זו.) מקרומולקולות הן מולקולות גדולות מאוד, לרוב מורכבות מתת-יחידות חוזרות. RNA ו- DNA מורכבים מיחידות משנה הנקראות נוקלאוטידים.

שתי חומצות הגרעין מתחברות ליצירת חלבונים. תהליך יצירת החלבונים באמצעות המידע הגנטי בחומצות הגרעין כה חשוב לחיים עד שהביולוגים מכנים אותו "הדוגמה המרכזית" של הביולוגיה המולקולרית. הדוגמה, המתארת ​​את זרימת המידע הגנטי באורגניזם, על פי אוניברסיטת אורגון סטייט, אומר שמידע ה- DNA נכתב, או "מתועתק", כמידע RNA, ומידע ה- RNA נכתב, או "מתורגם" לחלבון.

"RNA באופן בסיסי הוא הביו -מולקולה המחברת בין DNA וחלבונים", אמר צ'ואן הוא, ביולוג מאוניברסיטת שיקגו שחוקר שינויים ב- RNA, ל- Live Science.


תוכן

עריכת הכנה לספרייה

השלבים הכלליים להכנת ספריית DNA משלימה (cDNA) לרצף מתוארים להלן, אך לעתים קרובות משתנים בין הפלטפורמות. [8] [3] [9]

  1. בידוד RNA:RNA מבודד מרקמות ומעורבב עם deoxyribonuclease (DNase). DNase מפחית את כמות ה-DNA הגנומי. כמות השפלת ה- RNA נבדקת באמצעות ג'ל ואלקטרופורזה נימית ומשמשת להקצאת מספר תקינות RNA לדגימה. איכות ה-RNA הזו והכמות הכוללת של ה-RNA ההתחלתי נלקחות בחשבון במהלך הכנת הספרייה, הרצף והניתוח שלאחר מכן.
  1. בחירת/דלדול RNA: כדי לנתח אותות של עניין, ניתן לשמור את ה-RNA המבודד כפי שהוא, לסנן ל-RNA עם זנבות 3' polyadenylated (poly(A)) כדי לכלול רק mRNA, מדולדל מ-RNA ריבוזומי (rRNA), ו/או לסנן עבור RNA ש קושר רצפים ספציפיים (שיטות בחירה ודלדול RNA הטבלה שלהלן). ה- RNA עם זנבות פולי (A) 3 'מורכב בעיקר מרצפים בוגרים, מעובדים, מקודדים. בחירת Poly(A) מתבצעת על ידי ערבוב RNA עם אוליגומרים פולי(T) המחוברים באופן קוולנטי למצע, בדרך כלל חרוזים מגנטיים. [10] [11] לבחירת פולי (א) יש מגבלות חשובות בזיהוי ביו -סוג RNA. ביוטיפים רבים של RNA אינם פוליאדנילטים, כולל תעתיקי RNA רבים שאינם מקודדים חלבון ליבת היסטון, או מווסתים באמצעות אורך הזנב הפולי(A) שלהם (למשל, ציטוקינים) ולכן ייתכן שלא יתגלו לאחר בחירת poly(A). [12] יתר על כן, בחירת poly(A) עשויה להגביר את הטיית 3', במיוחד עם RNA באיכות נמוכה יותר. [13][14] ניתן להימנע ממגבלות אלו עם דלדול ריבוזומלי, הסרת rRNA המייצג בדרך כלל למעלה מ-90% מה-RNA בתא. הן שלבי העשרה של פולי(A) והן שלבי דלדול ריבוזומלי הם עתירי עבודה ויכולים להכניס הטיות, כך שפותחו גישות פשוטות יותר להעלמת השלבים הללו. [15] מטרות RNA קטנות, כגון miRNA, ניתנות לבידוד נוסף באמצעות בחירת גודל עם ג'לי אי הכללה, חרוזים מגנטיים או ערכות מסחריות.
  1. סינתזת cDNA: RNA מועתק לאחור ל-cDNA מכיוון שה-DNA יציב יותר וכדי לאפשר הגברה (המשתמשת בפולימראזות של DNA) ולמנף טכנולוגיית ריצוף DNA בוגרת יותר. הגברה לאחר שעתוק הפוך גורמת לאובדן תקוע, שניתן להימנע ממנו באמצעות תיוג כימי או רצף מולקולות בודדות. פיצול ובחירת גודל מתבצעים כדי לטהר רצפים באורך המתאים למכונת הרצף. ה- RNA, cDNA, או שניהם מקוטעים עם אנזימים, סאודיקציה או נבולייזרים. פיצול ה- RNA מפחית את הטיה של 5 'של שעתוק מבוסס-אקראי הפוך והשפעה של אתרי קישור פריימר, [11] עם החיסרון שקצות 5' ו- 3 'מומרים ל- DNA בצורה פחות יעילה. פיצול מלווה בבחירת גודל, כאשר רצפים קטנים מוסרים או שנבחר טווח צפוף של אורכי רצף. מכיוון ש-RNA קטנים כמו miRNA הולכים לאיבוד, הם מנותחים באופן עצמאי. ה-cDNA עבור כל ניסוי יכול להיות אינדקס עם ברקוד הקסאמר או אוקטמר, כך שניתן לאגד את הניסויים הללו לנתיב אחד לרצף מרובה.

רצף DNA משלים (cDNA-Seq) עריכה

ספריית cDNA המופקת מביוטיפים של RNA עוברת רצף לפורמט קריא במחשב. קיימות טכנולוגיות רצף רבות בתפוקה גבוהה עבור רצף cDNA כולל פלטפורמות שפותחו על ידי Illumina, Thermo Fisher, BGI/MGI, PacBio ואוקספורד Nanopore Technologies. [16] עבור רצף קריאה קצרה של Illumina, טכנולוגיה נפוצה לרצף cDNA, מתאמים מקושרים ל-cDNA, DNA מחובר לתא זרימה, אשכולות נוצרים באמצעות מחזורים של הגברה ודנטורציה של גשר, ורצף לפי סינתזה הוא מבוצע במחזורים של סינתזת גדילים משלימים ועירור לייזר של בסיסים עם מסופים הפיכים. בחירת הפלטפורמה והפרמטרים של רצף הפלטפורמות מונחים על ידי עיצוב ניסיוני ועלות. שיקולי תכנון ניסויים נפוצים כוללים החלטה על אורך הרצף, עומק הרצף, שימוש ברצף קצה בודד לעומת זווג, מספר שכפולים, ריבוי, רנדומיזציה ו-Spike-ins. [17]

עריכת רצף RNA קטן/לא מקודד RNA

בעת ריצוף של RNA אחר מלבד mRNA, הכנת הספרייה משתנה. ה- RNA הסלולרי נבחר על בסיס טווח הגדלים הרצוי. עבור מטרות RNA קטנות, כגון miRNA, ה-RNA מבודד באמצעות בחירת גודל. זה יכול להתבצע עם ג'ל אי הכללת גודל, באמצעות חרוזים מגנטיים לבחירת גודל, או עם ערכה שפותחה מסחרית. לאחר בידוד, קישורים מתווספים לקצה 3' ו-5' ואז מטוהרים. השלב האחרון הוא יצירת cDNA באמצעות שעתוק הפוך.

עריכת רצף RNA ישיר

מאחר שהמרת RNA ל-cDNA, קשירה, הגברה ומניפולציות אחרות של דגימות הוכחו כמציגות הטיות וחפצים שעלולים להפריע הן לאפיון והן לכימות התמלילים, [18] רצף RNA ישיר של מולקולה בודדת נחקר על ידי חברות כולל Helicos (פושט רגל), אוקספורד ננופור טכנולוגיות, [19] ואחרים. טכנולוגיה זו רצפת מולקולות RNA ישירות בצורה מאסיבית-מקבילה.

עריכת רצף RNA בזמן אמת מולקולה אחת

RNA-Seq ישיר של מולקולה בודדת מקבילה בצורה מסיבית נחקרה כחלופה ל-RNA-Seq המסורתית, שבה המרת RNA ל-cDNA, קשירה, הגברה ושלבי מניפולציה אחרים של דגימות עשויים להציג הטיות וחפצים. [20] פלטפורמות טכנולוגיות המבצעות RNA-Seq בזמן אמת מולקולה אחת כוללות רצף Nanopore Technologies של אוקספורד (ONT), [19] PacBio IsoSeq והליקוס (פושט רגל). רצף RNA בצורתו המקורית משמר שינויים כמו מתילציה, ומאפשר לחקור אותם ישירות ובו-זמנית. [19] יתרון נוסף של RNA-Seq מולקולה אחת הוא שניתן לכסות תמלילים באורך מלא, מה שמאפשר זיהוי וכימות איזופורם של ביטחון גבוה יותר בהשוואה לרצף קצר. באופן מסורתי, לשיטות RNA-Seq מולקולה אחת יש שיעורי שגיאות גבוהים יותר בהשוואה לרצף קצר, אך שיטות חדשות יותר כמו ONT ישירות RNA-Seq מגבילות שגיאות על ידי הימנעות מפיצול והמרת cDNA. שימושים אחרונים ב-ONT Direct RNA-Seq לביטוי דיפרנציאלי באוכלוסיות תאים אנושיים הוכיחו שטכנולוגיה זו יכולה להתגבר על מגבלות רבות של רצף cDNA קצר וארוך. [21]

עריכת RNA בתא בודד (scRNA-Seq)

שיטות סטנדרטיות כגון מיקרו מערכים וניתוח RNA-Seq סטנדרטי בתפזורת מנתחות את הביטוי של RNA מאוכלוסיות גדולות של תאים. באוכלוסיות תאים מעורבות, מדידות אלה עשויות לטשטש הבדלים קריטיים בין תאים בודדים בתוך אוכלוסיות אלה. [22] [23]

רצף RNA חד-תא (scRNA-Seq) מספק את פרופילי הביטוי של תאים בודדים. למרות שלא ניתן לקבל מידע מלא על כל RNA המובע על ידי כל תא, בשל כמות החומר הקטנה הזמין, ניתן לזהות דפוסים של ביטוי גנים באמצעות ניתוחי אשכולות גנים. זה יכול לחשוף את קיומם של סוגי תאים נדירים בתוך אוכלוסיית תאים שאולי לא נראו מעולם. לדוגמה, תאים מיוחדים נדירים בריאה הנקראים יונוציטים ריאתיים המבטאים את הרגולטור מוליכות טרנסממברנית של סיסטיק פיברוזיס זוהו בשנת 2018 על ידי שתי קבוצות המבצעות scRNA-Seq באפיתל דרכי הנשימה של הריאות. [24] [25]

נהלים ניסויים ערוך

פרוטוקולי scRNA-Seq נוכחיים כוללים את השלבים הבאים: בידוד של תא בודד ו-RNA, שעתוק הפוך (RT), הגברה, יצירת ספרייה ורצף. תאים בודדים מופרדים באופן מכני למיקרו (למשל, BD Rhapsody, Takara ICELL8, Vycap Puncher Platform או CellMicrosystems CellRaft) או עטופים בטיפות (למשל 10x Genomics Chromium, Illumina Bio-Rad ddSEQ, 1CellBio InDrop, Dolomite Bio Nadia). [26] תאים בודדים מסומנים על ידי הוספת חרוזים עם אוליגונוקלאוטידים עם ברקוד, הן תאים והן חרוזים מסופקים בכמויות מוגבלות כך שתפוסה משותפת עם מספר תאים וחרוזים היא אירוע נדיר מאוד. לאחר השלמת שעתוק הפוך, ניתן לערבב את ה- cDNA מתאים רבים יחד כדי שתמלילי רצף מתא מסוים יזוהו על ידי הברקוד הייחודי של כל תא. [27] [28] ניתן לצרף מזהה מולקולרי ייחודי (UMI) לרצפי יעד mRNA/cDNA כדי לסייע בזיהוי חפצים במהלך הכנת הספרייה. [29]

האתגרים עבור scRNA-Seq כוללים שימור השפע היחסי הראשוני של mRNA בתא וזיהוי תמלילים נדירים. [30] שלב השעתוק ההפוך הוא קריטי שכן היעילות של תגובת ה- RT קובעת כמה מאוכלוסיית ה- RNA של התא תנותח בסופו של דבר על ידי הרצף. התהליכים של תעתיקים הפוכים ואסטרטגיות ה-priming בשימוש עשויות להשפיע על ייצור cDNA באורך מלא ועל יצירת ספריות מוטות לקצה 3' או 5' של גנים.

בשלב ההגברה, PCR או תמלול במבחנה (IVT) משמשים כיום להגברת cDNA. אחד היתרונות של שיטות מבוססות PCR הוא היכולת ליצור cDNA באורך מלא. עם זאת, יעילות PCR שונה ברצפים מסוימים (למשל, תוכן GC ומבנה Snapback) עשויה גם להיות מוגברת באופן אקספוננציאלי, ולייצר ספריות עם כיסוי לא אחיד. מצד שני, בעוד שספריות שנוצרו על ידי IVT יכולות להימנע מהטיית רצף הנגרמת על ידי PCR, רצפים ספציפיים עלולים להיות משועתקים בצורה לא יעילה, ובכך לגרום לנשירת רצף או יצירת רצפים לא שלמים. [31] [22] פורסמו מספר פרוטוקולי scRNA-Seq: Tang et al., [32] STRT, [33] SMART-seq, [34] CEL-seq, [35] RAGE-seq, [36] קוורץ -מסה [37] ו- C1-CAGE. [38] הפרוטוקולים הללו שונים מבחינת אסטרטגיות לשעתוק הפוך, סינתזה והגברה של cDNA, והאפשרות להכיל ברקודים ספציפיים לרצף (כלומר UMIs) או היכולת לעבד דגימות מאוחדות. [39]

בשנת 2017, הוצגו שתי גישות למדידת ביטוי mRNA חד-תא וחלבון בו זמנית באמצעות נוגדנים המסומנים באוליגונוקלאוטידים הידועים כ-REAP-seq, [40] ו-CITE-seq. [41]

עריכת יישומים

scRNA-Seq הופך בשימוש נרחב על פני דיסציפלינות ביולוגיות כולל פיתוח, נוירולוגיה, [42] אונקולוגיה, [43] [44] [45] מחלה אוטואימונית, [46] ומחלות זיהומיות. [47]

scRNA-Seq סיפקה תובנה ניכרת לגבי התפתחותם של עוברים ואורגניזמים, כולל התולעת Caenorhabditis elegans, [48] והפלנרית המתחדשת Schmidtea mediterranea. [49] [50] חיות החוליות הראשונות שמיפו בצורה זו היו דג הזברה [51] [52] ו Xenopus laevis. [53] בכל מקרה נלמדו שלבים מרובים של העובר, המאפשרים למפות את כל תהליך ההתפתחות על בסיס תאים. [8] המדע הכיר בהתקדמות זו כפריצת השנה לשנת 2018. [54]

שיקולים ניסיוניים ערוך

מגוון פרמטרים נלקח בחשבון בעת ​​תכנון וביצוע ניסויי RNA-Seq:

  • סגוליות רקמות: ביטוי גנים משתנה בתוך ובין רקמות, ו-RNA-Seq מודד את התמהיל הזה של סוגי תאים. זה עשוי להקשות על בידוד המנגנון הביולוגי של עניין. ניתן להשתמש ברצף של תא בודד כדי ללמוד כל תא בנפרד, להקל על בעיה זו.
  • תלות בזמן: ביטוי הגנים משתנה עם הזמן, ו- RNA-Seq מצלם רק תמונת מצב. ניתן לבצע ניסויים בקורס זמן כדי לצפות בשינויים בתעתיק.
  • כיסוי (המכונה גם עומק): RNA מכיל את אותן מוטציות שנצפו ב-DNA, וזיהוי דורש כיסוי עמוק יותר. עם כיסוי גבוה מספיק, ניתן להשתמש ב-RNA-Seq כדי להעריך את הביטוי של כל אלל. זה עשוי לספק תובנה לגבי תופעות כמו הטבעה או השפעות רגולטוריות cis. ניתן להעריך את עומק הרצף הנדרש ליישומים ספציפיים מניסוי פיילוט. [55]
  • חפצי יצירת נתונים (הידועים גם בתור שונות טכנית): הריאגנטים (למשל, ערכת הכנה לספרייה), כוח אדם מעורב וסוג רצף (למשל, Illumina, Pacific Biosciences) יכולים לגרום לחפצים טכניים שעלולים להתפרש בצורה לא נכונה כתוצאות משמעותיות. כמו כל ניסוי מדעי, זה זהיר לנהל RNA-Seq בסביבה מבוקרת היטב. אם זה לא אפשרי או שהמחקר הוא מטה-אנליזה, פתרון נוסף הוא לזהות חפצים טכניים על ידי הסקת משתנים סמויים (בדרך כלל ניתוח רכיבים עיקריים או ניתוח גורמים) ולאחר מכן תיקון למשתנים אלו. [56]
  • ניהול נתונים: ניסוי RNA-Seq יחיד בבני אדם הוא בדרך כלל 1-5 ג'יגה-בתים (דחוסים), או יותר כאשר כולל קבצי ביניים. [57] נפח נתונים גדול זה יכול להוות בעיות אחסון. פתרון אחד הוא דחיסת הנתונים באמצעות סכמות חישוביות רב תכליתיות (למשל, gzip) או סכמות ספציפיות לגנומיקה. האחרון יכול להיות מבוסס על רצפי התייחסות או דה נובו. פתרון נוסף הוא לבצע ניסויים במיקרו-מערך, שעשויים להספיק לעבודה מונעת השערות או למחקרי שכפול (בניגוד למחקר חקר).

מכלול תעתיק עריכה

שתי שיטות משמשות להקצאת קריאות רצף גולמיות לתכונות גנומיות (כלומר, הרכבת התמלול):

  • דה נובו: גישה זו אינה דורשת גנום הפניה לשחזור התמלול, והיא משמשת בדרך כלל אם הגנום אינו ידוע, אינו שלם או משתנה באופן מהותי בהשוואה להתייחסות. [58] האתגרים בעת שימוש בקריאות קצרות להרכבת דה -נובו כוללים 1) קביעת אילו קריאות יש לחבר יחד לרצפים רציפים (תמציות), 2) עמידות לשגיאות רצף וחפצים אחרים, ו -3) יעילות חישובית. האלגוריתם העיקרי המשמש להרכבת דה נובו עבר מתרשימי חפיפה, המזהים את כל החפיפות הזוגיות בין הקריאות, לתרשימים של דה ברוין, המפרקים את הקריאות לרצפים באורך k ומוטטים את כל ה- k-mers לטבלת חשיש. [59] גרפי חפיפה שימשו ברצף של סנגר, אך אינם נוגדים היטב למיליוני הקריאות שנוצרו באמצעות RNA-Seq. דוגמאות למכלולים המשתמשים בגרפים של דה ברוין הם טריניטי, [58] נווה מדבר [60] (נגזר ממכלול הגנום קטיפה [61]), ברידג'ר, [62] ו- rnaSPAdes. ] מדדים להערכת האיכות של מכלול דה נובו כוללים אורך חציון חציוני, מספר קונטיגים ו-N50. [64]
  • מונחה הגנום: גישה זו מסתמכת על אותן שיטות המשמשות ליישור DNA, עם המורכבות הנוספת של קריאות יישור המכסות חלקים לא רציפים של גנום הייחוס. [65] קריאות לא רציפות אלו הן תוצאה של רצפי תמלילים מחוברים (ראו איור). בדרך כלל, לאלגוריתמי יישור יש שני שלבים: 1) יישור חלקים קצרים מהקריאה (כלומר, זריעה של הגנום), ו-2) שימוש בתכנות דינמי כדי למצוא יישור אופטימלי, לפעמים בשילוב עם הערות ידועות. כלי תוכנה המשתמשים ביישור מונחה גנום כוללים את Bowtie, [66] TopHat (המתבססת על תוצאות BowTie ליישור צמתי splice), [67][68] Subread, [69] STAR, [65] HISAT2, [70] ו-GMAP . [71] ניתן לנצל עוד יותר את הפלט של כלי יישור מונחים (מיפוי) מונחים על ידי כלים כגון חפתים [68] או StringTie [72] לשחזור רצפי תמלול רציפים (כְּלוֹמַר, קובץ FASTA). ניתן למדוד את האיכות של הרכבה מונחית גנום עם 1) מדדי הרכבה דה נובו (למשל, N50) ו-2) השוואות לתמלול ידוע, צומת שחבור, גנום וחלבון באמצעות דיוק, היזכרות, או השילוב שלהם (למשל, ציון F1). [64] בנוסף, בסיליקו ניתן לבצע הערכה באמצעות קריאות סימולציות. [73][74]

הערה לגבי איכות ההרכבה: הקונצנזוס הנוכחי הוא כי 1) איכות ההרכבה יכולה להשתנות בהתאם למדד המשמש, 2) כלי הרכבה שקיבלו ציון טוב במין אחד אינם בהכרח מתפקדים היטב במינים האחרים, ו 3) שילוב גישות שונות עשוי להיות האמין ביותר. [75] [76] [77]

כימות ביטוי גנים עריכה

הביטוי מכמת את השינויים התאיים בתגובה לגירויים חיצוניים, הבדלים בין מצבים בריאים לחולי ושאלות מחקר אחרות. רמות התמלול משמשות לעתים קרובות כפרוקסי לשפע חלבון, אך לעתים קרובות אלו אינן שוות ערך עקב אירועים שלאחר תמלול כגון הפרעות RNA וריקבון בתיווך שטויות. [78]

הביטוי נכמת על ידי ספירת מספר הקריאות שמופו לכל לוקוס בשלב הרכבת התעתיק. ניתן לכמת ביטוי לאקסונים או גנים באמצעות קונטיג'ים או ביאורי תמליל הפניה. [8] ספירות קריאה של RNA-Seq שנצפו אלה אושרו בצורה חזקה מול טכנולוגיות ישנות יותר, כולל מיקרו-מערכי ביטוי ו-qPCR. [55] [79] כלים לכמת ספירות הם HTSeq, [80] FeatureCounts, [81] Rcount, [82] maxcounts, [83] FIXSEQ, [84] ו- Cuffquant. כלים אלה קובעים ספירות קריאה מנתוני RNA-Seq מיושרים, אך ניתן לקבל ספירות ללא יישור גם עם Sailfish [85] ו-Kallisto. [86] ספירות הקריאה מומרות לאחר מכן למדדים מתאימים לבדיקת השערות, רגרסיות וניתוחים אחרים. הפרמטרים להמרה זו הם:

  • עומק/כיסוי רצף: למרות שהעומק מוגדר מראש בעת ביצוע ניסויים מרובים ב- RNA-Seq, הוא עדיין ישתנה מאוד בין הניסויים. [87] לכן, המספר הכולל של קריאות שנוצרו בניסוי בודד מנורמל בדרך כלל על ידי המרת ספירות לשברים, קריאה או ספירה למיליון קריאה ממופה (FPM, RPM או CPM). ההבדל בין RPM ל- FPM נגזר היסטורית במהלך האבולוציה מרצף חד-קמטי של שברים לרצף-קצה. ברצף יחיד, יש רק קריאה אחת לכל קטע (כְּלוֹמַר, RPM = FPM). ברצף בקצה משויך, יש שתי קריאות לכל קטע (כְּלוֹמַר, סל"ד = 2 x FPM). עומק הרצף מכונה לפעמים גודל הספרייה, מספר מולקולות cDNA המתווכות בניסוי.
  • אורך הגן: לגנים ארוכים יותר יהיו יותר שברים/קריאות/ספירות מאשר גנים קצרים יותר אם ביטוי התמלול זהה. זה מותאם על ידי חלוקת ה-FPM באורך של תכונה (שיכול להיות גן, תמליל או אקסון), וכתוצאה מכך השברים המטריים לקילו-בסיס של תכונה למיליון קריאות ממופה (FPKM). [88] כאשר מסתכלים על קבוצות של תכונות על פני דגימות, FPKM מומר לתמלילים למיליון (TPM) על ידי חלוקת כל FPKM בסכום ה-FPKMs בתוך מדגם. [89] [90] [91]
  • תפוקת RNA מדגם כוללת: כיוון שאותה כמות RNA מופקת מכל דגימה, לדגימות עם יותר RNA הכולל יהיו פחות RNA לכל גן. נראה כי לגנים אלה יש ירידה בביטוי, וכתוצאה מכך תוצאות חיוביות שווא בניתוחים במורד הזרם. [87] אסטרטגיות נורמליזציה הכוללות קוונטיל, DESeq2, TMM וחציון החציון מנסות להסביר את ההבדל הזה על ידי השוואת קבוצת גנים שאינם מתבטאים באופן דיפרנציאלי בין הדגימות והקנה המידה בהתאם. [92]
  • שונות לביטוי של כל גן: מעוצב כדי לתת מענה לשגיאות דגימה (חשוב לגנים עם ספירות קריאה נמוכות), להגדיל את ההספק ולהפחית תוצאות חיוביות שגויות. ניתן להעריך את השונות כהתפלגות בינומית נורמלית, פואסון או שלילית [93][94][95] והיא מפורקת לעתים קרובות לשונות טכנית וביולוגית.

ספייק-אין לכימות וזיהוי מוחלטים של השפעות על הגנום ערוך

RNA ספייק-אין הם דוגמאות של RNA בריכוזים ידועים שיכולים לשמש כתקני זהב בעיצוב ניסיוני ובמהלך ניתוחים במורד הזרם לכימות וזיהוי מוחלטים של השפעות רחבות הגנום.

  • כימות מוחלטת: כימות מוחלט של ביטוי גנים אינו אפשרי ברוב ניסויי RNA-Seq, המכמתים ביטוי ביחס לכל התמלילים. זה אפשרי על ידי ביצוע RNA-Seq עם spike-ins, דגימות של RNA בריכוזים ידועים. לאחר רצף, נעשה שימוש בספירות קריאה של רצפי ספייק-אין כדי לקבוע את הקשר בין ספירות הקריאה של כל גן לכמויות מוחלטות של שברים ביולוגיים [11] [96] בדוגמה אחת, טכניקה זו שימשה Xenopus tropicalis עוברים לקביעת קינטיקה של שעתוק. [97]
  • זיהוי השפעות על הגנום: שינויים ברגולטורים הגלובליים, כולל שיפוצני כרומטין, גורמי שעתוק (למשל MYC), מתחמי אצטיל-טרנספראז ומיקום נוקלאוזום אינם תואמים הנחות נורמליזציה ובקרות ספייק-אין יכולות להציע פרשנות מדויקת. [98][99]

ביטוי דיפרנציאלי ערוך

השימוש הפשוט ביותר אך לרוב החזק ביותר ב-RNA-Seq הוא מציאת הבדלים בביטוי הגנים בין שני מצבים או יותר (לְמָשָׁל, מטופלים לעומת לא מטופלים) תהליך זה נקרא ביטוי דיפרנציאלי. התפוקות מכונה לעתים קרובות גנים מבוטאים דיפרנציאליים (DEGs) וגנים אלה יכולים להיות מווסתים למעלה או למטה (כְּלוֹמַר, גבוה או נמוך יותר במצב הריבית). ישנם כלים רבים המבצעים ביטוי דיפרנציאלי. רובם מופעלים ב-R, Python או שורת הפקודה Unix. הכלים הנפוצים כוללים DESeq, [94] edgeR, [95] ו-voom+limma, [93] [100] שכולם זמינים דרך R/Bioconductor. [101] [102] אלה השיקולים הנפוצים בעת ביצוע ביטוי דיפרנציאלי:

  • תשומות: תשומות ביטוי דיפרנציאליות כוללות (1) מטריצת ביטוי RNA-Seq (M גנים x N דגימות) ו- (2) מטריצת עיצוב המכילה תנאי ניסוי לדגימות N. מטריצת העיצוב הפשוטה ביותר מכילה עמודה אחת, המתאימה לתוויות עבור המצב הנבדק. משתנים אחרים (המכונים גם גורמים, תכונות, תוויות או פרמטרים) יכולים לכלול השפעות אצווה, חפצים ידועים וכל מטא נתונים שעלולים לבלבל או לתווך ביטוי גנים. בנוסף למשתנים ידועים, ניתן להעריך משתנים לא ידועים גם באמצעות גישות למידת מכונה ללא פיקוח כולל ניתוחי רכיב עיקרי, משתנה פונדקאי, [103] ו-PEER [56]. ניתוח משתנים מוסתרים משמשים לעתים קרובות עבור נתוני RNA-Seq של רקמות אנושיות, אשר בדרך כלל יש להם חפצים נוספים שאינם נלכדים במטא נתונים (לְמָשָׁל, זמן איסכמי, מקורות ממספר מוסדות, תכונות קליניות בסיסיות, איסוף נתונים לאורך שנים רבות עם כוח אדם רב).
  • שיטות: רוב הכלים משתמשים ברגרסיה או סטטיסטיקה לא פרמטרית כדי לזהות גנים המובעים בצורה דיפרנציאלית, והם מבוססים על ספירות קריאה הממופות לגנום ייחוס (DESeq2, limma, edgeR) או מבוססים על ספירות קריאה הנגזרות מכימות ללא יישור (sleuth, [104) ] Cuffdiff, [105] Ballgown [106]). [107] לאחר רגרסיה, רוב הכלים משתמשים בשיעורי שגיאות משפחתיות (FWER) או בהתאמות שווי p (FDR) לפי ערך ההשערות (במחקרים על בני אדם,

20,000 גנים מקודדי חלבון או

ניתוחים במורד הזרם לרשימת גנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי מגיעים בשני טעמים, המאמתים תצפיות ומסיקים מסקנות ביולוגיות. בשל המלכודות של ביטוי דיפרנציאלי ו-RNA-Seq, תצפיות חשובות משוכפלות עם (1) שיטה אורתוגונלית באותן דגימות (כמו PCR בזמן אמת) או (2) ניסוי אחר, לפעמים רשום מראש, בקבוצה חדשה . זה עוזר להבטיח הכללה וניתן בדרך כלל לעקוב אחריו עם מטה-אנליזה של כל הקבוצות המחוברות. השיטה הנפוצה ביותר להשגת הבנה ביולוגית ברמה גבוהה יותר של התוצאות היא ניתוח העשרה של מערכי גנים, אם כי לפעמים משתמשים בגישות גנים מועמדות. העשרת מערכי גנים קובעת אם החפיפה בין שני מערכי גנים היא מובהקת סטטיסטית, במקרה זה החפיפה בין גנים המבוטאים בצורה דיפרנציאלית וקבוצות גנים ממסלולים/מאגרי מידע ידועים (לְמָשָׁל, Gene Ontology, KEGG, Human Phenotype Ontology) או מניתוחים משלימים באותם נתונים (כמו רשתות ביטוי משותף). כלים נפוצים להעשרת מערכי גנים כוללים ממשקי אינטרנט (לְמָשָׁל, ENRICHR, g:profiler, WEBGESTALT) [114] וחבילות תוכנה. בעת הערכת תוצאות העשרה, יוריסטיקה אחת היא לחפש תחילה העשרה של ביולוגיה ידועה כבדיקת שפיות ולאחר מכן להרחיב את הטווח כדי לחפש ביולוגיה חדשה.

חיבור חלופי ערוך

שחבור RNA הוא חלק בלתי נפרד מאיקריוטים ותורם באופן משמעותי לוויסות החלבונים ולגיוון, המתרחש ב & gt90% מהגנים האנושיים. [115] ישנם מספר מצבי שחבור אלטרנטיביים: דילוג אקסון (מצב השחבור הנפוץ ביותר בבני אדם ואיקריוטים גבוהים יותר), אקסונים בלעדיים זה לזה, אתרי תורמים או מקבילים חלופיים, שימור אינטרונים (מצב השחבור הנפוץ ביותר בצמחים, פטריות ופרוטוזואה), אתר התחלת תעתיק חלופי (מקדם), ופוליאדנילציה חלופית. [115] מטרה אחת של RNA-Seq היא לזהות אירועי שחבור חלופיים ולבדוק אם הם שונים בין התנאים. רצף קריאה ארוך לוכד את התמליל המלא ובכך ממזער בעיות רבות בהערכת שפע איזופורמים, כמו מיפוי קריאה מעורפל. עבור RNA-Seq לקריאה קצרה, ישנן מספר שיטות לאיתור שחבור חלופי שניתן לסווג לשלוש קבוצות עיקריות: [116] [89] [117]

  • מבוסס ספירה (גם מבוסס אירועים, שחבור דיפרנציאלי): אומדן שימור אקסון. דוגמאות הן DEXSeq, [118] MATS, [119] ו-SeqGSEA. [120]
  • מבוסס איזופורם (גם מודולים מרובי קריאה, ביטוי איזופורם דיפרנציאלי): הערכת שפע איזופורמים תחילה, ולאחר מכן שפע יחסי בין תנאים. דוגמאות לכך הן חפתים 2 [121] ו- DiffSplice. [122]
  • כריתת אינטררון מבוססת: לחשב שחבור חלופי באמצעות קריאות מפוצלות. דוגמאות לכך הן MAJIQ [123] ו- Leafcutter. [117]

ניתן להשתמש בכלי ביטוי גנים דיפרנציאליים גם לביטוי איזופורמים דיפרנציאליים אם מכמתים איזופורמים מבעוד מועד עם כלים אחרים כמו RSEM. [124]

רשתות קו ביטוי ערוך

רשתות ביטוי קואור-ביטוי הן ייצוגים הנגזרים מנתונים של גנים המתנהגים באופן דומה בין רקמות ותנאי ניסוי. [125] מטרתם העיקרית נעוצה ביצירת השערות ובגישות אשם על ידי אסוציאציה להסקת פונקציות של גנים שלא היו ידועים קודם לכן. [125] נתוני RNA-Seq שימשו להסקת גנים המעורבים במסלולים ספציפיים על בסיס מתאם פירסון, הן בצמחים [126] והן ביונקים. [127] היתרון העיקרי של נתוני RNA-Seq בניתוח מסוג זה על פני פלטפורמות המיקרו-מערך הוא היכולת לכסות את כל התמליל, ולכן מאפשרת אפשרות לפענח ייצוג שלם יותר של רשתות הרגולציה של הגן. ניתן לגלות ויסות דיפרנציאלי של איזופורמים של אותו הגן ולהשתמש בו כדי לחזות את תפקודיהם הביולוגיים. [128] [129] ניתוח רשת ביטוי שיתופי של גנים משוקללים שימש בהצלחה לזיהוי מודולים של ביטוי משותף וגנים של רכזת תוך-מודולרית המבוססים על נתוני seq RNA. מודולי ביטוי משותף עשויים להתאים לסוגי תאים או מסלולים. ניתן לפרש רכזות תוך מודולריות מחוברות כנציגות של המודול המתאים להם. גן עצמי הוא סכום משוקלל של ביטוי של כל הגנים במודול. Eigengenes הם סמנים ביולוגיים (תכונות) שימושיים לאבחון ולפרוגנוזה. [130] הוצעו גישות טרנספורמציה מייצבת שונות להערכת מקדמי מתאם המבוססים על נתוני RNA seq. [126]

גילוי וריאנטים ערוך

RNA-Seq לוכדת וריאציות DNA, כולל גרסאות נוקלאוטיד בודדות, הוספות/מחיקות קטנות. ושונות מבנית. שיחות וריאציות ב- RNA-Seq דומות לשיחות וריאציות DNA ולעתים קרובות משתמשות באותם כלים (כולל SAMtools mpileup [131] ו- GATK HaplotypeCaller [132]) עם התאמות בחשבון שחבורות. מימד ייחודי אחד עבור גרסאות RNA הוא ביטוי ספציפי לאל (ASE): הווריאנטים מהפלוטיפ אחד בלבד עשויים לבוא לידי ביטוי באופן עדיף בשל השפעות רגולטוריות הכוללות טביעות וביטויים כמותיים של ביטוי וגרסאות נדירות שאינן מקודדות. [133] [134] המגבלות של זיהוי וריאנטי RNA כוללות שהוא משקף רק אזורים מובעים (בבני אדם, <5% מהגנום), עלולים להיות כפופים להטיות המוכנסות על ידי עיבוד נתונים (למשל, מכלולי דה נובו תעתיקים ממעיטים בהטרוזיגוסיות [135] ), ויש לו איכות נמוכה יותר בהשוואה לרצף DNA ישיר.

עריכת RNA (שינויים לאחר תעתיק) עריכה

קיום הרצפים הגנומיים והטרנסקריפטומיים התואמים של אדם יכול לעזור בזיהוי עריכות פוסט-תעתיק (עריכת RNA). [3] אירוע שינוי שלאחר שעתוק מזוהה אם לתמלול הגן יש אלל/וריאנט שלא נצפה בנתונים הגנומיים.

עריכת זיהוי גנים של היתוך

כתוצאה משינויים מבניים שונים בגנום, גנים של היתוך צברו תשומת לב בגלל הקשר שלהם עם סרטן. [136] היכולת של RNA-Seq לנתח את כל התמלול של הדגימה בצורה משוחדת הופכת אותו לכלי אטרקטיבי למצוא אירועים נפוצים מסוג זה בסרטן. [4]

הרעיון נובע מתהליך יישור הקריאות הטרנסקריפטיות הקצרות לגנום הפניה. רוב הקריאות הקצרות יכללו בתוך אקסון שלם אחד, וסט צפוי אך גדול עדיין צפוי למפות לצמתים אקסון-אקסון ידועים. הקריאה הקצרה הנותרת שלא ממופה ינותחה לאחר מכן כדי לקבוע אם הן תואמות לצומת אקסון-אקסון שבו האקסונים מגיעים מגנים שונים. זו תהיה עדות לאירוע היתוך אפשרי, עם זאת, בגלל אורך הקריאה, זה יכול להוכיח להיות מאוד רועש. גישה חלופית היא להשתמש בקריאה בקצה זוגי, כאשר מספר פוטנציאלי גדול של קריאות זוגיות ימפה כל קצה לאקסון אחר, ויעניק כיסוי טוב יותר לאירועים אלו (ראה איור). אף על פי כן, התוצאה הסופית מורכבת משילובים מרובים שעלולים להיות חדשים של גנים המספקים נקודת התחלה אידיאלית לאימות נוסף.

RNA-Seq פותחה לראשונה באמצע שנות האלפיים עם הופעתה של טכנולוגיית רצף הדור הבא. [139] כתבי היד הראשונים שהשתמשו ב- RNA-Seq גם ללא שימוש במונח כוללים את אלה של שורות תאי סרטן הערמונית [140] (מתאריך 2006), Medicago truncatula [141] (2006), תירס [142] (2007), ו Arabidopsis thaliana [143] (2007), בעוד שהמונח "RNA-Seq" עצמו הוזכר לראשונה בשנת 2008. פורסם בשנת 2018. הצומת של RNA-Seq ורפואה (איור, קו זהב) הוא בעל אופי דומה. [145]

יישומים לרפואה עריכת

ל- RNA-Seq יש פוטנציאל לזהות ביולוגיה חדשה של מחלות, לפרופיל סמנים ביולוגיים לאינדיקציות קליניות, להסיק מסלולים לסמים ולבצע אבחונים גנטיים. תוצאות אלו יכולות להיות מותאמות אישית יותר עבור תת-קבוצות או אפילו מטופלים בודדים, מה שעשוי להדגיש מניעה, אבחון וטיפול יעילים יותר. היתכנותה של גישה זו מוכתבת בחלקה על ידי עלויות כסף וזמן מגבלה קשורה לכך היא צוות המומחים הנדרש (ביואינפורמטיקאים, רופאים/רופאים, חוקרים בסיסיים, טכנאים) לפרש באופן מלא את כמות הנתונים העצומה שנוצרה מניתוח זה. [146]

מאמצי רצף בקנה מידה גדול ערוך

דגש רב ניתן לנתוני RNA-Seq לאחר שפרויקטי האנציקלופדיה של אלמנטי ה-DNA (ENCODE) ו-The Cancer Genome Atlas (TCGA) השתמשו בגישה זו כדי לאפיין עשרות שורות תאים [147] ואלפי דגימות גידול ראשוני, [148] בהתאמה. ENCODE מטרתה לזהות אזורי רגולציה רחבי גנום בקבוצה שונה של שורות תאים ונתוני תעתיק הם חשיבות עליונה על מנת להבין את ההשפעה במורד הזרם של אותם שכבות רגולטוריות אפיגנטיות וגנטיות. TCGA, במקום זאת, נועד לאסוף ולנתח אלפי דגימות מטופל מ -30 סוגי גידולים שונים על מנת להבין את המנגנונים הבסיסיים של טרנספורמציה והתקדמות ממאירים. בהקשר זה נתוני RNA-Seq מספקים תמונת מצב ייחודית של המצב הטרנסקריפטומי של המחלה ומתבוננים באוכלוסייה בלתי משוחדת של תמלילים המאפשרת זיהוי של תמלילים חדשים, תמלילי היתוך ו- RNA שאינם מקודדים הניתנים לזיהוי בטכנולוגיות שונות.

מאמר זה הוגש ל- ויקי ז'ורנל למדע לביקורת עמיתים אקדמית חיצונית בשנת 2019 (דוחות סוקרים). התוכן המעודכן שולב מחדש בדף ויקיפדיה תחת רישיון CC-BY-SA-3.0 (2021). גרסת הרשומה כפי שנבדקה היא: פליקס ריכטר ואח '. (17 במאי 2021). "היכרות רחבה עם RNA-Seq". ויקי ז'ורנל למדע. 4 (2): 4. doi:10.15347/WJS/2021.004. ISSN 2470-6345. Wikidata Q100146647.


כרך א'

קרסטן קרלברג, בוויטמין D (מהדורה שלישית), 2011

ביטוי יחסי של VDR Target Genes

רמות ביטוי ה- mRNA במצב יציב של כמה גני מטרה VDR, כגון זו של CYP24A1 הגן, הם נמוכים מאוד בהיעדר ליגנד, אך הם נגרמים עד פי 1000 על ידי גירוי עם 1,25 (OH)2ד3 [36] . רוב 1,25 הראשונים הידועים אחרים (OH)2ד3 גנים מטרה, כגון CCNC ו CDKN1A, מראים לעתים קרובות כושר השראה של פי שניים או פחות לאחר טיפול קצר מועד עם 1,25(OH)2ד3 [132,133]. עם זאת, הגנים האחרונים מציגים פי 10 000–100 000 פי רמות ביטוי בסיסיות גבוהות בהשוואה לזו של CYP24A1 גֵן. לפיכך, כאשר לוקחים בחשבון את הרמות היחסיות, פי שניים עד עשרים CCNC ו CDKN1A מאשר CYP24A1 מולקולות mRNA מיוצרות לאחר אינדוקציה עם 1α,25(OH)2ד3.


מסקנות

השימוש ב-RNA-Seq חשף דפוס פירוק מורכב של mRNA עבור אופרונים רבים ב B. cereus, המראה שעיבוד RNA אכן מהווה מנגנון רגולטורי חשוב השולט ברמות ביטוי mRNA. מחקר זה מספק הוכחה לעיקרון שניתן להשתמש ב-RNA-Seq למחקרים רחבי גנום של ריקבון mRNA. אנו מצפים כי שיטה זו תועסק עוד יותר במחקרי ריקבון בעתיד הקרוב, אולי בשילוב עם תיוג קצה 5 'ו -3' או ניסויי רצף חיסונים של כרומטין (ChIP-Seq) שיקדמו גילוי של אתרי עיבוד RNase, או בשילוב עם מחקרי נוק-אאוט לחקר היבטים תפקודיים מפורטים של RNases שונים במגוון מיקרואורגניזמים.


מודל פשוט למסלול RNAi

מודל פשוט למסלול RNAi מבוסס על שני שלבים, שכל אחד מהם כרוך באנזים ריבונוקלאז. בשלב הראשון, ה- RNA ההדק (או תמליל ראשי של dsRNA או miRNA) מעובד ל- RNA קצר (siRNA) מפריע על ידי אנזימי RNase II Dicer ו- Drosha. בשלב השני, siRNAs מועמסים לתוך מתחם ההשתקה המורכב על ידי RNAC (RISC). ה-siRNA נפרק במהלך הרכבת RISC וה-RNA החד-גדילי משתלב עם יעד mRNA. השתקת גנים היא תוצאה של פירוק נוקלאוליטי של ה-mRNA הממוקד על ידי האנזים RNase H Argonaute (Slicer). אם הדופלקס siRNA/mRNA מכיל חוסר התאמה ה- mRNA אינו נבקע. במקום זאת, השתקת גנים היא תוצאה של עיכוב תרגום.


אפשרויות גישה

קבל גישה מלאה ליומן לשנה

כל המחירים הינם מחירי NET.
מע"מ יתווסף בהמשך הקופה.
חישוב המס יסתיים במהלך התשלום.

קבל גישה מוגבלת לזמן או מלא למאמרים ב- ReadCube.

כל המחירים הינם מחירי NET.


שאלות בחינה בביולוגיה מולקולרית | ביולוגיה

תשובות: השערה זו מסבירה את הדפוס הנצפה של ניוון בבסיס השלישי של קודון. לפי השערה זו הבסיס השלישי יכול לעבור עם הבסיס הראשון המקביל באנטיקודון. החשיבות של תנודה וניוון של הקוד הגנטי היא שהתא לא צריך לסנתז tRNA שונה עבור כל אחד מ-61 קודוני החושים. דוגמה פשוטה היא שרק שני אנטיקודונים שונים של tRNA נחוצים כדי לזהות ארבעה קודונים שונים של גליצין.

ש 2. מהו רצף Shine-Dalgarno? באילו קבוצות של מיקרואורגניזמים הוא נמצא?

תשובות: רצף ה- Shine-Dalgarno ממוקם לפני רצף ההתחלה של mRNA. רצף נוקלאוטיד זה מאפשר ל- mRNA ליישר קו עם יחידת המשנה הריבוזומלית 30S של התא החיידקי. זה בערך 7 בסיסים במעלה הזרם מוקדם יותר) לקראת קצה 5 ‘-P של קודון ההתחלה של AUG על ה-mRNA והוא רצף קונצנזוס פוליפוריני AGGAGG ומכונה רצף Shine-Dalgarno (איור 33.7). הוא נמצא בתאי חיידקים וארכאיים.

ש 3. מה המשמעות של הקודונים UGA, UAA ו- UAG בתרגום רגיל?

תשובות: בתרגום רגיל הם מתכוונים לקודונים “Stop ”.

ש.4. מדוע אומרים שהקוד הגנטי ניוון?

תשובות: הסיבה לכך היא שיותר מקודון אחד יכול לקודד את אותה חומצת אמינו.

ש 5. כמה קודוני סיום או קודוני שטות יש?

תשובות: ישנם רק שלושה קודוני סיום המכונים “ קודונים של שטויות ” מכיוון שהם אינם מקודדים לחומצת אמינו כלשהי.

ש.6. הקודון AGG מקודד בדרך כלל עבור argine אך בתרגום שונה הוא מקודד ל-stop. איפה זה מתרחש?

תשובות: זה מתרחש במיטוכונדריה אנושית.

ש 7. מה מוזר במחקרים שנעשו ב-DNA המיטוכונדריאלי (גנום DNA מעגלי דו-גדילי) כאשר מתקדמים מאיקריוטים נמוכים לגבוהים יותר?

תשובות: בעוד שמתקדמים מאיקריוטים נמוכים לגבוהים יותר, הדבר המוזר בגנום המיטוכונדריה הוא שהוא הולך וקטן, למשל, ה-DNA המיטוכונדריאלי של השמרים גדול פי חמישה מזה של המיטוכונדריה האנושית.

ש.8. מה אפשר ל-tRNA נתון שלפעמים הוא מזהה באופן ספציפי מספר קודונים?

תשובות: ההתנודדות בזוג הבסיס בקצה 5 ′ באנטי -קודון מאפשרת ל- tRNA הנתון לזהות מספר קודונים.

ש.9. כל החלבונים החיידקיים החדשים שסונתזו מתחילים (מתחילים) עם פורמילמתיונין (ניתן לתקצר כ-fmet). כיצד מסירים קבוצת פורמיל מהפוליפפטיד fmet בחיידקים?

תשובות: קבוצת הפורמיל מוסרת לעתים קרובות מפורמיל-מתיונין על ידי האנזים דפורמילאז ומשאיר אחריו את המתונין כחומצת האמינו הראשונה בשרשרת הפוליפפטיד.

ש.10. מה הם גנים? לְהַגדִיר.

תשובות: ניתן להגדיר גן כרצף של נוקלאוטידים המציין שרשרת פוליפפטיד מסוימת או רצף RNA או המווסת את הביטוי של גנים אחרים. הגנים המקודדים לחלבונים מכונים גנים מבניים או ציסטרונים ואילו הגנים האחרים הנושאים תפקוד רגולטורי נקראים גנים רגולטוריים. הגנים הרגולטוריים פועלים לשליטה בביטוי של גנים מבניים. הגנים המבניים והרגולטוריים מהווים ביחד את הגנוטיפ שקובע את הפנוטיפ, כלומר, מאפיינים מבניים ותפקודיים שניתנים לצפייה.

תשובות: רצף DNA אשר מקודד לגן מבני אחד או יותר (פוליפפטידים) של תפקוד קשור ורצף ה- DNA המסדיר את הביטוי.

ש 12. מה שולט באינדוקציה והדחקה?

תשובות: הגנים הרגולטוריים המייצרים חלבון וסת שולטת באינדוקציה (כלומר גורמת לעלייה בקצב הסינתזה של אנזים) והדחקה (כלומר חסימה של ביטוי גנים).

ש.13. מה זה לאק אופרון?

תשובות: אופרון lac מייצג אופרון לקטוז, אופרון המכיל גנים המציינים חלבונים המעורבים בניצול של (3 -גלקטוזידים כגון לקטוז. אופרון הלאק מתרחש ב- Escherichia coli בערך (= בערך) 8 דקות על מפת הכרומוזומים. זה בעל המבנה: מקדם-מפעיל lac Zr-lac Y-lac A. הגן lac Z מקודד P-galactosidase, lac Y מקודד (3-galactoside permease ו- lac A מקודד thiogalactoside transacetylase (איור 33.8).

ש 14. מהי דיכוי קטבוליטים?

תשובות: הדחקת הקטבוליטים היא הדחקה של שעתוק של גנים המקודדים למערכות אנזים מסוימות הניתנות להשראה על ידי גלוקוז או מקורות פחמן אחרים הניתנים לשימוש.

ש 15. מהם מווסתים חיוביים (מפעילים) ווסתים שליליים (מדכאים)? לְתַאֵר.

תשובות: לחיידקים יש אנזימים רבים שקצב הסינתזה שלהם תלוי בזמינות מולקולות מזון חיצוניות. מולקולות חיצוניות אלה הנקראות אינדוקציות ורודרסיות משותפות בדרך כלל קובעות את קצב הסינתזה של אנזימים על ידי שליטה בסינתזה של תבניות ה- mRNA שלהם. המשרדים והדכאים המשותפים פועלים על ידי קישור לחלבונים רגולטוריים המכונים מפעילים ומדכאים.

מפעילים הם רגולטורים חיוביים מכיוון שנוכחותם נדרשת לשם יצירת האנזים המווסת בעוד הדכאים פועלים כרגולטורים שליליים מכיוון שפעילותם הרגולטורית היא מניעת סינתזה של חלבונים. לפיכך, כאשר לקטוז חסר, מדכא ה-lac operon (לקטוז אופרון) מונע סינתזה של אנזימים המטבולים את הלקטוז. עם זאת, עם קשירת גורם מעורר (מולקולה הקשורה ללקטוז) המדכא מאבד את היכולת הזו ומאפשר ייצור של אנזימים. חלבון ארבינוז אופרון C שהוא מפעיל גורם לייצור אנזימי ארבינוז בקשירה לגורם המושרה ארבינוז.

ש.16. מהו רצף פלינדרום של DNA?

תשובות: ממש Palindrome היא מילה שקוראת את אותו הלוך ושוב. הרצף הפלינדרומי הוא אזור של חומצת גרעין המכיל זוג רצפים חוזרים הפוכים. במולקולת דו-גדילית של DNA אזור כזה מראה סימטריה סיבובית (דיאדית) כפולה או סימטריה דיאדית מהופנטת אם שני רצפי ה- IR מופרדים ברצף אחר. רצף פלינדרומי דו-גדילי יכול לאמץ אחת משתי תצורות אפשריות:

1. מבנה לינארי עם חיבור מימן בין גדילי, למשל,

2. מבנה צלב שבו משני גדילים יוצרים כל אחד סיכות שיער על ידי קישור מימן תוך גדילי.

ש.17. מי גילה שצילומי רנטגן מעוררים מוטציות?

תשובות: הרמן מולר ול.ג 'סטדלר גילו באופן עצמאי בשנת 1927 כי צילומי רנטגן מעוררים מוטציות.

תשובות: ציסטרון הוא גן כהגדרתו במונחים של מבחן CIS-TRANS, כלומר בתא דיפלואידי או במרוזיגוט אחד משני רצפים הומולוגיים בחומצת גרעין גנטית שבה שתי מוטציות בטרנס אינן מציגות השלמה מלאה. ניתן גם להגדיר ציסטרון כיחידה הפונקציונלית של תורשה גנטית קטע של חומצת גרעין גנטית המקודדת לשרשרת פוליפפטיד ספציפית. המונח ציסטרון שימש גם כמילה נרדפת לגן.

תשובות: את המונח רון טבע ס 'בנצר. לדבריו מדובר ביחידה של תת-חלוקה גנטית שמעבר לה לא מתרחש רקומבינציה.

ש 20. הגדירו גן מוטטור או מוטטור.

תשובות: גן מוטציה או מוטציה מיועדים כחובה שבתוכה מוטציות מסוימות גורמות לעלייה בשיעור המוטציה הספונטנית בגנים אחרים, למשל, מוטציות של Escherichia coli בגן המקודד ליחידת ה- e של DNA polymerase III (dna Q ו- mut D אללים) יכולות לגרום לרמות גבוהות במיוחד של מוטציות ספונטניות. האללים המוטנטים עשויים להיות שונים מהסוג הפראי, למשל, רק בשינוי חומצה אמינית אחת או שתיים ביחידת המשנה ε. המוטציה עלולה להוביל לדיוק מופחת בפעילות הפולימריזציה (בחירת נוקלאוטידים) או בפעילות קריאת ההגהה של האנזים. כמה גנים אחרים של מוטציה ב- E.Coli כוללים במערכת תיקון חוסר ההתאמה.

ש.21. מהם גנים מפוצלים? לְתַאֵר.

תשובות: ניתן להגדיר את הגנים המפוצלים כגנים שמקודדים להם, לפי מקטעים לא רציפים של ה- DNA כך שה- mRNA וה- DNA של תוצר החלבון של הגן הזה אינם קולינאריים. אלו הם הגנים עם רצפי נוקלאוטידים מתערבים שאינם מעורבים בקידוד של תוצר הגן.

הגנים המפוצלים נחשבו גם כגנים מופרעים. גן מבני המקודד לחלבון, rRNA או tRNA המכילים רצף מתערב אחד יותר מדי (אינטרונים) שלמרות שהם מיוצגים בתמלול RNA ראשוני של הגן נעדרים ממולקולת ה-RNA הבשלה (mRNA, tRNA), לפיכך, אינם תורמים ל- מבנה המוצר הגנטי.

לפיכך מוטציה בתעתיק ה-RNA של גן מפוצל חייבת לכלול תהליך של שחבור כדי למחוק את האינטרון ולחבר יחד את הרצפים הנותרים הנקראים אקסונים. במקרה של mRNA רצף האקסונים כולל את רצף הקידוד של הגן, כמו גם רצפי מנהיגים ו/ או טריילור לא מקודדים. האינטרונים עצמם בדרך כלל אינם מקודדים. רוב הגנים המבניים הגרעיניים באיקריוטים גבוהים יותר הם גנים מפוצלים.

ש.22. מהם גנים חופפים?

תשובות: הגנים החופפים הם שני גנים או יותר שבהם חלק או גן שלם משתלבים יחד עם חלק אחר. הגנים עשויים להיות מתורגמים במסגרות קריאה שונות או באותה מסגרת קריאה עם נקודות התחלה ו/או עצירה שונות או דפוסי שחבור שונים. תופעת הגנים החופפים ממקסמת את יכולת הקידוד של הגנום ויכולה גם לספק אמצעי לוויסות ביטוי הגנים.

ש.23. ההיסטוריה של עולם ה- DNA כתובה ברצפי גנים. נמק את האמירה הזו.

תשובות: התפתחות האורגניזמים מאב קדמון משותף מיוצגת על ידי מסלול מסועף המכונה עץ גיאולוגי (ידוע גם כעץ פילוגנטי או אבולוציוני). תבנית ההסתעפות של העץ מחושבת באמצעות עקרון החסכנות (על בסיס כלכלה) כדי לקבוע את המספר המינימלי של שינויים גנטיים הנדרשים כדי להפיק את רצף הגן בכל אורגניזם מאב קדמון משותף. לפעמים סביר להניח שחלבון שמור מאוד כמו גלובין וציטוכורם c יכול לשמש כשעון מולקולרי למדידת משך הזמן שהמינים מתרחקים זה מזה.


עיבוד RNA: pre-mRNA & rarr mRNA

כל התמלילים העיקריים המיוצרים בגרעין חייבים לעבור שלבי עיבוד כדי לייצר מולקולות RNA פונקציונליות לייצוא לציטוזול. נסתפק במבט של השלבים כפי שהם מתרחשים בעיבוד של קדם-mRNA ל-mRNA.

רוב הגנים האוקריוטיים מפוצלים למקטעים. בפענוח מסגרת הקריאה הפתוחה של גן לחלבון מוכר, בדרך כלל נתקלים ברצועות DNA תקופתיות הקוראות לחומצות אמינו שאינן מופיעות במוצר החלבון בפועל של אותו הגן. רצועות DNA כאלה, שמתעתקות ל-RNA אך אינן מתורגמות לחלבון, נקראות אינטרונים. רצועות ה-DNA האלה שמקודדות לחומצות אמינו בחלבון נקראות אקסונים. דוגמאות:

  • הגן לסוג אחד של קולגן שנמצא בתרנגולות מחולק ל-52 אקסונים נפרדים.
  • הגן עבור דיסטרופין, שעבר מוטציה אצל בנים עם ניוון שרירים, יש 79 אקסונים.
  • אפילו הגנים של rRNA ו- tRNA מפוצלים על ידי אינטרונים.
  • הגנום האנושי מכיל כ -180,000 אקסונים. עם הערכה נוכחית של 21,000 גנים, תכולת האקסונים הממוצעת של הגנים שלנו היא בערך 9.
  • סינתזה של כובע. זהו גואנין שונה (G) המחובר לקצה 5 & ראש של ה- pre-mRNA כפי שהוא יוצא מ- RNA פולימראז II (Pol II). הכובע
  • מגן על ה- RNA מפני התפרקות על ידי אנזימים המפרקים את ה- RNA מהקצה 5 & prime
  • משמש כנקודת כינוס של החלבונים הדרושים לגיוס תת-היחידה הקטנה של הריבוזום כדי להתחיל בתרגום.
  • הסרה שלב אחר שלב של אינטרונים קיים ב- mRNA טרום וחבורת הנותרים אקסונים. שלב זה מתרחש כאשר ה- pre-mRNA ממשיך לצאת מפול II.
  • סינתזה של זנב פולי (A). זוהי קטע של נוקלאוטידים אדנין (A). כאשר אתר התקשרות מיוחד של poly(A) בפרה-mRNA יוצא מ-Pol II, התמליל נחתך שם, והזנב של poly(A) מחובר לקצה ה-3&prime החשוף. זה משלים את מולקולת ה-mRNA, שמוכנה כעת לייצוא לציטוזול. (שארית התמליל מתפוררת, וה-RNA פולימראז עוזב את ה-DNA.)

התמונה לעיל היא מיקרוגרף אלקטרונים של מולקולה היברידית mRNA-DNA שנוצרה על ידי ערבוב ה- RNA שליח (mRNA) משבט של תאים המפרישים נוגדנים עם DNA חד גדילי מאותו סוג של תאים. הפס מייצג את האורך של 1000 בסיסים. התרשים התחתון הוא פרשנות של המיקרוגרף. הקו המוצק מייצג את ה-DNA הקו המקווקו את ה-mRNA. הלולאות (I א, אני בוכו') מייצגים את האינטרונים שמפרידים בין האקסונים המקודדים לתחומים של שרשרת כבדה של נוגדנים:

  • V = אזור משתנה
  • ה1 = אזור קבוע ראשון (Cח1) דומיין
  • הח = אזור צירים
  • ה2 ו- E.3 = הנוקלאוטידים המקודדים את שני התחומים מסוף C (Cח2 ו- C.ח3)

החלק הבלתי מעוכב של ה- mRNA הוא זנבו הפולי (A).

שחבור חלופי

העיבוד של קדם-mRNA עבור חלבונים רבים ממשיך בדרכים שונות בתאים שונים או בתנאים שונים. לדוגמה, בתחילת ההתמיינות של תא B (לימפוציט שמסנתז נוגדן) התא משתמש תחילה באקסון המקודד לתחום טרנסממברני שגורם למולקולה להישמר על פני התא. מאוחר יותר, תא B עובר לשימוש באקסון אחר שהתחום שלו מאפשר להפריש מהחלבון מהתא כמולקולת נוגדנים במחזור.

שחבור אלטרנטיבי מספק מנגנון לייצור מגוון רחב של חלבונים ממספר קטן של גנים. בעוד שאנו בני האדם עשויים להתברר שיש לנו רק כ-20 אלף גנים, אנו כנראה מייצרים לפחות פי 10 ממספר חלבונים שונים. כעת ההערכה היא כי 92 & ndash94% מהגנים שלנו מייצרים טרום mRNA שחולקים לחילופין. ישנן עדויות לכך שדפוס השחבור החלופי שונה באופן עקבי ברקמות שונות ולכן יש להסדיר אותו. אבל אם כל המוצרים פונקציונליים או שרבים הם פשוט תוצאה של תהליך מועד לשגיאות נותר לראות.

שחבור חלופי לא רק מספק חלבונים שונים מגן יחיד אלא גם 3 'UTRs ו- 5' UTRs שונים. למרות שאינם מתורגמים לחלבון, אלה uנטמתורגמים rאגיוןס מכילים אותות שמכתיבים, למשל, היכן בתא החלבון הזה יצטבר. שתי דוגמאות:

  • ה- 3 'UTR של ה- bicoid הגן בדרוזופילה מכוון את ה- mRNA לקדמת העובר
  • אותו אזור ב VegT הגן של קסנופוס מכוון את ה-mRNA שלו אל הקוטב הצמחי של העובר

אחת הדוגמאות הדרמטיות ביותר של שחבור חלופי היא Dscam גן פנימה תסיסנית. הגן היחיד הזה מכיל כ- 116 אקסונים מתוכם 17 נשמרים ב- mRNA הסופי. כמה אקסונים כלולים תמיד אחרים נבחרים מתוך מערך. תיאורטית מערכת זו מסוגלת לייצר 38,016 חלבונים שונים. ולמעשה, למעלה מ-18,000 שונים נמצאו ב-Drosophila hemolymph.

חלבוני Dscam אלו משמשים לביסוס זהות ייחודית לכל נוירון. זה עובד ככה. כל נוירון מתפתח מסנתז תריסר דסקאם mRNAs מתוך אלפי האפשרויות. אלו שנבחרו נראים כפשוט עניין של סיכוי, אך בגלל ריבוי האפשרויות, סביר להניח שכל נוירון יסתיים במערך ייחודי של תריסר חלבוני Dscam בערך. כאשר כל נוירון מתפתח במערכת העצבים המרכזית מנבט דנדריטים ואקסון, אלה מבטאים את האוסף הייחודי שלו של חלבוני Dscam. אם השלוחות השונות של נוירון בודד צריכות לפגוש זו את זו ברשת הסבוכה שהיא סימן ההיכר של רקמת עצבים, הן נדחות. בדרך זו, אלפי נוירונים שונים יכולים להתקיים במגע אינטימי ללא סכנה של מגע לא פונקציונלי בין שלוחותיו השונות של אותו נוירון.

הנוירון צריך להיתקל אחד בשני, הם נמנעים מקיום סינפסה על ידי הדחייה המתווכת על ידי אוסף הפרוטוקאדרינים הזהה שלהם. בדרך זו, אלפי נוירונים שונים יכולים להתקיים בדו -קיום במגע אינטימי ללא סכנה של מגעים לא מתפקדים בין ההרחבות השונות של אותו נוירון.

האם קטע מסוים של RNA יישמר כאקסון או ייכרת כאינטרון יכול להשתנות בנסיבות שונות, כגון

  • באיזה תא נמצא הגן
  • באיזה שלב של התמיינות אותו תא עובר
  • אילו אותות חוץ -תאיים התא מקבל.

ברור שהמעבר למסלול שחבור חלופי חייב להיות מוסדר מקרוב.

טרנס-חבור

רוב הגנים מתומללים והתמלילים שלהם מעובדים כמתואר לעיל. RNA פולימראז עובר לאורך גדיל יחיד של מוקד גנים בודד ליצירת טרום mRNA המעובד (כולל הסרת אינטרונים) ליצירת ה- mRNA הבוגר. אבל יש יוצאים מן הכלל. נמצאו מספר מקרים בהם שני תמלילי מבשר שונים נפרדו יחדיו ליצירת מולקולת ה- RNA הסופית. התופעה נקראת עָבָר-חיתוך.

דוגמאות: סינתזה של מולקולת RNA יחידה על ידי שחבור תמלילים של לוקוסים

  • ממוקם רחוק זה מזה באותו כרומוזום או
  • על גדילים מנוגדים של אותו לוקוס גן או
  • שהם שני האללים של הגן על הכרומוזומים הנפרדים (ההומולוגיים) שלהם.

החשיבות הביולוגית של אלה עָבָר-תמלילי רישום עדיין לא ידועים עבור רובם.


צפו בסרטון: Gene Expression 3: Using RNA sequencing to analyze gene expression (נוֹבֶמבֶּר 2022).