מֵידָע

11.4 ד: קולטנים דמויי אגרה - ביולוגיה

11.4 ד: קולטנים דמויי אגרה - ביולוגיה


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

מטרות למידה

  • לסכם קולטנים דמויי אגרה

קולטנים דמויי אגרה (TLR) הם סוג של חלבונים הממלאים תפקיד מרכזי במערכת החיסון המולדת כמו גם במערכת העיכול. הם קולטנים בודדים, המקיפים את הממברנה, שאינם קטליטיים, המזהים מולקולות שמורות מבחינה מבנית שמקורן בחיידקים. לאחר שחיידקים אלה פרצו מחסומים פיזיים כגון העור או רירית דרכי המעי, הם מוכרים על ידי TLR, המפעילים תגובות של תאים חיסוניים.

TLRs הם סוג של קולטן לזיהוי תבניות (PRR) ומזהים מולקולות המשותפות באופן נרחב על ידי פתוגנים אך ניתן להבדיל ממולקולות מארח, המכונה ביחד דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגניים (PAMPs). TLRs יחד עם הקולטנים אינטרלוקין -1 יוצרים משפחה של קולטן, המכונה "משפחת קולטן אינטרלוקין -1/קולטן דמוי אגרה"; לכל בני המשפחה הזו יש תחום שנקרא TIR (קולטן Toll-IL-1).

בגלל הספציפיות של קולטנים דמויי Toll (וקולטנים חיסוניים מולדים אחרים) לא ניתן לשנות אותם בקלות במהלך האבולוציה, קולטנים אלה מזהים מולקולות הקשורות כל הזמן לאיומים (כלומר, פתוגן או מתח תאים) והם ספציפיים מאוד ל איומים אלו (כלומר, לא ניתן לטעות בהם מולקולות עצמיות). מולקולות הקשורות לפתוגן העונות על דרישה זו הן בדרך כלל קריטיות לתפקוד הפתוגן ואינן ניתנות לביטול או שינוי באמצעות מוטציה; אומרים שהם נשמרים אבולוציונית. תכונות שמורות היטב בפתוגנים כוללות ליפופוליסכרידים (LPS), משטח תא חיידקי, ליפופרוטאינים, ליפופפטידים וליפוארבינומנאן; חלבונים כגון flagellin מ flagella חיידקי; RNA דו-גדילי של וירוסים; או איי CpG ללא מתיל של DNA חיידקי ווירלי; ועוד RNA ו-DNA מסוימים. עבור רוב ה- TLR, נקבעה כעת ספציפיות לזיהוי ליגנד על ידי מיקוד גנים (המכונה גם "נוקאאוט גנים"): טכניקה שבה ניתן למחוק גנים בודדים בעכברים. ראה את הטבלה שלהלן לסיכום של ליגנד TLR ידוע.

מאמינים כי TLRs מתפקדים כדימרים. למרות שנראה שרוב ה- TLR מתפקדים כהומודימרים, TLR2 יוצר הטרודימרים עם TLR1 או TLR6, לכל דימר יש סגוליות ליגנד שונה. TLRs עשויים להיות תלויים גם בקולטנים משותפים אחרים לרגישות מלאה של הליגנד, כגון במקרה של זיהוי TLR4 ב- LPS, הדורש MD-2. ידוע כי CD14 וחלבון מחייב LPS (LBP) מקל על הצגת LPS ל- MD-2.

גם חלבוני המתאם והקינאזות המתווכים איתות TLR היו ממוקדים. בנוסף, נעשה שימוש במוטגנזה אקראית של קו חיידקים עם ENU לפענוח מסלולי האיתות של TLR. כאשר הם מופעלים, TLRs מגייסים מולקולות מתאם בתוך הציטופלזמה של תאים על מנת להפיץ אות. ידוע כי ארבע מולקולות מתאם מעורבות באיתות. חלבונים אלה ידועים בשם MyD88, טיראפ (נקראים גם מאל), טריף וחשמלית.

איתות TLR מחולק לשני מסלולי איתות נפרדים, המסלול התלוי ב-MyD88 והתלוי ב-TRIF. התגובה התלויה ב- MyD88 מתרחשת בדימריזציה של קולטן ה- TLR, והיא מנוצלת על ידי כל TLR למעט TLR3. ההשפעה העיקרית שלו היא הפעלה של NFκB. קישור ליגנד ושינוי קונפורמציה המתרחש בקולטן מגייס את חלבון המתאם MyD88, חבר במשפחת ה-TIR. לאחר מכן MyD88 מגייסת את IRAK 4, IRAK1 ו- IRAK2. לאחר מכן IRAK קינאז מזרחנים ומפעילים את החלבון TRAF6, אשר בתורו יוצר את החלבון TAK1, כמו גם את עצמו על מנת להקל על הקישור ל-IKKβ. עם הקישור, TAK1 מזרחן את IKKβ, אשר לאחר מכן מזרחן את IκB מה שגורם לפירוקו ומאפשר ל-NFκB להתפזר לתוך גרעין התא ולהפעיל שעתוק.

גם TRL3 וגם TRL4 מנצלים את המסלול התלוי ב-TRIF, המופעל על ידי dsRNA ו-LPS, בהתאמה. עבור TRL3, dsRNA מוביל להפעלה של הקולטן, גיוס המתאם TRIF. TRIF מפעיל את הקינאזות TBK1 ו- RIP1, היוצר סניף במסלול האיתות. מתחם האיתות TRIF/TBK1 מזריב את ה- IRF3 ומאפשר טרנסלוקציה שלו לגרעין וייצור אינטרפרונים מסוג I. בינתיים, הפעלה של RIP1 גורמת לפוליוביקווינציה ולהפעלה של שעתוק TAK1 ו- NFκB באותו אופן כמו המסלול תלוי MyD88.

איתות TLR מוביל בסופו של דבר לאינדוקציה או דיכוי של גנים המנצחים את התגובה הדלקתית. בסך הכל, אלפי גנים מופעלים על ידי איתות TLR, ובקולקציה, ה- TLR מהווים אחד השערים הפליטוטרופיים אך המווסתים היטב לאפנון גנים.

קולטנים דמויי אגרה נקשרים והופעלים על ידי ליגנדים שונים, אשר, בתורם, ממוקמים על סוגים שונים של אורגניזמים או מבנים. יש להם גם מתאמים שונים להגיב להפעלה והם ממוקמים לפעמים על פני התא ולפעמים לתאי התא הפנימיים.

נקודות מפתח

  • TLRs הם סוג של קולטן לזיהוי תבניות (PRR).
  • TLRs מזהים מולקולות המשותפות באופן נרחב על ידי פתוגנים אך ניתן להבדיל ממולקולות מארח, המכונה ביחד דפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגניים (PAMPs).
  • איתות TLR מחולק לשני מסלולי איתות מובחנים, מסלול MyD88 ותלוי TRIF.

מושגי מפתח

  • קולטן דמוי אגרה: קולטנים דמויי אגרה (TLR) הם סוג של חלבונים הממלאים תפקיד מפתח במערכת החיסון המולדת כמו גם במערכת העיכול. הם קולטנים בודדים, המקיפים את הממברנה, שאינם קטליטיים, המזהים מולקולות שמורות מבחינה מבנית שמקורן בחיידקים.
  • מערכת חיסונית מולדת: זהו קו ההגנה הראשוני הכרוך במפל של תאים ומנגנונים המגנים על המארח מפני זיהום על ידי אורגניזמים שונים בדפוס בלתי מוגדר.
  • מסלול איתות: מסלולי איתות מתרחשים כאשר מולקולת איתות חוץ -תאית מפעילה קולטן של פני התא. בתורו, קולטן זה משנה מולקולות תאיים ויוצרות תגובה. ישנם שני שלבים בתהליך זה: מולקולת איתות מפעילה חלבון קולטן ספציפי על קרום התא. שליח שני מעביר את האות לתא ומעורר תגובה פיזיולוגית. בכל אחד מהשלבים ניתן להגביר את האות. לפיכך, מולקולת איתות אחת יכולה לגרום לתגובות רבות.

11.4D: קולטנים דמויי אגרה - ביולוגיה

קולטן דמוי אגרה 4 הוא חלבון שבבני אדם מקודד על ידי TLR4 גֵן. TLR4 הוא חלבון טרנסממברני, חבר במשפחת הקולטנים דמויי אגרה, השייך למשפחת קולטני זיהוי הדפוס (PRR). הפעלתו מובילה למסלול איתות תאיים NF-andB וייצור ציטוקינים דלקתיים אשר אחראי על הפעלת המערכת החיסונית המולדת. [4]

תאים המבטאים TRL4 הם מיאלואידים (אריתרוציטים, גרנולוציטים, מקרופאגים) ולא לימפואידים (תאי T, תאי B, תאי NK). [4] רוב התאים המיאלואידים מבטאים גם רמות גבוהות של CD14, מה שמקל על הפעלת TLR4 על ידי LPS. [5]

הוא ידוע בעיקר בזכות זיהוי ליפופוליסכריד (LPS), מרכיב הקיים בחיידקים גראם שליליים רבים (למשל. נייסריה spp.) וחיידקים חיוביים גראם נבחרים. הליגנדים שלו כוללים גם מספר חלבונים ויראליים, פוליסכריד ומגוון חלבונים אנדוגניים כגון ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה, בטא-דפנסינים וחלבון הלם חום. [6] חומצה פלמיטית היא גם אגוניסט TLR4. [7]

TLR4 הוגדר גם בשם CD284 (מקבץ בידול 284). המשקל המולקולרי של TLR4 הוא כ- 95 kDa.


אפשרויות גישה

קבל גישה מלאה ליומן לשנה

כל המחירים הינם מחירי NET.
מע"מ יתווסף בהמשך הקופה.
חישוב המס יסתיים במהלך התשלום.

קבל גישה מוגבלת לזמן או מלא למאמרים ב- ReadCube.

כל המחירים הינם מחירי NET.


איתות קולטן דמוי אגרה מונע שכפול של וירוס הפטיטיס B ב- Vivo

תאנה. 1. ליגנדים קולטן דמויי אגרה מעכבים שכפול HBV in vivo. שושלת תואמי HBeAg בגיל, מין וסרום 1.3.32 עכברים מהונדסים HBV הוזרקו תוך ורידי עם 20 מיקרוגרם (לא מוצג) ו -100 מיקרוגרם של TLR2/6 (פפטידוגליקן [PGN] מ סטפילוקוקוס אאוראוס InvivoGen), ליגנד TLR2/1 נ-α-palmitoyl-ס-[2,3-bis (palmitoyloxy)-(2RS) -propyl]-l -cysteine ​​(Pam3Cys InvivoGen), 10 מיקרוגרם של TLR3 [polyinosinic-poly (I · C) P (I: C) Sigma]) TLR4 ( LPS מ אי קולי 011:B4 זן InvivoGen), TLR5 (Flagellin מ-salmonella muenchen Calbiochem), TLR7 (R848) (InvivoGen), או TLR9 (ODN 1826 CpG oligonucleotide [CpG] InvivoGen) והוקרב 24 שעות מאוחר יותר. שושלת 1.3.32 עכברים משכפלים HBV ברמות גבוהות בכבד ללא כל עדות לציטופתולוגיה (9). (א) ה-DNA הכבד הכולל בודד מרקמות כבד קפואות ונותח עבור HBV DNA על ידי ניתוח סאות'ן כתם כפי שתואר קודם לכן (9). רצועות המתאימות לטרנסגן המשולב (Tg), גדילי מעגלי כפול רגוע (RC) וצורות משכפלות DNA HBV חד גדיליות (SS) מסומנות. ניתן להשתמש בטרנסגן המשולב כדי לנרמל את כמות ה-DNA הקשור לממברנה. הפעילות הממוצעת של ALT בסרום, הנמדדת בזמן הנתיחה, מסומנת לכל קבוצה ומתבטאת ביחידות/ליטר. (ב) סך ה- RNA הכבד גם היה מבודד מאותם עכברים ונותח על ידי מבחן הגנה RNase לביטוי ציטוקינים שונים כפי שתואר לעיל (8). ה- RNA המקודד לחלבון הריבוזומלי L32 שימש לנרמל את כמות ה- RNA הטעונה בכל נתיב. תאנה. 2 . ההשפעה האנטי-ויראלית של TLR מתווכת על ידי IFN-α/β. עכברים מהונדסים תואמים לגיל, מין וסרום (שושלת 1.3.46) שהיו הומוזיגוטים (-/-) למוטציית האפס של קולטן IFN-α/β (21, 22) הוזרקו 20 מיקרוגרם של TLRs כמו צוינו והוקרבו 24 שעות מאוחר יותר, והכבדים שלהם נותחו עבור שכפול HBV. עכברים מהונדסים בהתאמה לגיל, HBeAg ומין משושלת 1.3.46 שהיו הטרוזיגוטיים (+/−) למוטציה של null קולטן IFN-α/β או [במקרה של פולי (I · C) ו flagellin] משושלת פרא 1.3.32 טופלו בדיוק כמו לבקרות. ניתן להשתמש בטרנסגן המשולב (Tg) כדי לנרמל את כמות ה- DNA הקשור לקרום. P(I:C), poly(I · C). תאנה. 3. הפטוציטים מבודדים טריים אינם מבטאים TLR. הפטוציטים ראשוניים ולימפוציטים תוך-כבדיים בודדו מעכברים טרנסגניים מסוג HBV כפי שתואר קודם לכן (16, 25) ונצבעו בנוגדנים ספציפיים ל-TLR2, -3 ו-9 (eBioscience) בשילוב עם אנטי-CD11c (BD Pharmingen). מכתים על פני השטח בוצעו לאיתור ביטוי TLR2, בעוד מכתים תאיים הוחל על ביטויי TLR3 ו- -9 (18). תאים נרכשו באמצעות ציטומטר זרימת FACSCalibur (Becton Dickinson), ונתחים נותחו באמצעות תוכנת CELLQuest (Becton Dickinson). היסטוגרמות מייצגות מכתים TLR (אפור) או מכתים של בקרת איזוטיפים (לבן) של הפטוציטים (לוח שמאל). ביטוי TLR מקביל על תאי CD11c+ של לימפוציטים תוך-כבדיים הוצגו כבקרות חיוביות (פאנל ימין).

תַקצִיר

קולטנים דמויי אגרה (TLR) הם משפחה של קולטני זיהוי תבניות, הממלאים תפקיד מרכזי בזיהוי הפתוגנים ובעיצוב התגובה החיסונית המולדת. בעוד שרוב המחקרים על תפקידם של TLRs התמקדו באוכלוסיות תאי חיסון בוגרות, דיווחים אחרונים מראים כי איתות TLR עשוי לווסת את התגובה החיסונית מרמת תא הגזע ההמטופואטי (HSC). במחקר זה, ביקשנו להבהיר עוד יותר את ההשפעות של חשיפה מערכתית של ליגנד TLR על HSCs ולקבוע את ההשפעות התא-מהותיות לעומת חיצוניות של חשיפה כזו. התמקדנו במיוחד באיתות TLR2, למרות שלמרות ש- TLR2 מתבטא ב- HSC, תפקידו בתקנה שלהם אינו ברור. יתר על כן, איתות TLR2 משופר קשור לתסמונת מיאלודיספלסטית (Wei et al, לוקמיה 2013), מה שמרמז כי לאיתות חריגה באמצעות קולטן זה עשויות להיות השפעות קליניות משמעותיות על תפקוד HSC.

כדי להבהיר את תפקידו של איתות TLR2 בוויסות HSCs, השתמשנו בעכברים עם אובדן גנטי של TLR2, כמו גם באגוניסט סינתטי של TLR2 (PAM3CSK4) כדי לקבוע את ההשפעות של אובדן או רווח איתות TLR2, בהתאמה, על רכיבה על אופניים, גיוס ותפקוד HSC. בעוד שביטוי TLR2 אינו נדרש לתפקוד תקין של HSC, טיפול בעכברים מסוג פרא עם PAM3CSK4 מוביל להתרחבות של HSCs במח העצם ובטחול, עלייה במחזוריות HSC, ואובדן תפקוד HSC בניסויים תחרותיים בהשתלת מח עצם. מכיוון ש-TLR2 מתבטא במגוון סוגי תאים סטרומליים והמטופואטיים, השתמשנו בכימירות של מח עצם (Tlr2 -/- + טלר 2 מוח+/+ מושתל לתוך טלר 2 +/+ נמענים) כדי לקבוע אם ההשפעות של PAM3CSK4 הטיפול הוא תא פנימי או חיצוני. הנתונים מראים כי HSC רכיבה על אופניים והתרחבות במח ובטחול עם PAM3CSK4 הטיפול הוא חיצוני (מתרחש בשתי אוכלוסיות HSC המושתלות), וקשורים לרמות מוגברות של G-CSF בסרום. אכן, עיכוב של G-CSF באמצעות נוגדן מנטרל או עכברים חסרי הקולטן G-CSF (Csf3r -/- ) מוביל להרחבת מח העצם HSC עוד יותר לאחר טיפול ב- G-CSF אך הפחתה משמעותית במספר ה- HSC הטחול בהשוואה לעכברים מסוג טיפולי בר שטופלו באופן דומה. זה מצביע על התגייסות בתגובה לאיתות TLR2 היא תהליך עקיף, בתיווך G-CSF. מחקרים שוטפים מכוונים לקביעת התרומה של G-CSF ל- PAM3CSK4- אובדן תפקוד HSC, וקביעת המקור (סטרומה לעומת המטופויטית) לייצור G-CSF באמצעות PAM3CSK4 חשיפה. ביחד, נתונים אלה מצביעים על כך שאיתות TLR2 משפיעה על HSCs בצורה חיצונית במידה רבה, כאשר G-CSF משחק תפקיד מרכזי בוויסות ההשפעות של חשיפת ליגנד TLR2 על HSCs.


ציטוט (דוח חיפוש)

  • [XD] TAKADA E ET AL: "C-terminal LRRs of human Toll-like receptor 3 שולט על דימריזציה של קולטן והעברת אותות", MOLECULAR IMMUNOLOGY, PERGAMON, GB, vol. 44, לא. 15, 1 ביולי 2007 (2007-07-01), עמודים 3633-3640, XP025320882, ISSN: 0161-5890, [אחזר ב- 20070530], DOI: 10.1016/J.MOLIMM.2007.04.021
  • [AD] EUNJEONG YANG ET AL: "שיבוט איזופורם TLR3.", YONSEI MEDICAL JOURNAL, כרך. 45, לא. 2, 1 באפריל 2004 (2004-04-01), עמודים 359-361, XP055022273, ISSN: 0513-5796
  • [I] RANJITH-KUMAR C T ET AL: "ניתוחים ביוכימיים ופונקציונליים של הקולטן האנושי דמוי האגרה 3 ectodomain", כתב העת לכימיה ביולוגית 20070302 חברה אמריקאית לביוכימיה ומוולוגיה ביולוגית מולקולרית, ארה"ב, כרך. 282, לא. 10, 2 במרץ 2007 (2007-03-02), עמודים 7668-7678, XP007914953
  • ראה גם הפניות של WO 2010040054A2

הפניות

Medzhitov, R. & Janeway, C. J. חסינות מולדת: סגולותיה של מערכת הכרה לא שיבוטית. תָא 91, 295–298 (1997).

Takeda, K., Kaisho, T. & Akira, S. קולטנים דמויי אגרה. Annu. כומר אימונול. 21, 335–376 (2003).

Alexopoulou, L., Holt, A.C., Medzhitov, R. & amp Flavell, R.A. הכרה ב- RNA דו-גדילי והפעלה של NF-κB על ידי קולטן דמוי אגרה 3. טֶבַע 413, 732–738 (2001).

Diebold, S.S. ואח '. תגובות אנטי-ויראליות מולדות באמצעות זיהוי בתיווך TLR7 של RNA חד-גדילי. מַדָע 303, 1529–1531 (2004).

Hayashi, F. et al. התגובה החיסונית המולדת לפגללין חיידקי מתווכת על ידי קולטן דמוי אגרה 5. טֶבַע 410, 1099–1103 (2001).

הייל, פ. ועוד. זיהוי ספציפי למינים של RNA חד-גדילי באמצעות קולטן 7 ו -8 דמוי אגרה. מַדָע 303, 1526–1529 (2004).

חמי, ח 'ואח'. תרכובות אנטי ויראליות קטנות מפעילות תאי חיסון באמצעות מסלול האיתות תלוי TLR7 MyD88. Nat. אימונול. 3, 196–200 (2002).

חממי, ח' ואח'. קולטן דמוי אגרה מזהה DNA חיידקי. טֶבַע 408, 740–745 (2000).

הושינו, ק 'ואח'. חוד החנית: עכברים חסרי קולטן 4 (TLR4) דמויי אגרה עולים בתגובה ליפופוליסכרידית: עדות ל- TLR4 כתוצר הגן Lps. ג'יי אימונול. 162, 3749–3752 (1999).

Poltorak, A. et al. איתות LPS פגום בעכברי C3H/HeJ ו-C57BL/10ScCr: מוטציות בגן Tlr4. מַדָע 282, 2085–2088 (1998).

Takeuchi, O. et al. תפקידים דיפרנציאליים של TLR2 ו-TLR4 בהכרה של רכיבי דופן תא חיידקים גראם-שליליים ו-גרם חיוביים. חֲסִינוּת 11, 443–451 (1999).

Takeuchi, O. et al. אפליה של ליפופרוטאינים חיידקיים על ידי קולטן דמוי אגרה 6. Int. אימונול. 13, 933–940 (2001).

Takeuchi, O. et al. חוד החנית: תפקידו של קולטן 1 דמוי אגרה בתיווך התגובה החיסונית לליפופרוטאינים מיקרוביאליים. ג'יי אימונול. 169, 10–14 (2002).

Zhang, D. et al. קולטן דמוי אגרה שמונע זיהום על ידי חיידקים אורופתוגניים. מַדָע 303, 1522–1526 (2004).

Akira, S. & Takeda, K. איתות קולטן דמוי אגרה. Nat. הכומר אימונול. 4, 499–511 (2004).

Adachi, O. et al. שיבוש ממוקד של הגן MyD88 מביא לאובדן תפקוד בתיווך IL-1 ו-IL-18. חֲסִינוּת 9, 143–150 (1998).

פיצג'רלד, K.A. et al. Mal (MyD88-adapter-like) נדרש עבור העברת אותות של קולטן דמוי Toll-4. טֶבַע 413, 78–83 (2001).

Hoebe, K. et al. זיהוי של Lps2 כמתמר מפתח של איתות TIR בלתי תלוי MyD88. טֶבַע 424, 743–748 (2003).

הורנג, ט., בארטון, ג.מ. & Medzhitov, R. TIRAP: מולקולת מתאם במסלול איתות האגרה. Nat. אימונול. 2, 835–841 (2001).

הורנג, ט ', ברטון, ג' מ ', פלאבל, ר' א. & Medzhitov, R. מולקולת המתאם TIRAP מספקת סגוליות איתות לקולטנים דמויי Toll. טֶבַע 420, 329–333 (2002).

Kawai, T., Adachi, O., Ogawa, T., Takeda, K. & Akira, S. חוסר תגובה של עכברים חסרי MyD88 לאנדוטוקסין. חֲסִינוּת 11, 115–122 (1999).

Kawai, T. et al. Lipopolysaccharide ממריץ את המסלול הבלתי תלוי MyD88 וגורם להפעלה של IFN-regulatory factor 3 ולביטוי של תת-קבוצה של גנים הניתנים להשראת ליפופוליסכריד. ג'יי אימונול. 167, 5887–5894 (2001).

Oshiumi, H., Matsumoto, M., Funami, K., Akazawa, T. & amp Seya, T. TICAM-1, מולקולת מתאם המשתתפת באינדוקציה של קולטן דמוי טול 3, מתווכת אינטרפרון β. Nat. אימונול. 4, 161–167 (2003).

יאמאמוטו, מ 'ואח'. תפקיד חיוני עבור TIRAP בהפעלת מפל האיתות המשותף ל- TLR2 ו- TLR4. טֶבַע 420, 324–329 (2002).

יאמאמוטו, מ 'ואח'. תפקידו של המתאם TRIF במסלול איתות הקולטן שאינו תלוי ב- MyD88. מַדָע 301, 640–643 (2003).

יאמאמוטו, מ 'ואח'. TRAM מעורב במיוחד בנתיב האותות הבלתי תלוי ב-Toll-like קולטן 4-בתיווך MyD88. Nat. אימונול. 4, 1144–1150 (2003).

Sun, L. & Chen, Z.J. הפונקציות החדשות של הימצאות בכל מקום באיתות. Curr. דעה. תא ביול. 16, 119–126 (2004).

Marie, I., Smith, E., Prakash, A. & Levy, D.E. דימריזציה הנגרמת על ידי זרחון של גורם רגולטורי אינטרפרון 7 מסירה את קישור ה- DNA ואת תחום ההפעלה הדו-צדדית. מול. תָא. ביול. 20, 8803–8814 (2000).

Yoneyama, M. et al. הפעלה ישירה של מערכת האינטרפרון מסוג I על ידי זיהום בנגיף: הפעלה של קומפלקס גורמי שעתוק המכיל IRF-3 ו-CBP/p300. EMBO J. 17, 1087–1095 (1998).

פיצג'רלד, ק.א. et al. IKKε ו- TBK1 הם מרכיבים חיוניים של מסלול האיתות IRF3. Nat. אימונול. 4, 491–496 (2003).

Sharma, S. et al. הפעלת התגובה האנטי-ויראלית של האינטרפרון באמצעות מסלול הקשור ל- IKK. מַדָע 300, 1148–1151 (2003).

חמי, ח 'ואח'. התפקידים של שני קינאזות הקשורות ל- IκB ב- lipopolysaccharide ובאותות RNA כפולות וזיהום ויראלי. J. Exp. Med. 199, 1641–1650 (2004).

מק'הירטר, ס.מ. et al. ביטוי גנים תלויי גורם IFN 3, פגום בפיברובלסטים עובריים של עכבר חסר Tbk1. פרוק. Natl. אקאד. מדענית. ארה"ב 101, 233–238 (2004).

פרי, א.ק., צ'או, א.ק., גודנוג, ג'יי.בי, יה, וו. & amp Cheng, G. דרישה דיפרנציאלית לקינאז -1 המחייב TANK בתגובות אינטרפרון מסוג I להפעלת קולטן דמוי אגרה וזיהום ויראלי. J. Exp. Med. 199, 1651–1658 (2004).

Lin, R., Mamane, Y. & Hiscott, J. תחומים רגולטוריים מרובים שולטים בפעילות IRF-7 בתגובה לזיהום בנגיף. ג'יי ביול. Chem. 275, 34320–34327 (2000).

Sato, M. et al. תפקידים ברורים וחיוניים של גורמי שעתוק IRF-3 ו-IRF-7 בתגובה לנגיפים להשראת גן IFN-α/β. חֲסִינוּת 13, 539–548 (2000).

Hemmi, H., Kaisho, T., Takeda, K. & amp Akira, S. התפקידים של קולטן דמוי אגרה 9, MyD88 ותת יחידה קטליטית חלבונית קינאז תלויה בהשפעות של שני DNA CpG מובחנים על תת-תאים דנדריטים. . J. Immunol. 170, 3059–3064 (2003).

Izaguirre, A. et al. ניתוח השוואתי של ביטוי IRF ו-IFN-α בתאים דנדריטים מבני אדם ופלסמהציטואידים. ג'יי לוקוק. ביול. 74, 1125–1138 (2003).

Kerkmann, M. et al. הפעלה עם CpG-A ו- CpG-B oligonucleotides חושפת שני מסלולי רגולציה מובחנים של סינתזה IFN מסוג I בתאים דנדריטים פלסמציטואידים. J. Immunol. 170, 4465–4474 (2003).

Yow, W.S. et al. שחזור ביטוי בתיווך וירוסים של גני אלפא אינטרפרון בתאי פיברובלסטים אנושיים על ידי גורם רגולטורי 7-אינטרפרון חוץ-רחמי. ג'יי ביול. Chem. 275, 6313–6320 (2000).

Verthelyi, D., Ishii, K.J., Gursel, M., Takeshita, F. & Klinman, D.M. תאי דם היקפיים אנושיים מזהים ומגיבים באופן דיפרנציאלי לשני מוטיבים שונים של CPG. ג'יי אימונול. 166, 2372–2377 (2001).

דנג, ל 'ואח'. הפעלה של קומפלקס IκB kinase על ידי TRAF6 דורשת קומפלקס אנזים מצומד יוביקוויטין דימרי ושרשרת פוליוביקוויטין ייחודית. תָא 103, 351–361 (2000).

Hoshino, K., Kaisho, T., Iwabe, T., Takeuchi, O. & Akira, S. מעורבות דיפרנציאלית של IFN-β בהפעלת תאים דנדריטיים מגורה של קולטן דמוי אגרה. Int. אימונול. 14, 1225–1231 (2002).

Sato, S. et al. מתאם המכיל תחום קולטן Toll/IL-1 הגורם ל-IFN-β (TRIF) מתחבר לגורם 6 הקשור לקולטן TNF ולקינאז 1 מקשר TANK, ומפעיל שני גורמי שעתוק ברורים, NF-κB ו-IFN-regulatory factor-3, באותות קולטן דמויי Toll. J. Immunol. 171, 4304–4310 (2003).

יאמאמוטו, מ 'ואח'. חוד החנית: מתאם חדש המכיל תחום קולטן טול/IL-1 שמפעיל באופן מועדף את מקדם ה- IFN-β באותות הקולטן דמויי האגרה. ג'יי אימונול. 169, 6668–6672 (2002).

Mochizuki, N. et al. תמונות מרחביות-זמניות של הפעלה שגורמת לגדילה של Ras ו- Rap1. טֶבַע 411, 1065–1068 (2001).

Itoh, R.E. et al. הפעלה של וידאו rac ו-cdc42 שצולם על ידי בדיקת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית מבוססת בדיקות מולקולות בודדות בממברנה של תאים חיים. מול. תָא. ביול. 22, 6582–6591 (2002).

Tagawa, Y., Sekikawa, K. & Iwakura, Y. דיכוי של דלקת כבד המושרה על ידי concanavalin A בעכברי IFN-γ −/−, אך לא בעכברי TNF-α −/−: תפקיד של IFN-γ בהפעלת אפופטוזיס של הפטוציטים. J. Immunol. 159, 1418–1428 (1997).

Sorkin, A., McClure, M., Huang, F. & Carter, R. אינטראקציה של קולטן EGF ו-grb2 בתאים חיים המוצגים על ידי מיקרוסקופיה של העברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET). Curr. ביול. 10, 1395–1398 (2000).

Zhou, H. et al. Bcl10 מפעיל את מסלול NF-κB באמצעות כל מקום של NEMO. טֶבַע 427, 167–171 (2004).


P53 מסדיר ביטוי ותפקוד של קולטן דמוי אגרה 3 בקווי תאי האפיתל האנושיים

תאנה. 1. p53 מווסת באופן חיובי את הביטוי של TLR3 בתאי אפיתל. (א) תאים HCT116 p53 +/ + ו- p53-/-הועברו עם פלסמיד מקדם IL-8 וטופלו ב- 10 מיקרוגרם/מ"ל כל אחד מהאגוניסטים TLR המצוינים במשך 6 שעות. פעילות מקדם IL-8 נמדדה 48 שעות לאחר טרנספקציה של מקדם IL-8. הנתונים המוצגים הם אמצעי ± שגיאות סטנדרטיות מרישומים משולשים ומייצגים שלושה ניסויים עצמאיים. **, פ & lt 0.001 לעומת שליטה (תמיסת מלח שנאגרו בפוספט (HCT116 p53 +/ +)) הוערכה על ידי ANOVA בהליך של דנט. (ב) mRNA TLR3 בתאים HCT116 p53 +/ + ו- p53-/-נקבע על ידי PCR כמותי בזמן אמת. רמת ה-TLR3 mRNA נורמלה ל-GAPDH (בקרה פנימית). הנתונים המוצגים הם ממוצעים ± סטיות תקן מקביעות משולשות משלושה ניסויים עצמאיים. *, פ < 0.05 הוערך על ידי Student's ט מִבְחָן. (ג) mRNA TLR3 נבדק ב- HCT116 p53 +/ + ובתאים HCT116 p53 -/ - שלא הועברו או הועברו עם כמויות הולכות וגוברות של פלסמיד ביטוי p53. (ד) mRNA TLR3 נקבע בתאים HCT116 p53 +/ + ו- p53-/-שטופלו במשך 24 שעות עם 4 או 8 מיקרומטר 5-FU. עבור לוחות C ו- D, p21 שימש פקד חיובי. GAPDH שימש כבקרה פנימית עבור ניתוחי RT-PCR. (E) תאי HCT116 p53 +/+ הועברו transfected עם p53 siRNA (si-p53) או siRNA דופלקס בקרה (si-GL2), ו-RNA הכולל מתאי אלה בודד לניתוח של TLR3 ו-p53 mRNA על ידי RT-PCR. (ו) רמת החלבון TLR3 נקבעה ב-lysates של תאי HCT116 p53 +/+ ו-p53 -/- על ידי משקעים אימוניים (IP) ו-Western blotting באמצעות נוגדן אנטי-TLR3. Hsc70 שימש כבקרה פנימית. con-IgG, שליטה ב-IgG. (G) תאי A549 טופלו ב- 4 או 8 מיקרומטר 5-FU למשך 24 שעות. (H) si-GL2 או הכמות המצוינת של p53 siRNA דופלקס הועברו תאי A549. 24 שעות לאחר מכן, RNA חולץ. (I to K) HepG2 (I), Caco2 (J) ו- Calu-3 (K) תאים טופלו ב- 400 או 800 μM 5-FU למשך 8 שעות. עבור לוחות G עד K, ה-RNA הכולל הוצא ונותח על ידי RT-PCR לביטוי של TLR3, p21 (ביקורת חיובית) או p53. GAPDH שימשה כבקרה פנימית. תאנה. 2 . p53 נקשר ומפעיל מחדש את מקדם ה- TLR3. (א) תאי HCT116 p53 +/+ ו-p53 -/- הועברו טרנספקציה עם מבני האמרגנים המצוינים של TLR3 (0.2 מיקרוגרם). פעילות לוציפראז נקבעה 48 שעות לאחר העברת פלסמידים ומתבטאת כהפעלה (קיפול) על פני הווקטור pGL3b. ערכים הם אמצעי ± טעויות סטנדרטיות מרישומים משולשים. הנתונים המוצגים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים. ** ו ***, פ & lt 0.001 ו- פ < 0.0001, בהתאמה, כנגד אורך המקדם התואם בתאי HCT116 p53 −/−, כפי שנקבע על ידי Student's ט מִבְחָן. (חלונית ימין) דיאגרמה סכמטית של מבני מקדם TLR3 המכילים את אתרי הקישור של p53. (ב) תאי HCT116 p53 -/- הועברו באופן זמני עם מבני הקדם TLR3 המצוינים (0.2 מיקרוגרם) ו-0.025 מיקרוגרם פלסמיד p53 או וקטור ריק pcDNA3.1 (con), ופעילות הלוציפראז נבדקה 48 שעות לאחר ההעברה. ערכים הם אמצעים ± שגיאות סטנדרטיות מציפויים משולשים. הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים. **, פ < 0.001, כפי שנקבע על ידי Student's ט מִבְחָן. (ג) תאי HCT116 p53 -/- הועברו באופן זמני עם וקטור pGL3b או פרומטר TLR3 -2 kb (TLR3p), הועברו יחד עם פלסמיד ביטוי p53 בכמויות הולכות וגדלות (6.25, 12.5 ו-25 ng), ונבדקו עבור פעילות לוציפראז. ערכים הם אמצעי ± טעויות סטנדרטיות מרישומים משולשים. הנתונים המוצגים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים. ***, פ & lt 0.0001 לעומת TLR3p, כפי שהוערך על ידי ANOVA בהליך של דנט. ד ערכים הם אמצעי ± טעויות סטנדרטיות מרישומים משולשים. הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים. ** ו***, פ < 0.001 ו פ & lt 0.0001, בהתאמה, נגד TLR3p, כפי שנקבע על ידי ANOVA עם הבדיקה של דנט. (ה) סוג פראי או מוטנטי (אתרים מחייבי p53 המוטציות) מקדם ה- TLR3 (-2 kb) הועבר לתאים HCT116 p53 +/ +, ופעילות לוציפראז נבדקה 48 שעות לאחר ההיתר. ערכים הם אמצעי ± טעויות סטנדרטיות מרישומים משולשים. הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים. ***, פ & lt 0.0001 נגד מקדם ה- TLR3 מסוג wild-type (WT), כפי שנקבע על ידי ANOVA עם בדיקת Tukey-Kramer. n.s., לא משמעותי. (לוח עליון) דיאגרמה סכמטית של מקדם TLR3 -2 kb עם המיקום המצוין של אתר הקישור של p53 שעבר מוטציה. (F) תאי HCT116 p53 -/- הועברו עם pGL3b ופרוטור מסוג פראי (WT) או מוטנטי TLR3 והועברו יחד עם וקטור ריק pCDNA3.1 או פלסמיד p53, ופעילות לוציפראז הוערכה 48 שעות לאחר ההעברה. ערכים הם אמצעי ± טעויות סטנדרטיות מרישומים משולשים. הנתונים מייצגים שלושה ניסויים עצמאיים. *ו**, פ < 0.01 ו פ < 0.001, בהתאמה, כנגד וקטור pCDNA3.1, כפי שהוערך על ידי הסטודנטים ט מִבְחָן. (ז) אתר קונצנזוס של p53 ורצף אתר הקישור של p53 במקדם TLR3 ב-1929. בסיסים עם קו תחתון מציינים וריאציה ברצף מאלמנט הקונצנזוס p53. (H) תוצאה מייצגת של ניתוח שבב בתאי p53 +/ + HCT116 באמצעות נוגדן p53 או IgG עכבר לאימונו -דגימות (IP) ופריימרים של האזור האמרגן המצוין ל- PCR. תאנה. 3. הפעלת מסלול איתות TLR3 על ידי poly(I-C) נפגעת בתאי HCT116 p53 -/-. (A עד C) ליזטים ציטופלסמיים (A ו- C) או תמציות גרעיניות (B) מ- HCT116 p53 +/ + ו- p53 -/ - תאים לא מגורה או מגורה במשך 3 שעות עם פולי (IC) בריכוז המצוין (A ו- C) או 5 מיקרוגרם/מ"ל (B) נותחו באמצעות Western blotting עבור IκB-α מזורחן (p-IκB-α) ו-IκB-α בסיסי (A), p65 (B), IRF-3 מזורחן (p-IRF-3) , וביטוי בסיסי של IRF-3 (C). Hsc70 שימש כבקרת טעינה עבור לוחות A ו-C. γ-Tubulin שימש כבקרת טעינה עבור פאנל B. תאנה. 4 . התגובה של ציטוקינים IL-8 ו- IFN-β, הנמצאים במורד הזרם של TLR3, לגירוי פולי (I-C) דורשת p53. (א) ניתוח PCR כמותי בזמן אמת של IL-8 ו- IFN-β mRNA בוצע ב- HCT116 p53 +/ + ו- p53-/-תאים ללא טיפול או שטופלו ב- 5 מיקרוגרם/מיליליטר פולי (I-C) למשך 3 שעות. ביטוי mRNA מנורמל ל- GAPDH. ערכים הם אמצעים ± סטיות תקן של מדידות משולשות. ***, פ & lt 0.0001, כפי שניתח על ידי ANOVA עם בדיקת Tukey-Kramer. (ב) רמת ה-mRNA של IL-8 ו-IFN-β נקבעה בתאי HCT116 p53 +/+ ו-p53 -/- מגורים עם 5 מיקרוגרם/מ"ל poly(I-C) למשך הזמן המצוין. p21 ו- GAPDH שימשו בקרה חיובית ובקרה פנימית, בהתאמה. (C ו- D) פעילות היזמים של IL-8 (C) ו- IFN-β (D) נבדקה בתאים HCT116 p53 +/ + ו- p53-/-מגורים בפולי (IC) בריכוז המצוין במשך 6 שעות (עליון לוחות) או עם 5 מיקרוגרם/מ"ל poly(IC) למשך הזמן המצוין (לוחות תחתונים). ערכים הם אמצעים ± שגיאות סטנדרטיות מציפויים משולשים. הנתונים המוצגים מייצגים שניים עד שלושה ניסויים עצמאיים. (ה) ביטוי ה- mRNA של IL-8 ו- IFN-β נותח בתאי HCT116 p53 +/ + לא מגורה או מגורה עם פולי (IC) ולא הועבר או הועבר עם siRNA דופלקס עבור TLR3 (si-TLR3) או p53 (si- p53) או עם si-GL2 (לשליטה). ביטוי של TLR3 ו-p53 הופל על ידי טרנספקציה של siRNAs בהתאמה בתאי p53 +/+ (לוחות תחתונים). תאנה. 5 . רמת ה- mRNA TLR3 יורדת ברקמות של עכברים p53 -/ -. (A עד C) כולל RNA שבודד מכבד (A), מעי (B) וטחול (C) של עכברים p53 +/+, p53 +/- ו-p53 -/- נותח לביטוי של TLR3 על ידי אמיתי -RT-PCR כמותי בזמן. רמות mRNA של TLR3 נורמלו ל- HPRT (בקרה פנימית). התוצאות מייצגות ממוצעים ± סטיות תקן (נ = 3). *ו- **, פ & lt 0.01 ו פ & lt 0.001, בהתאמה, כנגד עכברים מסוג p53 פראי (+/+), כפי שהוערך על ידי ANOVA בבדיקת דנט.

מודלים של אוטם בשריר הלב: חסימה של עורקים כליליים קבועים עם אוטם שריר הלב שאינו נגרם מחדש.

MI: שיקולים כלליים.

חסימה כלילית גורמת להפסקת חילוף החומרים האירובי מיידי בשריר הלב האיסכמי, מה שמוביל להידלדלות ATP מהירה ולהצטברות מטבוליטים וכתוצאה מכך תפקוד סיסטולי חמור תוך שניות (86). אם משך הזמן של העלבון האיסכמי הוא 15 דקות ביונקים גדולים יותר כגון כלב וחזיר, שיקום הזרימה הופך את השינויים המוקדמים של איסכמי קרדיומיוציטים (נפיחות מיטוכונדריאלית חולפת או דלדול גליקוגן) וכל הקרדיומיוציטים באזור האיסכמי יכולים לשרוד (158). תקופות ארוכות יותר של איסכמיה גורמות למוות של מספר הולך וגדל של קרדיומיוציטים. מרווח של 20 עד 30 דקות של איסכמיה חמורה מספיק בכדי לגרום לשינויים בלתי הפיכים בכמה קרדיומיוציטים של האזור התת-קרדיאלי, מה שגורם להפרעה סרקולמלית ולהפרעות בולטות בארכיטקטורה המיטוכונדריה, כגון עדות אולטרה-מבנית לצפיפות מטריקס אמורפית ונפיחות מיטוכונדריאלית חמורה (156) . שינויים אולטרה-סטרוקטורליים מוקדמים אלה מסמנים קרדיומיוציטים שלא ניתן להציל ובסופו של דבר ימותו בסביבת האוטם (157).

מחקרים ניסיוניים במודל הכלבי של MI מדגימים הטרוגניות טרנס-מוראלית בתגובת שריר הלב לאיסכמיה, מה שמצביע על כך שהתת-אנדוקרדיום, שבו הדרישה לחמצן שריר הלב היא הגדולה ביותר, רגיש יותר לפציעה איסכמית מאשר שריר הלב ותת הלב (2). לפיכך, הפרדיגמה הרווחת מציעה חזית גל של מוות קרדיומיוציטים המתקדמת מסאב -לב הלב הרגיש לסאב -פקרדיד הפחות פחות ככל שמשך העלבון האיסכמי עולה (159, 252). מחקרים ניסיוניים במודלים של בעלי חיים גדולים הראו כי לא ניתן להציל את שריר הלב האיסכמי על -ידי עירוי חוזר לאחר 6 שעות של חסימה כלילית (251). הפגיעות המוגברת של אזורים תת-אנדוקרדיאליים לחסימה כלילית עשויה לשקף הפחתה גדולה יותר של זרימת הדם התת-אנדוקרדיאלית עקב הבדלים טרנס-מורליים בכלי דם (2, 25) ובדחיסה חוץ-וסקולרית (68, 286). The wavefront concept of ischemia developing into infarction was derived from experimental studies in dogs, where a substantial coronary collateral circulation influences the time course of cardiomyocyte necrosis (86).

The major species difference in the MI response lies in the temporal and spatial kinetics of events and differences due to myocardial size. In mice, durations of coronary occlusion exceeding 60–90 min are considered irreversible, and inflammation and wound healing processes are accelerated (64, 88, 221, 222). In mouse and rat models, reperfused infarcts are typically midmyocardial, and subepicardial and subendocardial regions are relatively spared (50, 69, 325). Studies in a sheep model of reperfused infarction also suggest that the midmyocardium may be most vulnerable to ischemic injury in contrast, the subendocardium is relatively resistant (263). The pig model of coronary occlusion-reperfusion comes closest to human STEMI in its temporal and spatial development, but other models are nevertheless useful to study fundamental mechanisms of MI (140).

MI: technical considerations.

Extensive protocols providing technical details for performing permanent occlusion MI and reperfused MI in mice and rats are available (221, 222, 228, 317, 327). While MI is most commonly performed in rodent models, protocols in other animal models are also available (151, 183, 218, 331). For mice, the quality of open-chest surgery to induce coronary occlusion directly impacts study outcomes (152, 221, 222). Minimizing the size of the thoracotomy and limiting bleeding by entering the thorax through intercostal muscles are recommended.

Biomarkers that have been used to evaluate the presence of MI include cardiac troponins and creatine kinase, and plasma proteins such as macrophage migration inhibitory factor can also be measured as indices of injury (47, 55). Infarct size is widely measured as a key variable for testing genetic or therapeutic intervention efficacy, and infarct size measurements taken serially at both early and late time points can evaluate the extent of infarct expansion (22). Echocardiography can also be used for infarct sizing, with the caveat that echocardiography does not distinguish between reversible ischemic dysfunction (stunning) and irreversible loss of function and therefore a secondary method is needed for confirmation of infarct size at early time points. For more details on measuring cardiac function in mice, the reader is advised to consult the article Guidelines for measuring cardiac physiology in mice (196).

Permanent occlusion MI: model rationale and variables measured.

Permanent coronary occlusion is a relevant animal model of acute STEMI reflective of patients who, due to contraindications or logistic issues, do not receive timely or successful reperfusion (53, 104). Permanent coronary occlusion yields acute ST segment elevation infarction with robust myocardial inflammation and long-term remodeling, thus providing a large effect size that reduces the sample size needed to detect differences between groups. Infarction assessed in the first 1–14 days after coronary ligation is histologically characterized by coagulation band necrosis with a fulminant inflammatory infiltrate in the infarct and border zone regions. Infarction is geometrically and physiologically characterized by wall thinning, increases in LV dimensions and volumes, and decreases in fractional shortening and ejection fraction.

Changes that occur over the first week provide information on myocyte cell death and infarct development, inflammation and leukocyte physiology, extracellular matrix (ECM) turnover and fibroblast activation, and the role of endothelial cells in neovascularization (83, 154, 165, 194, 205). Chronic evaluation at time points 4–8 wk post-MI provides information on long-term remodeling. Whether the infarct region or remote region is the focus of investigation depends on the question asked. Examining the infarct region provides details on active inflammation and scar formation, while examining the remote region provides details on still-viable myocytes within the myocardium and remote inflammatory and ECM processes.

Perioperative and postoperative survival should be assessed, and the time point of delineation between these two phases should be defined. For some laboratories, the perioperative phase includes the time until the animal recovers and becomes ambulatory (usually within 1–3 h for mice). For other laboratories, the perioperative phase includes the first 24 h after surgery. Perioperative death within 24 h post-MI in mice is usually due to surgical errors (or very large infarct sizes), and, in established laboratories, the 24 h surgical mortality rate due to technical issues is <10%. In the permanent occlusion MI model in mice, postoperative death (deaths at >24 h time point) typically occurs during days 3–7 post-MI and is due to rupture, acute heart failure, or arrhythmias (59, 98, 233). Autopsy is strongly recommended for all mice that die prematurely, to evaluate early deaths due to technical issues and later deaths due to complications of MI. Seven-day postoperative mortality rates are

10–25% (75–90% survival) for female young mice and 50–70% (30–50% survival) for male young mice (47, 61, 89, 98, 152, 170, 195, 202, 206, 234, 310–312, 319, 323). Immediate survival from the surgery can also be affected by baseline characteristics such as obesity, diabetes, or high levels of circulating inflammatory cells, which, in turn, determine the response to anesthesia and surgery (60, 123, 202, 203). While there is no difference in infarct tolerance between young and middle-aged mice (323), older mice may survive better than younger mice (202, 319).

For permanent occlusion MI models, infarct size must be measured in fresh LV slices at the time of necropsy by TTC staining and typically ranges from 30% to 60% of the total LV (47, 48, 61, 89, 98, 152, 195, 202, 206, 223, 310–312, 319, 323). The method for calculating infarct size varies across laboratories. Some laboratories use area calculations, other laboratories measure length in the midmyocardium, and other laboratories measure and average lengths in the subendocardium and subepicardium. There is no need to use Evans blue for area at risk assessment in permanent coronary occlusion models that pass the point from ischemia to infarction, as the entire area at risk is infarcted. It is important that MI surgical success is confirmed and that the initial infarct injury is comparable across groups, to assess remodeling differences at later stages. In mice, ligating the coronary artery at the same anatomical location across groups is important 1 mm distal to the left atrium is the recommended site to generate large infarcts (35–60% of total LV). Failure to induce MI can occur, usually due to missing the coronary artery during the ligation step. Monitoring the electrocardiogram for ST segment elevation during the procedure reduces this possibility. Echocardiography at 3 h after coronary occlusion can be used to exclude animals with excessively small or large MI before randomizing groups (153, 155, 195). Late gadolinium-enhanced MRI is also useful for selecting animals with consistent infarct sizes (262). When assessing effects of treatments initiated post-MI, it is important to show that infarct size is not different between groups before treatment. Plasma sampling at 24 h post-MI can be used to assay cardiac biomarkers, such as troponins and inflammatory cytokines, with the caveat that these measurements can indicate presence or absence of infarct and not extent of injury. After coronary occlusion, care should be taken in performing these assessments to minimize disturbing animals at times when cardiac rupture may be triggered by stress, particularly at days 3–7 post-MI in untreated controls (96, 98). Small infarcts may reflect technical issues in missing the coronary artery, resulting in damage from the suture rather than reflecting the intended myocardial ischemia and infarction. Infarct sizes <30% are typically excluded. If included, small and large infarcts may need to be grouped separately to reduce possible type II statistical errors.

Cardiac wound healing and remodeling, typically assessed days to weeks post-MI, can be examined using a wide variety of approaches, including echocardiography, histology, biochemistry, and cell biology (5, 217, 328). Serial measurements of cardiac geometry and function by echocardiography are useful for defining phenotypes. Cardiac dimensions vary depending on heart rate and depth of anesthesia, and these parameters must be carefully controlled and matched across groups. Cardiac functional reserve can be assessed by measuring the contractile response to inotropic drugs or volume overload. Cardiac MRI and hemodynamic assessment by pressure-volume catheterization are other ways to measure cardiac physiology parameters. It is feasible to quantify infarct size noninvasively and serially by using cardiac MRI (181). Hemodynamic evaluation in mice is a terminal procedure, which prevents its use in serial assessments.

Hematoxylin and eosin staining provides information on areas of necrosis and inflammation, while picrosirius red staining provides information on total collagen accumulation both in the scar and remote regions (316). Immunohistochemistry for neutrophils, macrophages, lymphocytes, fibroblasts, and endothelial cells provides information on the extent of inflammation, scar formation, and neovascularization. Isolating individual cell types and assessment of ex vivo phenotypes in culture can further aid in understanding mechanisms. Studies have revealed that inflammation evoked by acute myocardial infarction also occurs systemically and that the spleen and liver are important sources of cells and factors that influence LV remodeling (71, 72, 95, 116, 198, 199, 293).

I/R MI: model rationale and variables measured.

Implementation of myocardial reperfusion strategies has significantly reduced mortality in acute STEMI. Reperfusion has contributed to the growing pool of patients who survive the acute event and are at risk for adverse remodeling and subsequent development of heart failure (133, 136). In addition to salvaging cardiomyocytes, reperfusion has profound effects on cellular events responsible for repair and remodeling.

Although timely reperfusion is essential to salvage viable cardiomyocytes from ischemic death, extensive preclinical and clinical evidence suggests that reperfusion itself causes injury (119, 121, 147). Reperfusion-induced arrhythmias and myocardial stunning are self-limited and reversible forms of reperfusion injury, while microvascular obstruction and lethal cardiomyocyte injury are irreversible and extend damage, thus contributing to adverse outcomes following MI (13, 126, 177, 241, 318). In patients, no reflow during reperfusion may be exacerbated due to the generation of microemboli composed of atherosclerotic debris and thrombi during percutaneous coronary interventions (135, 253).

MI both with or without reperfusion shares many of the same technical guidelines, and this information is provided above. The one technical difference is whether the ligation is removed at 45–60 min after the occlusion to reperfuse the myocardium. Similar to permanent occlusion MI, studies investigating the inflammatory and reparative response following MI with reperfusion need to take into account the dynamic sequence of cellular events involved in repair. Common measurements shared by the two MI models are shown in Table 2. For studies aimed at investigating acute myocardial injury using a reperfusion strategy, the duration of coronary occlusion needs to be sufficient for the induction of significant MI but not overly prolonged to cause irreversible injury in the entire area at risk. From the cell physiology perspective, the reparative response after MI can be divided into three distinct but overlapping phases: inflammation, proliferation, and maturation (26, 65). In the infarcted myocardium, dying cardiomyocytes release damage-associated molecular patterns and induce cytokines and chemokines to recruit leukocytes into the infarcted region, thus triggering an intense inflammatory reaction that serves to clear the infarct from dead cells and ECM debris, while initiating a reparative response (84). Early reperfusion after irreversible cardiomyocyte injury accelerates and accentuates the inflammatory reaction and has profound effects on the pathological features of the infarct. Microvascular hyperpermeability is evident in the myocardium with acute I/R (97). Rapid extravasation of blood cells through the hyperpermeable vessels may result in hemorrhagic changes (98, 178). Influx of phagocytotic macrophages is accelerated, resulting in more rapid removal of dead cardiomyocytes compared with permanent occlusion MI. In reperfused infarcts, dying cardiomyocytes often exhibit large contraction bands, comprised of hypercontracted sarcomeres. Subsarcolemmal blebs and granular mitochondrial densities, which are already present in irreversibly injured cardiomyocytes before restoration of blood flow, become more prominent upon reperfusion.

Table 2. Common output measurements for in vivo MI and MI/reperfusion studies

MI, myocardial infarction ECM, extracellular matrix MRI, magnetic resonance imaging.

Phagocytosis of dead cells by activated macrophages results in the activation of endogenous anti-inflammatory pathways, ultimately leading to resolution of the inflammatory infiltrate. Suppression of inflammation is followed by recruitment of activated myofibroblasts that deposit large amounts of ECM proteins and by activation of angiogenesis (145). As the scar matures, fibroblasts become quiescent and infarct neovessels acquire a coat of mural cells (332). Compared with large mammals, rodents exhibit an accelerated time course of infiltration with inflammatory and reparative cells (64).

Leukocyte infiltration during the inflammatory phase of infarct healing and myofibroblast activation and accumulation during the proliferative phase are predominantly localized in the infarct region and border zone (87, 122, 280). During scar maturation, the cellular content in the infarcted region is reduced. At the same time, however, the number of activated macrophages and fibroblasts in the remote remodeling myocardium increases. Therefore, study of inflammatory and reparative cell infiltration and assessment of ECM protein deposition should include systematic assessment of each end point in the infarcted region, the peri-infarct area, and the remote remodeling myocardium.

Sympathetic nerves are damaged by permanent coronary occlusion but can regenerate after injury (220). In the setting of chronic MI, regional hyperinnervation around the infarcted region has been observed, and activation of cardiac sympathetic nerves is important in triggering ventricular arrhythmias, and such proarrhythmic action is dependent on the extent of infarction (1, 70, 315, 326). In contrast, after I/R, chondroitin sulfate proteoglycans prevent reinnervation (99, 100). Thus, the model selected for sympathetic nerve evaluation should be taken into consideration and depends on what question is being asked.

MI: intervention considerations.

The effects of interventions on post-MI remodeling can be studied using both nonreperfused MI and reperfused MI/R models (11, 219, 232, 294, 322). Typically, nonreperfused MI yields accentuated dilative remodeling and exacerbated dysfunction compared with a reperfused infarct involving the same vascular territory, reflecting a combination of more extensive infarct and less effective repair. In the reperfused MI/R model, the effects of genetic or pharmacologic interventions implemented early after reperfusion may reflect differences in the extent of acute cardiomyocyte injury rather than differences in wound healing responses. With permanent occlusion MI (assuming a standardized area at risk) or very late reperfusion models, differences in geometry and function of the remodeling heart are independent of acute cardiomyocyte injury and reflect effects on inflammatory, reparative, or fibrotic cascades. In the presence of an occluded coronary artery, the delivery of systemically administered pharmacologic agents to the infarcted region of large animal models may be dependent on formation of collaterals.

While the development of genetically targeted animals (mice, rats, and rabbits) resulted in an explosion of studies dissecting cell biological mechanisms and molecular pathways, large animal models are considered closer to the clinical situation for translational studies to test safety and effectiveness. Optimal study of molecular, cellular, and LV functional end points and interpretation of the findings require understanding of the underlying pathophysiology. Assessment of infarct size is typically the primary end point for investigations examining the mechanisms of cardioprotection. Assessment of chamber dimensions using echocardiography or MRI is crucial to study the progression of adverse remodeling. Systolic and diastolic cardiac geometry and function can be assessed noninvasively using echocardiography (including Doppler ultrasound and speckle tracking), MRI, and hemodynamic assessment. Mechanistic dissection of specific pathways may require inclusion of additional cell physiology and molecular or proteomic end points. In experimental models of MI, understanding the time course of the cellular and molecular events is critical for optimal study design. The effects of varying ischemic intervals on survival and activation of noncardiomyocyte cellular and acellular (e.g., ECM) compartments are poorly understood. Longer coronary occlusion times have distinct effects on cardiac repair, by extending infarct size and by influencing susceptible noncardiomyocyte populations, such as endothelial cells, fibroblasts, pericytes, and immune cells (85). Most studies characterizing responses to myocardial injury have so far been performed in healthy young animals. Comorbid conditions, such as aging, diabetes, and metabolic dysfunction, affect the pattern of ischemic injury and modify the time course and qualitative characteristics of the inflammatory and reparative responses (27, 106, 202, 238, 298, 319, 323). These comorbidities are relevant in the clinical context and must be considered in translation of experimental findings to the clinic.

To summarize, the major strengths and limitations of the nonreperfused and reperfused MI models are shown in Table 1.


Research progress on Toll-like receptor signal transduction and its roles in antimicrobial immune responses.

מחברים:

Appl Microbiol Biotechnol 2021 Jun 28. Epub 2021 Jun 28.

College of Veterinary Medicine (Institute of Comparative Medicine), Yangzhou University, 12th East Wenhui Road, Yangzhou, 225009, China.

When microorganisms invade a host, the innate immune system first recognizes the pathogen-associated molecular patterns of these microorganisms through pattern recognition receptors (PRRs). Toll-like receptors (TLRs) are known transmembrane PRRs existing in both invertebrates and vertebrates. Upon ligand recognition, TLRs initiate a cascade of signaling events promote the pro-inflammatory cytokine, type I interferon, and chemokine expression and play an essential role in the modulation of the host's innate and adaptive immunity. קרא עוד

Molecular mechanisms of non-self nucleic acid recognition by the innate immune system.

מחברים:

Eur J Immunol 2021 Jun 17. Epub 2021 Jun 17.

Gene Center and Department of Biochemistry, Ludwig-Maximilians-Universität München, Munich, Germany.

Nucleic acids (NAs) represent one of the most important classes of molecules recognized by the innate immune system. However, NAs are not limited to pathogens, but are also present within the host. As such, the immune system has evolved an elaborate set of pathogen recognition receptors (PRRs) that employ various strategies to recognize distinct types of NAs, while reliably distinguishing between self and non-self. קרא עוד

Modulation of Bovine Endometrial Cell Receptors and Signaling Pathways as a Nanotherapeutic Exploration against Dairy Cow Postpartum Endometritis.

מחברים:

Animals (Basel) 2021 May 2311(6). Epub 2021 May 23.

Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutical Development of Ministry of Agriculture, Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Sciences of Chinese Academy of Agricultural Science, Lanzhou 730050, China.

In order to control and prevent bovine endometritis, there is a need to understand the molecular pathogenesis of the infectious disease. Bovine endometrium is usually invaded by a massive mobilization of microorganisms, especially bacteria, during postpartum dairy cows. Several reports have implicated the Gram-negative bacteria in the pathogenesis of bovine endometritis, with information dearth on the potentials of Gram-positive bacteria and their endotoxins. קרא עוד

Suppression of the TRIF-dependent signaling pathway of TLRs by epoxomicin.

מחברים:

Arch Pharm (Weinheim) 2021 May 31:e2100130. Epub 2021 May 31.

Department of Biomedical Laboratory Science, College of Medical Sciences, Soonchunhyang University, Chungnam, Asan-si, Republic of Korea.

Toll-like receptors (TLRs) can recognize specific signatures of invading microbial pathogens and activate a cascade of downstream signals to induce the secretion of inflammatory cytokines, chemokines, and type I interferons. The activation of TLRs triggers two downstream signaling pathways: the MyD88- and the TRIF-dependent pathways. To evaluate the therapeutic potential of epoxomicin, a member of the linear peptide α',β'-epoxyketone first isolated from an actinomycetes strain, we examined its effects on signal transduction via TLR signaling pathways. קרא עוד

Landscape of toll-like receptors expression in tumor microenvironment of triple negative breast cancer (TNBC): Distinct roles of TLR4 and TLR8.

מחברים:

Gene 2021 Aug 20792:145728. Epub 2021 May 20.

Department of Molecular and Cellular Biology, National Institute for Research on Reproductive Health, Mumbai, India. כתובת אלקטרונית:

TNBC is the most aggressive and hormone receptor-negative subtype of breast cancer with molecular heterogeneity in bulk tumors hindering effective treatment. Toll-like receptors (TLRs) have the potential to ignite diverse immune responses in the tumor microenvironment (TME). This encouraged us to screen their transcript expression in the publically available TCGA datasets. קרא עוד