מֵידָע

כיצד RNAse יכול להשפיל כל RNA?

כיצד RNAse יכול להשפיל כל RNA?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

לכל RNA יש רצף ייחודי. מכיוון ש- RNAse הוא אנזים ומצעים מגיבים לאתר הפעיל שלו במנגנון מנעול, כיצד RNAse מסוגל לפגוע בכל סוג של RNA?


אנזימים משתנים בספציפיות המצע

זה מכוסה ברוב ספרי הלימוד של הביוכימיה, אך ניתן למצוא הסברים באינטרנט, למשל. פה. מבחינת ריבונוקלאזות, יכולה להיות סגוליות גבוהה (למשל הכרה ב- RNA עם רצף בסיס ספציפי), ספציפיות נמוכה יותר (3'- או 5'-אקסנונוקלאזות- לפעול מהקצוות המתאימים הללו) או ספציפיות המוגבלת לקשר הספציפי. להישבר (למשל ריבונוקלאז הלבלב מעכל כל קשר פוספודיאסטר של RNA - אך לא DNA). (ישנה גם סגוליות של גדילי גדילה - בין RNA דו-גדילי לחד-גדילי.)

מה קובע את הספציפיות המשתנה הזו?

ככל הנראה, סגוליות הסובסטרט נקבעת על פי מידת המבנה של המצע שהאנזים צריך לזהות - כלומר להיקשר אליו כמו 'מנעול ומפתח', המכונה בשאלה. זה דורש היכרות עם הכימיה של המצע, במקרה זה RNA:

בתרשים לעיל (שונה מברג et al.) הקשר הפוספודיסטר שחייב להיות מפורק מודגש. אנו יכולים להסיק מתרשים זה שכדי להיות ספציפי ל-RNA - אבל לא יותר - ריבונוקלאז צריך להיות מסוגל לזהות את הריבוז 2'OH (כלומר להבחין בינו לבין 2'-דאוקסיריבוז) וכן לזהות את הקשר הפוספודיסטר. אין צורך להכיר את הבסיסים.

מנגנון הפעולה של ריבונוקלאז הלבלב בקר

המנגנון של RNase בלבלב הוקם בשנות ה-60, הרבה לפני כל RNase שזיהה רצפים מסוימים, למרות שהוא שוכלל לאחר מכן. תרשים מתוך המאמר מאת רוברטס et al. (1969) מוצג להלן.

התרשים אמנם מציג 'כיס' לאחד הבסיסים הסמוכים לקשר הפוספודיסטר, אבל זה צריך להיות רק הידרופובי בדרך כלל, מסוגל להכיל כל אחד מארבעת הבסיסים.

כדי לחקור את האינטראקציה של הבסיסים עם RNAase יש להשיג מבנים גבישיים של RNAase מורכבים לפסאודו-סובסטרטים או מעכבים (המצע האמיתי הופך הידרוליזה, כמובן). הספרות כאן מורכבת, ואינני יכול לספק סקירה נוחה של הנושא. נראה כי קישור ה- RNA מתייצב על ידי אינטראקציה של בסיסים מסוימים עם החלבון, אך נקודת המפתח היא שכל אינטראקציות כאלה אינן דרישה לקשירת המצע. כנקודת מוצא לספרות אני מציע את דף פרוטופדיה ב- RNase A, ומאמר מאת בירדסול ומקפרסון.


טיפול ב- RNA - כיצד להימנע מזיהום RNase - (24 בנובמבר 2009)

היי סוזנה, תוכל לבצע חיטוי של העלי המתכתי ולנגב את כל המשטחים הבאים במגע לרקמה באמצעות RNaseZap. אל תדאג אם אין לך RNaseZap במעבדה, רק וודא שאתה מרכך את הרקמה בקרוב ותמיד תשמור עליה קרה ותוסיף את מאגר התמוגה בהקדם האפשרי לאחר הטחינה. זה אמור לעשות את העבודה!

יש לי שאלה בנוגע לחילוץ RNA תוך שימוש ב- TRIZOL REAGENT. למה אני מחמם את הטריזו? האם זה טוב לחמם אותו או שזה משנה?

היו מודאגים עם RNases ברקמה - עבדו במהירות, על קרח אם אפשר.

אם אתה משתמש במאגר עתיר מלח להומוגניזציה של הרקמה, זה אמור לעכב מעט את RNases.
אני הופך את הרקמה שלי להומוגנית כבר ב-Trizol, שמבטלת את כל החלבונים, כולל RNases.

כדי לטהר, אתה יכול להשתמש ב-0.5% SDS ולאחר מכן לנגב הכל עם 70% אתנול המיוצר עם DEPC'd H2O.
והכי חשוב, אני מנקה את כל מה שאני נוגע בו, כולל הכפפות שלי, עם 0.5% SDS ומנגב עם 70% EtOH כדי למנוע כל זיהום RNase.

אני לא עושה חיטוי, זה קשה על הציוד ולא יעיל במאה אחוז ב- RNases.

יכול להיות שזה קצת מאוחר לפרסם תשובה לשרשור הזה בגלל הגיל שלו, אבל מאז שהוא מוצמד.

בדרך כלל אנו מכינים שפופרות של 4x50 מ"ל. מלאו שלושה עם 40 מ"ל מים שטופלו ב- DEPC, ואחד באתנול 100%.
אחד מצינורות המים שטופלו ב- DEPC מקבל 5-10 שפריצים של RNase Zap.
בין כל דגימה, ההומוגגניסטור טובל ב-100% אתנול, מים RNase Zap, ומים מטופלים 2x DEPC בתורו.
בכל פעם מפעילים את ההומוגנייזר למשך כ-15-30 שניות.

זה די מהיר ונראה שעובד טוב עבורנו.

בהשוואה ל- RNase שעומדים להשתחרר מרקמה, ה- RNase שאפשר להביא על ידי הקצה הוא ממש זניח. חיץ ליסיס מכיל בדרך כלל ריכוז גבוה של מלח גואנידין, כביכול ידנטור את כל ה-RNase ללא קשר למקורות. עם זאת RNA עדיין עובר התדרדרות מתמשכת ב- lysates, ולכן לאחר עיבוד הומוגניות יש צורך לעבד את הדגימות באופן מיידי. לחלופין, ניתן להדביק ריאגנט RNASound מ- Metammune ב-Lysis כדי לשפר את יציבות ה-RNA בליזטים.

משהו שאתה יכול לשקול עבור מיצוי RNA הוא שימוש בחנקן נוזלי:

-במרגמה, שבה בערתי בעבר 100% אתנול, שטפתי עם RNAse Zap שווה ערך, הקפאת הבזק את הרקמה.
לאחר מכן, ניפצו את הרקמה עם העלי (שטופל גם ב- RNAse Zap) לאבקה.
-שופכים את האבקה לשפופרת שבה מוסיפים את הטריזול.
-עקוב אחר פרוטוקול רגיל (טריזול-כלורופורם).

בדרך כלל אני ממשיך להוסיף מעט חנקן נוזלי במכתש תוך כדי ריסוק כדי לוודא שדגימת הרקמה שלי נשארת קפואה. טכניקה זו באמת יעילה מכיוון שהרקמה נשמרת היטב.
מקווה שזה יעזור לחלקכם

דודג'ר ביום שלישי 23 בנובמבר 00:20:46 2010 אמר:

יכול להיות שזה קצת מאוחר לכתוב תשובה לשרשור הזה בגלל גילו, אבל מכיוון שהוא מוצמד.

בדרך כלל אנו מכינים 4 x 50 מ"ל צינורות. מלאו שלושה עם 40 מ"ל מים שטופלו ב- DEPC, ואחד באתנול 100%.
אחד מצינורות המים שטופלו ב-DEPC מקבל 5-10 השפרצות של RNase Zap.
בין כל דגימה, ההומוגגניסטור טובל ב-100% אתנול, מים RNase Zap, ומים מטופלים 2x DEPC בתורו.
בכל פעם הפעלת ההומוגניזר למשך כ-15-30 שניות.

זה די מהיר ונראה שעובד טוב עבורנו.

אני עושה בדיוק ככה. ההבדל הוא שמילוי שפופרת אחת (2 מ"ל) באתנול 100%, אחת עם מים מטופלים ושפריטי RNAzap ועוד אחת רק עם מים מטופלים. אני מכין את שלושת הצינורות האלה לכל דגימה. אז, לאחר ההומוגניזציה אני שוטף את קצה ההומוגניזר על הצינורות האלה ברצף זה. הדוגמא הבאה אני מחליף צינורות ומשתמשת בחדשות. הדאגה שלי היא להימנע מזיהום צולב. כמו שאמרו קודם, הרקמה מלאה ב-RNAse!


בדיקות ביו-פיזיקליות, כימיות ופונקציונליות של מבנה RNA, אינטראקציות וקיפול: חלק ב'

פרנסיס א רייס , . רוברט ט 'בייטי, בשיטות באנצימולוגיה, 2009

4.4 נתח את הגביש למחשוף RNA

התדרדרות ה- RNA באמצעות הידרוליזה של עמוד השדרה הפוספודיאסטר נתפסת בדרך כלל כמכשול להתגבשות, במיוחד בשלב ההכנה של ה- RNA שבו ההידרוליזה הבלתי מבוקרת של RNA מובילה להטרוגניות כימית. עם זאת, הידרוליזה מבוקרת של עמוד השדרה של RNA במהלך התגבשות, הידועה גם בשם "עיכול תוך טיפה", יכולה להיות יתרון. זה מקביל לפירוק פרוטאוליטי מוגבל במספר מאמצי התגבשות שמובילים לקריסטלים של מוצר פירוק (קמפבל et al., 2002 סאוואיה et al., 1994). הידרוליזה של ה-RNA נשלטת בגלל המעצורים הסטריאוכימיים של תגובת ההידרוליזה: קבוצת 2'-הידרוקסיל של סוכר הריבוז תוקפת את קבוצת הפוספט בתצורה מקוונת כדי להניב ביקוע של עמוד השדרה מיד 3' של ההידרוקסיל התוקף. קְבוּצָה. ההתקפה אינה מתרחשת עם בסיסים בסליל בצורת A או קונפורמציה מוגבלת (מכיוון שהידרוקסיל חייב להיות מסוגל לדגום את התצורה בתוך הקו) ומכאן שמתרחשת באזורים גמישים מבחינה קונפורמטיבית. אתרים של מחשוף עמוד שדרה ניתנים לפתרון בקלות על ידי סימון ה- RNA המתגבש והפרדת המוצרים על ג'ל פוליאקרילאמיד denaturing. בידוד של כל מוצר מחשוף ורצף אנזימטי חושפים את מיקומו של אירוע המחשוף.

ניהול אתרים של גמישות קונפורמטיבית כפי שמתגלה על ידי הידרוליזה מוגבלת עשוי להוביל לגבישים מתפרקים טוב יותר כתוצאה מהפרעה מופחתת של האזור הגמיש או יצירת אתר הומוגני מבחינה קונפורמטיבית של מגע סריג. גישה פופולרית היא לעצב מערכת RNA בת שני חלקים המוגדרת על ידי עמדת המחשוף. החלקים הנפרדים מטוהרים לאחר טיהור ונתונים לניסויים קריסטלוגרפיים. גולדן וצ'ק הבינו שתחום P4 – P6 מכיל מחשופים עקב התגבשות והשתמשו במערכת בת שני חלקים כאמצעי להכניס נגזרות נוקלאוטיד אטומיות כבדות על ידי סינתזה כימית של אוליגנוקלאוטיד קטן עם 5-יודיורידין (גולדן et al., 1996). ה glmS ריבוזיים (קליין ו- Ferré-D ɺmaré, 2009) והריבוסוויץ 'FMN (סרגנוב et al., 2009) השתמשו במיוחד במערכות שני חלקים כדי לשפר את יכולת ההתגבשות ורזולוציית העקיפה. במקרה של FMN, אובדן סליל מכסת הלולאה 4 אפשר מגעי סריג משופרים. בשני המקרים, השימוש במערכת דו-חלקית עשוי להקל על ריסון עמוד השדרה ולאפשר קונפורמציה חלופית שהייתה הכרחית להקמת אריזת קריסטל הדוקה יותר.


רגולטורים של איתות G-Protein, חלק ב'

פטריזיה טוסטי, קתלין דאנלאפ, בשיטות באנצימולוגיה, 2004

מיצוי RNA כולל מ-DRG של צ'יק.

כדי למנוע פירוק RNA על ידי ribonucleases אקסוגניים, יש להשתמש בכפפות ובחומר נטול RNase לאורך כל תהליך המיצוי. סך ה- RNA של נוירונים DRG מעוברי עוף בני 11 או 12 ימים (צ'ארלס ריבר SPAFAS, צפון פרנקלין, CT) מופק בשלב אחד באמצעות תמיסת חומצה של פנול/גואנידיניום טיו-ציאנאט (ריאגנט STAT-60, Tel-Test Inc ., פרינסווד, טקסס). לתיאור מפורט של נתיחת DRG מאפרוח עובריים, ראו Anantharam ו- Diversé-Pierluissi (2002). DRGs מארבעה עוברי אפרוח נאספים בצינור Eppendorf ללא RNase ומוסיפים 1 מ"ל של STAT-60. התערובת הומוגנית ביסודיות בהומוגנית זכוכית-טפלון מונעת ממונעת, הדוקה, ולאחר מכן היא נשארת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות כדי לאפשר פירוק מוחלט של מתחמי נוקלאופרוטאין. Guanidinium thiocyanate, מחולל חלבון רב עוצמה, משבית את כל הריבונוקלאזות האנדוגניות המשתחררות במהלך הומוגניזציה של רקמות. לאחר הוספת 200 μl של CH3Cl, התערובת מזועזעת במרץ למשך 15 שניות, נשארת בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה במשך 15 דקות ב -4 °. בתנאים החומציים המוכתבים על ידי STAT-60 (pH 4), ה-RNA נשאר בשלב המימי העליון, בעוד שחלבונים ו-DNA מתמקמים בממשק בין שני השלבים ובשלב האורגני התחתון, ופסולת התא אינה מסיסה. הפאזה העליונה מועברת לשפופרת חדשה ללא RNase, תוך תשומת לב קפדנית כדי להימנע מהממשק, ומוסיפים 0.5 מ"ל איזופרופנול לשפופרת. לאחר השארת התערובת בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כדי לאפשר משקעים של RNA, התהליך מושלם על ידי צנטריפוגה של הצינור ב-13,000ז למשך 15 דקות ב-4 מעלות. תגובת שיקוע מושלך, והכדור נשטף עם 1 מיליליטר של 75% EtOH כדי לסלק שאריות גואנידיניום המזוהמות, מערבולת, וצנטריפוגה ב -7500ז למשך 5 דקות ב 4 °. לאחר שפיכת תגובת שיקוע, הגלולה מיובשת חלקית באוויר למשך 10-15 דקות, תוך הימנעות מהתייבשות מוחלטת, דבר שיפחית מאוד את מסיסות הגלולה. ה-RNA מומס לבסוף במים נטולי RNase שטופלו בדיאתיל פירוקרבונט, וריכוזו וטוהריו נקבעים על ידי ניתוח ספקטרופוטומטרי.


הגנה על גנומי Picornavirus מפני פירוק RNAse בתוך האנדוזומים

מאמר המחקר, RNA Picornavirus מוגן מפני מחשוף על ידי ריבונוקלאז במהלך ציפוי וריון וריון על פני קרום הסלולר והדגם, 1 מתאר את התוצאות ממחקר שחקר כיצד ה-RNA של נגיפי פיקורנה מועבר מהנגיף אל הציטופלזמה של התא המארח ללא פירוק על ידי ריבונוקלאזים. המחקר מתמקד במיוחד בנגיף הפוליו הידוע, השייך לסוג ה- enterovirus. סיכום זה כולל מידע רקע לגבי נגיפי Picorna וכניסתם לתאי מארח, סקירה של השאלות והמודלים שהציג המחקר, ודיון בתוצאות המוצגות במאמר.

וירוסים Picorna שייכים למשפחה, Picornaviridae, המכיל שש סוגים שונים. וירוסים פיקורניים הם וירוסים קטנים ויקוסאהדראיים. אורך הקוטר של הוויריון שלהם הוא 18-30 ננומטר. הנגיפים אינם עטופים, כלומר הקפסידים של הוויריון אינם סגורים בקרום הגנה. הגנום של נגיפי Picorna מורכב מ-RNA חד-גדילי בעל חוש חיובי (+ssRNA). ה-+ssRNA פועל כ-mRNA בתאי מארח כדי לקודד פולי-פרוטאין יחיד שמתפצל מאוחר יותר לחלבונים קטנים יותר ופונקציונליים לאחר שעתוק. 2

נגיפי פיקורנה ללא מעטפת, כגון נגיף פוליו, נכנסים לתא המארח שלהם באמצעות אנדוציטוזיס בתיווך קולטן. תהליך זה מתרחש על ידי התקשרות וירון בחלבוני קולטן ספציפיים הממוקמים על ממברנות התא של התאים המארחים. פוליו -וירוסים נקשרים ל- CD155 קולטני פוליו -וירוס (PVR) של התאים המארחים שלהם. חשוב להזכיר כי ה- PVR משנים את גודל הווירונים מ- 160S ל- 135S לאחר ההתקשרות, וכתוצאה מכך גדלה 4%. 1 לאחר שנקשר לממברנת התא החיצונית של המארח, הנגיף מובא לתוך התא על ידי היפוך של קרום התא כדי ליצור שלפוחית ​​עבור הנגיף, המכונה "אנדוזום" על ידי המחברים.

במהלך התהליך האנדוציטוטי, הוויריון אינו החלקיק היחיד שהוכנס לתא המארח. הסרום שבתוכו נסע הוויריון לפני ההתקשרות של תא המארח, ואנזימים בתוך הסרום אף הם עטופים באנדוזום ונמסרים לתא. אחד האנזימים הנכללים בדרך כלל הוא ריבונוקלאז A (RNase A). ריבונוקלאזים הם אנזימים המזרזים את הפירוק וההתפרקות של מולקולות RNA. תפקידם של RNases הוא לווסת את ביטוי ה- mRNA ולהגן על התאים מפני חומצות גרעין זרות.

חשוב לציין את המשמעות של ה- RNase A כשהוא מוכנס לתאים מארחים יחד עם וירוסים הנושאים RNA. מחקר זה נועד לענות על ארבע שאלות הקשורות לאינטראקציות האפשריות בין האנדוזום, הוויריון וה- RNases במהלך העברת ה- RNA לציטופלזמה:

"א) האם ה-RNA משתחרר ממיקומים אקראיים על החלקיק, שרק 10% אקראיים מהם צמודים לממברנה?

  1. ב) האם תהליך ההתקשרות גורם לקיטוב של החלקיק כך ש-RNA משתחרר רק ממיקום סמוך לממברנה?
  2. ג) האם RNA המשתחרר לתוך לומן האנדוסומלי יכול לחצות את הממברנה כדי להגיע לציטופלסמה?
  3. ד) האם ה-RNA מוגן במהלך ההעברה על פני הממברנה מפני RNases שעשויים להימצא בלומן האנדוזומלי?" 1

לתשובות לשאלות אלה יש פוטנציאל לשפוך אור על המנגנון הלא ברור של האופן שבו ה- RNA הנגיפי של Picornavirus נכנס לציטופלזמה של תא המארח ללא התדרדרות על ידי ריבונוקלאזות.

המאמר מציג שלוש אפשרויות לטרנסלוקציה של RNA. המודל האפשרי הראשון כולל שיבוש של הממברנה האנדוזומלית כדי לשחרר את תוכן השלפוחית ​​לתוך הציטופלזמה של התא. המודל השני כרוך בשיבוש של הממברנה האנדוזומלית הנגרמת על ידי החדרת פפטידים ויראליים. המודל השלישי מציע לפפטידים אינטראקציה עם הממברנה האנדוזומה והויריון ליצירת ערוץ שדרכו ה- RNA עובר. 1 תוצאות מחקר זה מצביעות על כך ששני המודלים הראשונים אינם סבירים, בעוד שהמודל השלישי מספק הסבר סביר להעברת RNA של Picornavirus.

המחקר בדק לראשונה את יכולתו של ה- RNA הנגיפי להיות מועבר לתוך שלפוחית ​​על ידי ציפוי וירוסים. תמונות טומוגרפיות של קריואלקטרון שימשו ללכידת הכנסת ויראלי +ssRNA לתוך בַּמַבחֵנָה ליפוזום (מחקה in vivo אנדוסום). 1

הליפוזומים הכילו קולטני פוליו-וירוס על הממברנות החיצוניות שלהם כדי להקל על התקשרות הנגיף. כניסת ה- RNA הנגיפי לליפוזומים המעוטרים בקולטן תומכת ברעיון ש- RNA מסוגל לנוע בערוצים או נקבוביות, וכי הפרעה ממברנתית אינה מהווה שלב הכרחי בהעברת RNA.

המחקר מצא גם שה-RNA שעבר טרנסלוקציה בליפוזומים לא היה רגיש ל-RNase A. 1 YoPro-1 פלואורסצנטיות שימשה לניטור הקישור של חומצת גרעין בתוך ומחוץ לליפוזומים, בעוד ש-RNase A נוסף רק בחלק החיצוני של הליפוזומים. מיקרוסקופ פלואורסצנטי שימש לצפייה הישרדות RNA בנוכחות RNase A.

שימור ה-RNA הנגיפי על פני ממברנת הליפוזום בנוכחות RNase A תומך עוד בכך שנגיפי פוליו מסוגלים להעביר את הגנום שלהם על פני ממברנת שומנים ללא פירוק על ידי ריבונוקלאזים. הערוצים שדרכם נוסעים ה- RNA הנגיפיים מסוגלים להגן על חומצת הגרעין מסביבות שעלולות להיות קטלניות.

המחקר הרחיב את המחקר בניסיון in vivo ניסויים כדי לקבוע אם RNA ויראלי עבר טרנסלוקציה מוצלחת בתאים מתורבתים ומוגן מפני RNase A בדרכים דומות שנצפו ב- בַּמַבחֵנָה ניסויים. תאי הלה אוהיו נדבקו בפוליו -וירוס בנוכחות RNase A. הנוזל החוץ -תאי סומן בדקסטראנס, סמן ניאון אדום. הפוליו -וירוסים סומנו בצבע פלואורסצנטי Cy2 הניוד ירוק. כאשר הם חופפים, שני הסמנים מנצחים צהוב. תוצאות הניסוי נצפו במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

התוצאות של ה in vivo הניסוי מצביע על כך שנוזל וחומר חוץ -תאי נלקח לתא יחד עם הפוליו -וירוס במהלך האנדוציטוזה. בהנחה ש- RNases יכולים להימצא בנוזל החוץ -תאי ויכולים להיכנס לתא עם הנגיפים, האפשרות של שער מוגן שדרכו RNA ויראלי יכול לעבור לעבור כדי להימנע מהתדרדרות היא עוד יותר סבירה.

לבסוף, הזיהום של הפוליו -וירוס נבדק בעוד חלקיקי הנגיף נקשרו קוולנטית ל- RNase A. 1 הצמדה של הנגיף לריבונוקלאז הבטיחה כי ה- RNase ייכנס לתא המארח עם הנגיף. נגיף הפוליו סומן בצורה ניאון בסמן Cy2. ה-RNase סומן בצורה ניאון עם סמן DyLight-594. מיקרוסקופ הקרינה שימש להראות את האינטראקציה בין האנזימים הפוליו -וירוס ו- RNase A בתוך תא מארח. התוצאות מצביעות על כך שנגיפי הפוליו לא הושפעו מה-RNase A ועדיין היו מסוגלים להדביק את התא המארח. תוצאה זו תומכת עוד בהשערה כי החדרת RNA ויראלית מוגנת מפני התדרדרות RNase A.

תוצאות המחקר מצביעות על תשובות מניחות את הדעת לארבע השאלות שהועלו לגבי טרנסלוקציה של RNA. הניסוי מצביע על כך שלשחרור RNA יש כיווניות מסוימת, אשר יכולה להיות תוצאה של חלקיק הנגיף שהשתנה אינטראקציה ביוכימית עם הממברנה התאית. על שאלות א) ו- ב) לא ניתן לענות במלואן על פי תוצאות אלו, אך הן מהוות בסיס חזק להמשך מחקר. התשובה לשאלה ג) היא ש-RNA יכול לעבור דרך לומן אנדוזומלי, אבל בנוכחות ribonucleases, צריך להיות מוגן. התשובה לשאלה ד) היא כן, RNA מוגן במהלך ההעברה לציטופלזמה. הניסויים מצביעים על כך שבעוד ש- RNase A קיים ומסוגל לזרז את השפלת ה- RNA, הפוליו -וירוס נשאר קיימא בתוך התא המארח וממשיך בזיהום. בשלב זה, זיהום יכול להיות אפשרי רק אם ה- RNA הנגיפי מוגן מפני ה- RNases.

בעוד שתוצאות המחקר לא היו מסוגלות לענות על כל השאלות שהועלו במלוא הבהירות, המודל בו מכניסים Picornaviruses את ה- +ssRNA שלהם לציטופלסמה של התא המארח הצטמצם בצורה ברורה למדי למודל השלישי: שנוצרים תעלות המאפשרות RNA ויראלי לתרגום בבטחה לציטופלזמה. איור 1 מתאר תחזית פשוטה של ​​מודל גיבוש ערוצים זה.

איור 1. מודל פשוט של טרנסלוקציה RNA של Poliovirus בתוך תא מארח. כאשר נגיף הפוליו נקשר לרצפטור CD155 Poliovirus על ממברנת התא, אנדוציטוזיס קולט את הנגיף יחד עם RNase As בתוך הסרום החוץ תאי. נוצרת תעלה בין קרום האנדוזום לחלקיק הנגיף כדי לאפשר ל-+ssRNA לצאת מהאנדוזום ולהיכנס לציטופלזמה.

שני המודלים האחרים הכרוכים בשיבוש ממברנה עשויים להישלל במקרה זה, מכיוון שהתוצאות מראות ש-RNase A מסוגל לפרק RNA ויראלי. אם הייתה מתרחשת הפרעה ממברנה, ה- RNases היו משתחררים יחד עם ה- RNA הנגיפי לתוך הציטופלזמה, ושם היה פוגע ב- RNA לפני שתעתיק ימשיך. בהתבסס על התוצאות ממחקר זה, RNA של picornavirus חייב להיות מוגן בכל עת מפני RNase A כדי להדביק בהצלחה את המארחים הסלולריים שלו.

המחקר מודה שעדיין יש ויכוח על האופן שבו יכולות להיווצר תעלות חלבון בין חלקיקי הנגיף לבין הממברנה האנדוזומלית. עם זאת, מחקר זה מספק בהירות מסוימת לגבי האופן שבו נגיפי Picorna מעבירים את +ssRNA שלהם כדי להדביק את המארחים שלהם. מחקר זה הניח את הבסיס למחקר נוסף שייעשה כדי לנסות לקבוע את המנגנונים של הגנה על RNA ויראלי כאשר הוא מועבר לציטופלזמה של התא המארח.


נתונים משלימים

קובץ זה מכיל שיטות משלימות, טבלאות משלימות 1–5, איורים משלימים 1–11 והפניות משלימות. (PDF 1486 kb)

סרט משלים 1

סרט זה מציג מבט עולמי על 13 מולקולת ה- RNA הנוקלאוטידים הקשורה למוטציה RNase II D209N, עם RNA במקלות צבעוניים מכחול לאדום בהתאם לפרמטרי התזוזה האטומית הגוברת שלהם, ועם האנזים המצויר על ידי תחומים, כלומר CSD1 בצהוב, CSD2 בכתום, RNB בציאן ו- S1 בירוק. (MPG 6702 kb)

סרט משלים 2

סרט זה מציג מבט עולמי על 13 מולקולת ה- RNA של נוקלאוטידים הקשורים למוטציה RNase II D209N, כאשר RNA במקלות צבעוניים מכחול לאדום בהתאם לתזוזה האטומית ההולכת וגדלה שלהם. , כלומר באזור העוגן, דרך נוקלאוטידים הביניים הגמישים, וב-5 נוקלאוטידים הטרמינליים של RNA מהודקים בין שיירים ארומטיים שמורים, בחלל הקטליטי. (MOV 6291 kb)


השוואה של דעיכה של mRNA ופירוק RNA יציב

בהתבסס על הדיון לעיל, ברור כי ריקבון mRNA ופירוק RNA יציב חולקים תכונות משותפות רבות. לפיכך, התהליכים הכוללים, הכוללים מחשופים אנדונוקליאולטים ראשוניים ואחריהם עיכול אקסנוקלאוליטי של השברים המתקבלים דומים להפליא ל- mRNA ו- rRNA (עדיין לא ידוע אם למחשופים אנדונוקלאוליטים תפקיד כלשהו בבקרת איכות של tRNA פגום) (איור 2). מה ששונה בשני התהליכים הוא שדעיכת ה-mRNA היא היבט מתמשך של חילוף החומרים בתאים, בעוד שפירוק rRNA מתרחש רק בתנאים מיוחדים. מה מייצב rRNA במהלך צמיחה תקינה, בניגוד ל- mRNA, אינו ברור, אך סביר להניח שזה נובע מהקשר שלו לחלבונים ריבוזומליים בחלקיק RNP יציב המונע נגישות ל- RNases. עם זאת, אם ריבוזום מורכב בצורה לא נכונה כך שה- rRNA אינו מוגן במלואו, התדרדרות תתרחש ותביא למה שאנו מכנים בקרת איכות (18). זה יספק מנגנון פשוט להסרת ריבוזומים פגומים. התהליך במהלך הרעב המוביל להידרדרות ה- rRNA אינו מובן, אך סביר להניח שהוא נובע משינוי כלשהו במבנה הריבוזום שגורם לנגישות מוגברת ל- RNase. באותם מצבים שבהם פירוק rRNA נובע מכניסת RNase I לתא, גודלו הקטן (27 kDa) כנראה מאפשר לו לפעול על rRNA בתוך מבנה הריבוזום, שכן ריבוזומים רגישים ל-RNase I בַּמַבחֵנָה ( 50 ).

אולי הדמיון הברור ביותר בין ריקבון mRNA לבין השפלה יציבה של RNA הוא שאותם RNases משתתפים בשני התהליכים (איור 2). זה בולט ביותר עבור האקסוריבונוקלאזות, ואין זה מפתיע ששלושת המשתתפים העיקריים, PNPase, RNase II ו-RNase R, פועלים כולם באופן תהליכי, מכיוון שזו תהיה הדרך היעילה ביותר לפירוק שברי RNA. כמו כן, מה שעלה ממחקרים שונים הוא שמבנה ה- RNA הוא לא סוג ה- RNA (mRNA או RNA יציב) שקובע אילו RNases ישמשו להתדרדרות. לפיכך, נראה כי PNPase ו- RNase R הם המשפילים לכל מטרה של RNAs בעלי מבנה משני, בין אם מדובר ברכיבי mRNA REP (15), tRNAs פגומים (32) או שברי rRNA (18), בגלל יכולתם לעכל כאלה מולקולות. כאשר יש צורך לפרק רצועות ארוכות של RNA לא מובנה, RNase II יהיה כנראה התורם העיקרי ב אי - קולי בגלל פעולתו המהירה על מולקולות כאלה ונוכחותה בתאים ברמות גבוהות (22). באופן דומה, oligoribonuclease הוא האנזים העיקרי שמסיר שאוליגנונוקלאוטידים שנוצרים במהלך פירוק ה- RNA מכיוון שהוא ה- RNase היחיד שיכול לעשות זאת ביעילות (29).

דמיון נוסף בין ריקבון mRNA לבין התדרדרות RNA יציבה שהיתה בהתחלה די מפתיעה היא המשמעות של פוליאדנילציה עבור שני התהליכים. נוכחותם של זנבות פולי(A) על mRNA, וגם על שברי mRNA, הוכחה בבירור, וחשיבותה לדעיכה של mRNA in vivo הוכח (51). עם זאת, מה שהיה בלתי צפוי הוא שמבשרי RNA יציבים צוברים גם זנבות פולי(A) כאשר לא ניתן להבשיל אותם (52), ושזנב הפולי(A) נחוץ להסרה יעילה של tRNA פגום in vivo (32). ידוע גם כי rRNA לא שלמים יכולים לצבור זנבות פולי (A) (53), אך עדיין לא הוכח תפקידם בהידרדרות rRNA. עם זאת, תפקיד כזה היה צפוי מכיוון שעכשיו מובן כי זנבות פולי (A) משמשים כאתר כריכה חד-גדילי נדרש לכל אחד משלושת האקסוריבונוקלאזות הפחתות, PNPase, RNase II ו- RNase R (15). אף אחד מהאנזימים הללו אינו מסוגל לפעול על מולקולת RNA דו-גדילית לחלוטין או אפילו כזו עם זנב קצר של 3′, ככל הנראה בשל חוסר יכולתם לקשור את הסובסטרט (15). החשיבות של זנב חד-גדילי לקשירת האנזים אושרה כעת ישירות עבור RNase R על ידי ניסויים של קישור RNA (H. Vincent ו-M.P. Deutscher, נתונים שלא פורסמו).

תכונה אחת של פירוק RNA שצריך להבהיר כדי להשוות באופן מלא את ריקבון mRNA ופירוק RNA יציב היא לזהות את האנדוריבונוקלאזים המעורבים בפירוק RNA יציב ולהעריך את תפקידו של הדרוגוסום בכל תהליך. בהיעדר PNPase ו-RNase R, תאים צוברים כמויות גדולות של מקטעים שמקורם ב-16S ו-23S rRNA (18). עם זאת, האנדוריבונוקלאז האחראי על יצירת השברים הללו לא זוהה. באופן דומה, שברים שמקורם ב-mRNA המכילים אלמנטים REP מצטברים גם בתאים חסרי PNPase ו-RNase R (15). עם זאת, ידוע שקטעים אלו נוצרים על ידי RNase E, כחלק מהדגרדוזום (11). המשך הרעיון של מנגנונים משותפים לכל השפלת ה- RNA, לא יהיה מפתיע אם RNase E או RNase G ממלאים תפקיד דומה בייזום השפלה של rRNA. למעשה, אנזימים אלה הוכחו כמשתתפים בהתפרקות הריבוזום ב-an בַּמַבחֵנָה מערכת (M. Zundel ו- M. P. Deutscher, נתונים שלא פורסמו).

אם RNase E מעורב בפירוק RNA יציב, נשאלת השאלה האם הוא עושה זאת כחלק מהדגרדוזום, כמו בפירוק mRNA. זה ידוע כי RNase E יכול לתפקד כמעט באופן רגיל עבור התבגרות rRNA 5S גם בהעדר היווצרות דגרגוזום (10), דבר המצביע על כך שהדגרוזום אינו נדרש לכל הפעולות של RNase E. מצד שני, אפילו אובדן קטן בעיבוד ליעילות עשויה להיות השפעות עמוקות על הצמיחה בתנאים טבעיים. בהתחשב בתפקיד של הדרוגוסום בפירוק RNA יציב, מעניין לציין כי הרכב החלבון של אי - קולי שינויים דגרדוזומים לפחות במצב סטרס אחד, הלם קור, המוביל להחלפת ה-RNA helicase, RhlB, בהליקאז אחר, CsdA (54). מכיוון ששני אנזימים אחרים המעורבים בהסרת RNA יציבה, PNPase ו-RNase R, מוגברים מאוד במהלך הלם קור (25, 27, 28), נתונים אלו מצביעים על כך שמצב מתח זה עשוי להשפיע על יציבות ה-RNA. השינוי הנלווה בדרוגרוזום תומך בהשתתפותו, וכך גם ביכולתם של דגרדוזומים מבודדים לפגום ב- rRNA בַּמַבחֵנָה (31). לפי קווים אלה, מסקרן שהדגרדוזום נמצא ב Pseudomonas syringae Lz4W מכיל RNase R במקום PNPase (55). זה גם מעניין שעבודות אחרונות אחרות מצביעות על כך שהדגרדוזום עשוי להשתנות בהרכבו בתגובה לסביבה (9), ושניתן לתכנת את RNase E לדעיכה של RNAs ספציפיים על ידי חיבור עם RNAs קטנים ולא מקודדים (56). כל המידע הזה מצביע על כך ש- RNase E עשוי להיות חלק ממתחמי RNP מרובים, ושדרוגוסום ה- RNA הוא רק אחד מהם.


חומרים ושיטות

בניית וקטור ביטוי

הגן RNase R באורך מלא הוגבר על ידי PCR מ אי - קולי BL21 (DE3) באמצעות הפריימר קדימה: 5'-GGGATATCCATATGTCACAAGCTTTCCAG-3' והפריימר ההפוך: 5'-CCGGAATTCTCACTCTGCCACTTTTTTCT-3'. RNase R ΔHTH-K הקטוע (שאריות 87 עד 725) הוגבר מהגן באורך מלא באמצעות פריימר קדימה: 5'-GGGAATTCCATATGGTACCGTTATTGGCCACC-3 'והפריימר ההפוך: 5'-CCGCAATTCTCAGATCAGGCTAAAGTCGATT תוצרי ה-PCR הוכנסו לאתרי EcoRI/NdeI של וקטור הביטוי pET-28a (Invitrogen) כדי לייצר חלבונים עם תגי N-terminal 6xHistidine. מוטאנטי הטריז RNase R Δ3H ו-1H נבנו על ידי תגובת שרשרת פולימראז חופפת (OE-PCR) (31). עבור Δ3H, שברים עם שאריות 487-545 נמחקו באמצעות הפריימרים 5'-TTCCGTATTCACGACGGCAGCCAGGCGATTTACGATCCACAAAACC-3 'ו- 5'-CTGCCGTCGTGAATACGGAACAGTGCCGGTTCTTTCGCT. עבור מוטציה 1H, OE-PCR בוצע בשני שלבים תחילה, שאריות 524–535 ב- RNase R הוחלפו בשאריות 458–465 של RNase II ולאחר מכן שאריות 536–545 ב- RNase R הוחלפו על ידי שאריות 466–473 של RNase II. פריימרים המשמשים את הצעד הראשון היו 5'-GCGGAGCTGCTGGAGGCGCAACCAACTGGTTTCCTCGACCAGGCGATTTACGATCC-3 '5'-GGATCGTAAATCGCCTGGTCGAGGAAACCAGTTGGTTGCGCCTCCAGCAGCTCCGC-3 ", ואילו פריימרים המשמשים את הצעד השני היו 5'-ACTGGTTTCCTCGACAGCCGCATTCGTCGCTTCCAGTCACAGGCGATTTACGATCCAG-3' 5'-CGGCTGTCGAGGAAACCAGTTGGTTGCGCCTCCAGCAGCTCCGC-3 '.

ביטוי וטיהור חלבון

כל המבנים הומרו ל אי - קולי תאים (BL21) (Stratagene) מודגרים ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר OD600 הגיעו ל -0.6, ביטוי חלבון נגרם באמצעות 1.0 מ"מ IPTG ודגירת לילה ב -18 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, תאים נאספו והושפו מחדש במאגר A (25 mM Tris-HCl, pH7.5, 500 mM NaCl, 5-10 mM imidazole, 5 mM beta-ME, 1 mM PMSF), ואז נקרע על ידי מיקרופלואידיזר (Microfluidics M-110P). תגובת שיקוע הוחל על עמודת HisTrap HP (GE HealthCare) לפני שיוונו אותו באמצעות חיץ A. חלבונים כבולים חולקו באמצעות שיפוע אימידאזול בין מאגר A למאגר B (20 מ"מ טריס - HCl, pH 8.0, 500 מ"מ NaCl, 300 mM imidazole). שברי חלבון מגולפים שולבו ו (NH4)2לכן4 נוספה עד 1.5 M. דגימות חלבון הועמסו לתוך עמודת פניל ​​הפוכה (GE HealthCare) מאוזנת על ידי חיץ הפניל (25 mM Tris-HCl pH 8.0, 1.5 M (NH)4)2לכן4). חלבונים הורחקו לאחר מכן בשיפוע של 1.5 עד 0 M (NH4)2לכן4. The purified RNase R was concentrated and applied to a gel filtration column (GE HealthCare, Superdex 200 Increase 10/300 GL) in a running buffer of 20 mM Tris–HCl, pH 7.5 and 400 mM NaCl. Collected protein samples were concentrated to ∼15 mg/ml and stored at –20°C.

Crystallization and structure determination

RNase R was crystallized by the hanging-drop vapor diffusion method at room temperature by mixing 1 μl of protein sample (15 mg/ml RNase R ΔHTH-K, 20 mM Tris–HCl, pH7.5 and 400 mM NaCl) and 1 μl reservoir solution (modified from Hampton PEG/Ion 2 Screen, number 14: 8% Tacsimate, pH6.0 and 15% Polyethylene glycol 3350). X-ray diffraction data were collected at BL-13C1 at the National Synchrotron Radiation Research Center (NSRRC), Hsinchu, Taiwan, and the collected data were processed and scaled by HKL2000 ( 32). The structure was solved by the molecular replacement method using yeast Rrp44 (PDB id: 2VNU) as the search model by the AutoMR function in the program Phenix ( 33). The structure model was built using Coot and refined by Phenix, containing two RNase R molecules in the asymmetric unit. Disordered regions not built in the model included residues 102–105, 132–136 and 428–431 in chain A molecule, and residues 101–105, 127–137 and 429–431 in chain B molecule.

RNase activity assays

For the RNA degradation experiments shown in Figure 1C, RNase R proteins (100 nM), including the full-length RNase R, RNase R A131V, RNase R D280N, ΔHTH-K and ΔHTH-K A131V, were incubated with the dsRNA (2.5 nM) at 37°C for 0–60 min in a reaction buffer containing 20 mM Tris–HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 1 mM DTT and 0.25 mM MgCl2. The dsRNA was prepared by annealing a 5′-end 32 P-labeled 20-nucleotide RNA with a sequence of 5′-GUUGAGAGAGAGAGAGAGUUUG-3′ with a 10-nucleotide RNA with a sequence of 5′-CUCUCUCAAC-3′ to generate a 10-basepair dsRNA with a 10-nucleotide 3′ overhang. The RNA degradation reactions were stopped by adding 2× urea loading dye (Thermo) at different time points (0, 15 and 60 min) and the samples were loaded on a 20% TBE–urea denaturing gel for gel-eletctrophresis shown in Figure 1C.

For the RNA degradation experiments shown in Figure 3, the 5′-end 32 P-labeled single-stranded RNA (ssRNA_40, 2.5 nM, 5′-GCUGUCUAGAGACUAUCGAUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU-3′) and the stem–loop RNA with a 20-nt 3′ overhang (slRNA_20, 2.5 nM, 5′-GGCCCGCGAAAGCGCGGGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′) were incubated respectively with RNase R proteins (100 nM) in 10 μl of a reaction buffer containing 20 mM Tris–HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl, 0.25 mM MgCl2 and 1 mM DTT at 37°C. The RNA degradation reactions were stopped by adding Novex® TBE-Urea Sample Buffer at the indicated times, 0–60 min. RNA degradation patterns were analyzed by 7.5 M urea/20% (w/v) polyacrylamide denaturing PAGE which was exposed on a FujiFilm Image plate and detected by Typhoon FLA 9000 (GE HealthCare).

RNA binding by fluorescence polarization assays

RNA binding by RNase R was determined by measuring the changes in fluorescence polarization using a Paradigm plate reader (Molecular Devices). The RNA with a sequence of 5′-Cy3-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3′, labeled at the 5′-hydroxyl group with Cyanine-3 (MD-Bio) at a 10 nM final concentration was titrated with the indicated concentrations of RNase R in binding buffer (50 mM Tris–HCl pH 7.5, 100 mM NaCl and 25 mM EDTA). Reactions were prepared at 37°C and incubated for 15 min, then read at 595 nm at an excitation of 535 nm. The RNA-binding affinities of different RNase R mutants were calculated by fitting the plot shown in Figure 4 to a one-site saturation-binding model using SigmaPlot ( 34).


Dance of the RNases: Coordinating the removal of RNA-DNA hybrids

שני צוותי מחקר בראשות הפרופסורים בריאן לוק והל אולריך במכון לביולוגיה מולקולרית פיענחו כיצד שני אנזימים, RNase H2 ו- RNase H1, מתואמים להסרת מבנים היברידיים של RNA-DNA מכרומוזומים. כלאיים של RNA-DNA חשובים לקידום פעילויות תאים תקינות כמו ויסות גנים ותיקון DNA, אך מספר רב מדי מהווה גם סיכון לפגיעה ב- DNA ויכול להוביל למחלות ניווניות ולסרטן. במאמר שלהם, שפורסם היום ב- דוחות תאים, Brian and Helle show that the enzyme RNase H2 removes RNA-DNA hybrids primarily after DNA replication. כל שאר מבני ה- RNA-DNA מוסרים לאחר מכן על ידי RNase H1, הפועל ללא תלות במחזוריות התא.

DNA נמצא בדרך כלל כמבנה יציב דו-גדילי. עם זאת, דנ"א לפעמים גם מתקשר עם RNA ליצירת מבנים היברידיים של RNA-DNA המסדירים את ביטוי הגנים ותיקון ה- DNA. לולאות R הן סוג מיוחד של היברידית RNA-DNA שבה גדיל RNA נקשר לגדיל אחד של מולקולת DNA ודוחף החוצה את גדיל ה-DNA השני כך שהוא נחשף כלולאה חד-גדילית. לולאות R יכולות לווסת את פעילות הגנים, אך גם הופכות במהירות למסוכנות מכיוון שהסרה לא נכונה עלולה לפגוע ב-DNA, שעלול לגרום למוטציות. Therefore, excess R-loop formation can be toxic for cells -- indeed, mutations in R-loop removal proteins are known to contribute to neuroinflammatory diseases and cancer.

הסרת לולאת R מזורזת על ידי האנזימים RNase H1 ו-RNase H2, אשר מפרקים את גדיל ה-RNA. בנוסף, ל-RNase H2 יש גם יכולת משנית לכרות ריבונוקלאוטידים בודדים, שלעיתים יכולים להשתלב בטעות ב-DNA על ידי פולימראזות בתהליך המכונה תיקון חיתוך ריבונוקלאוטידים (RER). מחקרים קודמים הראו שמוטציה של RNase H2 שיבשה את יציבות הגנום יותר ממוטציה של RNase H1, מה שמצביע על כך של-RNase H2 יש תפקיד חשוב יותר בשמירה על יציבות הגנום. עם זאת, מעולם לא הובן עד כמה האנזימים החשובים הללו מתואמים.

כדי לנתח את התפקידים המובהקים של RNase H1 ו-H2 בהסרת לולאת R, מעבדת לוק הנדסה שמרים לבטא את RNase H1 ו-H2 רק בשלבים ספציפיים של מחזור התא ולאחר מכן חשפה אותם למתיל מתאן-סולפונט (MMS), חומר שמגדיל היווצרות לולאת R. רק שמרים שיכולים להסיר ביעילות לולאות R ישרדו, בעוד אלו עם הסרת לולאות R לקויה לא ישרדו.

בתמיכת מעבדת Ulrich, הם מצאו כי שמרים המבטאים RNase H2 אך ורק במהלך G2 ('שלב הצמיחה' של מחזור התא בעקבות שכפול ה-DNA) היו עמידים ל-MMS, בעוד ששמרים המבטאים RNase H2 רק במהלך שלב S (שלב שכפול ה-DNA) ) היו רגישים יותר. זה הציע ש- RNase H2 פועל בעיקר לעיבוד לולאות R במהלך G2. לעומת זאת, שמרים המבטאים את RNase H1 בשלב G2 או S הצליחו שניהם לשרוד ב- MMS. באופן מפתיע, ביטוי RNase H2 בשלב S גרם למעשה לפגיעה נוספת ב- DNA, מה שדרש תיקון DNA מיוחד הנקרא רקומבינציה הומולוגית. מסלול זה לא היה ידוע בעבר כפועל במהלך שלב S. לכן, ייתכן שמחקר זה חשף מסלול תיקון שלא נחקר אשר מונע נזקים הנגרמים על ידי פעילות RNase H2 במהלך שכפול DNA.

תוצאות אלו עשויות להסביר מדוע התאים פיתחו שני אנזימי RNAse H שונים. Brian Luke clarifies: "We think that RNase H2 is the 'housekeeping' enzyme that repairs the majority of RNA-DNA hybrids, but it is strictly regulated by cell cycling and acts only in G2 phase, or after DNA replication." Brian and Helle speculate this may be because the additional RER activity of RNase H2 creates nicks in the DNA, which are a risk for double-strand breaks during DNA replication in S phase. לכן, ייתכן שהתאים פיתחו גם אנזים משני, RNase H1, שאין לו פעילות RER ויכול לפעול בכל שלבי מחזור התא, כולל שלב S.

ממצאים אלו עוזרים לנו להבין יותר כיצד תאים מתקנים נזקי DNA הקשורים להיברידי RNA-DNA וכיצד פגיעה בתהליך זה תורמת למחלה.


האם חיטוי מספיק כדי להיפטר מ RNAses מקצות פיפטה ומצינורות אפנדורף?

אני מקבל תוצאות עקביות עקביות עם עקירות RNA ואני חושד בזיהום RNAse. סביבת העבודה שלנו נקייה מאוד, אבל עכשיו אני מודאג לגבי הצינורות והטיפים שלנו. האם חיטוי מספיק כדי לחסל RNAses מאלה, או שישנן שיטות נוספות לשמור אותן ללא RNAse?

לא. הזמינו קצות פיפטה וצינורות ללא RNAse. נקה הכל, כולל הכפפות שלך, עם RNAseZap, לפני שאתה מושיט יד לתוך השקיות כדי לקבל צינורות/טיפים. RNAse זאפ גם על הפיפטות. אל תנשום אפילו על הצינורות/הטיפים. שמור אותם באזור מיוחד ללא RNAse כאשר אינם בשימוש. RNAse מופעל הכל. השתמש גם במים שטופלו ב- DEPC.

עריכה - שימוש מְסוּנָן גם טיפים. אני מבטיח שאתה מרסס RNAse לתוך הדגימה שלך אם אתה לא.

אנחנו קונים צינורות נטולי RNase/DNase ועדיין עושים אותם בחיטוי. הם נמזגים מהשקית הגדולה לתוך מיכלים ומפוחחים. טיפים לסינון הם גם נטולי RNase/DNase אבל לא עוברים חיטוי.

אנו משתמשים בערכות Qiagen לחילוץ RNA. הצינורות והמים היחידים המשמשים בפרוטוקול זה מגיעים עם הערכה, כך שאינך צריך לדאוג לוודא שהצינורות שלך נטולי RNase או DEPC מטפלים במים שלך (לפחות לא לצורך החילוץ. אם אתה מבצע ניסויים במורד הזרם

הדבר היחיד שאני RNaseZap לפני חילוץ RNA הוא קצה הרוטור-סטאטור שדווקא נכנס לצינור עם הרקמה בתוכו. אני יודע שיש אנשים שמרססים על שולחן העבודה שלהם, עם הכפפות שלהם, יש להם ספסל מיוחד של RNA וכו '. אין לנו דבר כזה ואין לנו בעיות.

זֶה. עבד עם RNA בשנתיים האחרונות. כל הטיפים החדשים נדרשו לעתים קרובות למדי, עם מסננים, פיפטות מיוחדות ואזור מיוחד רק לטיפול ב- RNA. הכל (פיפטות, ספסל, מלקחיים וכו') כל שבועיים. הוסיף מעכבי RNase לכל דבר שהיה מאוחסן לכל פרק זמן. מים שטופלו ב-DEPC הם גם נחמדים, אבל מכיוון ש-DEPC הוא די מסוכן, שמרנו אותם לשלבים החשובים ביותר.

כמו כן, לעולם אל תעשה חיטוי של הטיפים המסוננים. ברגע שהם משמשים לזרוק אותם.

מעניין, הקבוצה שלנו עובדת כמעט אך ורק עם RNA, יש לנו פיפטות נפרדות עבור RNA ועבודות אחרות, אך משתמשים אך ורק בקצות חיטוי (ללא מסנן) ובצינורות מיקרופוגה. מים בחיטוי גם מעולם לא הוכחו כבעיה. אנו מקבלים תשואות גדולות של RNA שלם.

ועכשיו אני מכיר את התוספת החדשה ביותר לקיר שמאחורי מכונת qPCR.

גיליתי שאתנול או פנול שיורי הם הגורם השכיח ביותר לתשואות RNA ירודות.

אני מסכים. נראה כי RNase הוא איש בוגי ועם השנים הורדתי בהדרגה את אמצעי הזהירות שלי נגד RNase עד לנקודה שבה אני אפילו לא חושב פעמיים בעת המעבר מעבודת ביולוגיה מולקולרית סטנדרטית הקשורה ל- DNA לעבודה ב- RNA. מעולם לא הבחנתי בשפלת מדגם מסתורית. אני משתמש במים היוצאים היישר ממערכת מסוג MilliQ ובטיפים רגילים, ללא פיפטות מיוחדות וכו '.

אני כבר לא עובד במעבדת מחקר, אבל אני זוכר שחלק מהאנשים למעשה חינמו את ה- RNase שלהם בכדי לחטא אותו וזה עדיין עבד לאחר מכן. אז אני לא חושב ששיטה זו שימושית למעשה לחסל RNases. ישנם כמה מוצרים לטיהור סביבת העבודה למרות שזה לא נראה כמו הבעיה שלך.

אחד הפוסט-דוקטורים הגרמניים שלנו אמר לי פעם שלא, חלק מה- RNases יכולים לשרוד חיטוי (מה שהכעיס אותי). אני עובד במעבדת RNA וזה מלוכלך בצורה מגעיל, אבל אנחנו פשוט משתמשים בצינורות/טיפים באיכות טובה ונותנים תרסיס של RNase פה ושם. מעולם לא היו לנו בעיות זיהום.

אם אתה עדיין נתקל בבעיות פשוט לזרוק הכל ולהתחיל מחדש.

אנשים מדברים הרבה על המקורות החיצוניים של זיהום RNAse, אבל זה זעום בהשוואה ל- RNAs שכבר קיימים ברקמה ממנה אתה מפיק. איך אתה מחלץ את ה-RNA? ישנן מספר שיטות, האהוב עלי הוא הקפאה בהקדם האפשרי בחנקן נוזלי, וטחינה לעיסה דקה (שמירה מתחת להקפאה עם נוזלי N) וערבוב הדבק עם מאגר מיצוי גואנאדיניום טיוציאנאט/פנול (כלומר משהו כמו TriZol).

אם אינך משתמש בשיטה דומה, מה מכיל מאגר החילוץ שלך כדי לעכב/לטשטש את ה-RNAses? שני המאגרים בהם אני משתמשת באופן קבוע מכילים SDS או פנול - פנול הוא האהוב עלי.

tldr: המקור הגדול ביותר שלך ל-RNAses הוא לא אתה, הספסל שלך או הציוד שלך כשאתה עובד ממקור של RNA (אלא אם כן אתה מתמלל אותו בעצמך כמובן). המקור הגדול ביותר של RNAses הוא הרקמה/חיה שממנה אתה שואב RNA.


צפו בסרטון: Enzymatic Hydrolysis of Phosphodiesters (נוֹבֶמבֶּר 2022).