מֵידָע

הערכת סל"ד ל- RCF בשיטות מתוך ניירות ישנים יותר

הערכת סל


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

אני מנסה לשכפל שיטת ביולוגיה של התא משנת 1958 חקירת מעבדה עיתון. הפרוטוקול מיועד לבידוד של חלבון מטריקס חוץ-תאי, ושלב מפתח הוא צנטריפוגה המתבצעת במשך שעתיים ב-2300 סל"ד. ככל הנראה לא היה נוהג נפוץ לרשום את יצרן, הדגם וגודל הרוטור של צנטריפוגות, אז אני קצת אבוד באילו הגדרות להשתמש בצנטריפוגה שלי כדי לקבל את אותו rcf.

האם ישנן נקודות התחלה טובות להערכת ההגדרות הנכונות? לְמָשָׁל מי היו ספקי הצנטריפוגות הגדולים באותה תקופה או אילו מודלים ייראו כ'סטנדרטים' עבור מעבדה לביולוגיה של תאים?


אני לא בטוח במה הם השתמשו בשנת 1958 (אולי Sorvall). עם זאת אתה יכול להסתכל במאמרים האחרונים לבידוד חלבון ECM (אם זו הייתה המטרה שלך).

עיין במאמר זה.

מחומרים ושיטות:

בידוד חלבון ECM.

Fibroblasts או תאים A431 הוסרו מפני השטח של צלחת התרבות עם 2 מ מ EDTA ב- PBS למשך 3-5 דקות ב 37 ⁰. תאים מנותקים נזרקו, וחלבוני ECM הנותרים המחוברים לפני השטח של צלחות התרבות נשטפו באותו פתרון. הסרת התאים הייתה מבוקרת תחת המיקרוסקופ. לאחר הסרת התאים לחלוטין, חלבוני המטריצה ​​היו מכוסים בחומצה אצטית של 5% והודגרו בטמפרטורה של 4⁰C למשך הלילה. לאחר מכן, חומצה אצטית הוסרה והוחלפה במאגר המכיל 125 מ"מ טריס- HCl, pH 6.8, 0.1% SDS, 10% גליצרול, 1% DDT, 0.05 מ"מ PMSF, קוקטייל מעכב פרוטאז (רוש, גרמניה), והודגרו ב 37 ⁰C למשך 1 שעה. חלבונים הוסרו בעזרת מגרד. ההליך חזר על עצמו שלוש פעמים. כל תמציות החלבון, כולל חומצה אצטית, אוחדו וחלבוני ECM הופרעו בחמישה אמצעי אצטון. לאחר הדגירה ב -20 ⁰ לילה וצנטריפוגה ב -7000 גרם למשך 15 דקות, כדורי החלבון מומסו במאגר מתאים לניתוח נוסף על ידי אלקטרופורזה ג'ל חד-ממדית.

בנוסף, השגנו חלק מסיס של Triton X-100 של חלבוני ECM. תאים הוסרו כמתואר לעיל; המנות התמלאו בטריטון X-100% והודגרו בטמפרטורה של 37 ⁰ למשך 30 דקות. המיצוי חזר על עצמו שלוש פעמים. ההליך הבא של מיצוי ECM היה זהה למתואר לעיל. דוגמאות שהתקבלו משני השברים מומסו במאגר לאלקטרופורזה חד-ממדית (Laemmli) או דו-ממדית (חיץ התייבשות המכיל 8 M אוריאה, 2% CHAPS, 20 מ"מ DDT, 0.1% טריטון X-100). חלבונים שנשארו לאחר מיצוי טריטון X-100 מומסו במאגר הדגימה של Laemmli.


מיקרו צנטריפוגה מעשית תוצרת בית לצורכי הוראה

אנו מדווחים על מיקרוצנטריפוגה מעשית תוצרת בית שתשמש לצורכי הוראה. זה נעשה באמצעות ספינר סלט ושני מתלים לצינורות תגובת שרשרת פולימראז (PCR). הוא יכול להכיל 2 צלחות בגודל סטנדרטי של 96 בארות או 24 רצועות או עד 192 צינור מיקרופוגה. הצנטריפוגה מופעלת ביד ואידיאלית למטרות ספין-און קצרות. ביוכימיה וחינוך לביולוגיה מולקולרית כרך. 39, מס '4, עמ' 298-299, 2011

צנטריפוגה היא אחת מטכניקות המחקר החשובות והמיושמות ביותר בביוכימיה, ביולוגיה תאית ומולקולרית. הצנטריפוגות המעבדתיות משמשות לבידוד והפרדה של מוצקים מנוזלים בתרחיף. כלי הצנטריפוגה רבים, ועשויים לכלול שקיעה של תאים ווירוסים, הפרדת אברונים תת -תאיים ובידוד מקרומולקולות כגון DNA, RNA, חלבונים או שומנים. צנטריפוגה מעבדה כוללת בדרך כלל רוטור המכיל שתיים, ארבע, שש או בארות רבות יותר ממוספרים שבתוכם ניתן למקם צינורות צנטריפוגה. ישנם סוגים שונים של צנטריפוגות, בהתאם לגודל וקיבולת המדגם. במעבדה לביולוגיה מולקולרית נפוצים שלושה סוגים של צנטריפוגות. אולטרה צנטריפוגה, שמאיצה עד 70,000 סל"ד. צנטריפוגה גדולה המהירה עד כ-20,000 סל"ד ויכולה לקחת צינורות בגדלים שונים, בהתאם לרוטורים ולמיקרו-צנטריפוגות המהירה עד 12 או 13 סל"ד ומיועדת לסחרור צנטריפוגה פלסטית של 0.2 עד 2 מ"ל. צנטריפוגות קטנות אלו נוחות מאוד לסובב כמויות קטנות של חומר במהירות נמוכה ובינונית.

רוב הפרוטוקולים של ביולוגיה מולקולרית עושים שימוש במיקרוצנטריפוגה ולכן, לרוב תרגילי המעבדה יש ​​צורך במיקרוצנטריפוגה [1-3]. ניסויים שונים כמו PCR ומיקרו -מערכים דורשים מיקרוצנטריפוגה המשמשת לסובב כמויות קטנות של DNA תבנית בתוספת רכיבי תגובה אחרים. עם זאת, זהו ציוד יקר עבור מעבדת הוראה. המיקרוצנטריפוגות הזולות יותר הן זעירות ונוחות, בעלות קיבולת קטנה, 6-12 צינורות מ-0.2 עד 2 מ"ל ובדרך כלל נדרשו שימוש במתאמים. לרוב אותם צנטריפוגות ספסלות אישיות אין רוטורים או מתאמים הניתנים להחלפה לרצועות צנטריפוגה או או צלחות 96 בארות ולכן יש להשתמש בצנטריפוגה גדולה ויקרה יותר למטרה זו. לא תמיד יש את הצנטריפוגות היקרות והגדולות יותר במעבדה, לא מסיבות כלכליות ו/או מכיוון שהספסל מלא בחומרים. כדי להתגבר על היעדר צנטריפוגה מתאימה במעבדת הסטודנטים המונעים לבצע סוגים מסוימים של ניסויים, עיצבנו צנטריפוגה זולה ותפעולית, שניתן להשתמש בה לקיצור צינורות PCR, רצועות וכן צלחות עם 96 בארות.

הצנטריפוגה הורכבה באמצעות החומרים הבאים: ספינר לסלט, שני מתלים לצינורות PCR ושתי גומיות להצמדת המתלים למסננת הפנימית (ראה איורים 1 ו-2). כדי להפעיל את הצנטריפוגה, פשוט הכנס את האמבטיות למדפים, סגור את המכסה וסובב אותו. חמישה או שישה סיבובים יספיקו כדי לסובב נוזלים. הצנטריפוגה יכולה לסובב רק נוזלים, לא מוצקים, והיא יעילה כמו "ספין קצר" שנעשה בצנטריפוגה מסחרית. כדי לבחון טענה זו, נערך ניסוי מקדים במעבדת המחקר שבו זמין צנטריפוגה מסחרית, המסוגלת לצינורות צנטריפוגה ולוחות PCR. עשינו הגברה PCR של מיקרו-לוויינים, שזה הניסוי שמתבצע בתדירות גבוהה יותר במעבדה שלנו [4]. ההגברות בוצעו בשכפול באמצעות צינורות, רצועות וצלחות. באחת ההעתקים, נעשה שימוש רק בספין המסחרי, כאשר כמו באחר, נעשה שימוש בצנטריפוגה תוצרת בית. לא נצפו הבדלים כאשר נבדקו הגברות ה- PCR בג'ל agarose (ראה איור 3) גם כאשר נטענו מיקרו -סאטלטים במנתח הגנטי ABI 3100 (Applied Biosystems) והוצגו במחשב.

עליון: מבט כללי על הצנטריפוגה בעבודת יד. תחתון: פרט של צינורות בתוך הצנטריפוגה. התמונה גם מראה כיצד הגומיות מחוברות למסננת הפנימית.

תצוגה מפורטת של הצנטריפוגה בעבודת יד. יש לו שלושה רכיבים, מכסה, מסננת פנימית שבה היו מחוברים מתלים וקערת פלסטיק חיצונית.

תצלומים של ג'ל agarose מוכתם באתידיום ברומיד ויזואליזציה על ידי שקיעה UV. שורה עליונה (שורות 1 עד 10): הגברות PCR הנעשות באמצעות צנטריפוגה מסחרית. שורה נמוכה (שורות 1 עד 10): הגברות PCR נעשה באמצעות הצנטריפוגה בעבודת יד.

אנו משתמשים בצנטריפוגה זו באופן שגרתי במעבדת ההוראה. אחד משיעורי ההדגמה, המתבצעים במעבדה, הוא איתור מזון מהונדס גנטית. התרגול מבוסס על יצירותיהם של ברינגר ולווי [5] ותיון ואח '. [6]. הם משמשים לאיתור תירס ופולי סויה מהונדסים במוצרי מזון. לצורך הניסויים, יש צורך לבצע תגובות PCR רבות. התגובות כוללות DNA המופק מסוגים שונים של מזון וגם הפקדים החיוביים והשליליים. ראינו שהגברות PCR מוצלחות יותר כאשר תלמידים עובדים עם רצועות צינור במקום צינורות בודדים, כי זה ממזער את מספר השגיאות. במעבדה, יש לנו כמה מיקרוצנטריפוגות בהן ניתן לצנטריפוג צינורות PCR בודדים, אך לא רצועות. הצנטריפוגה תוכננה בתחילה למטרה זו. לכל קבוצת תלמידים, שניים או שלושה, יכולה להיות צנטריפוגה. בדקנו שתוצאות ה- PCR שבוצעו דומות לאלה שהתקבלו באמצעות צנטריפוגה מסחרית. בנוסף לשיעורים מעשיים, הצנטריפוגה משמשת גם במחקר במעבדה כדי לסובב נוזלים בעת שימוש בפלטות 96-בארות.

לצנטריפוגה מספר יתרונות, קלה מאוד וזולה מאוד להכנה, ואינה דורשת טיפול מיוחד ומצד שני, היא אינה חשופה לחוסר איזון, ולכן ניתן להשתמש בה ללא כל טיפול מיוחד.


תַקצִיר

האפיון המולקולרי של שלפוחיות חוץ -תאיות (EVs) חשף הטרוגניות רבה בהרכבן ברמה התאית והרקמה. שיטות הבידוד הנוכחיות לא מצליחות להפריד ביעילות תת -סוגים של EV לניתוח פרוטאומי ופונקציונלי. מטרת מחקר זה הייתה לפתח זרימת עבודה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה כדי להגדיל את התפוקה והטוהר של תכשירי EV. באמצעות שילוב של משקעים המבוססים על פולימרים ושארומטוגרפיה של אי הכללת גודל (Pre-SEC), ניתחנו שתי קבוצות משנה של רכבי EV על סמך תוכן ה- CD9, CD63 ו- CD81 וזמן החמקה. EVs אופיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני שידור, ניתוח מעקב ננו-חלקיקים ומבחני Western blot. כדי להעריך את ההבדלים בהרכב החלבון בין חלקי ה-EV שנפלטו מוקדם ומאוחר, ביצענו ניתוח פרוטאומי כמותי של EVs שמקורם ב-MDA-MB-468. זיהינו 286 חלבונים בלעדיים בשברים מוקדמים ו 148 חלבונים עם ריכוז דיפרנציאלי בין שברים מוקדמים ומאוחרים. ניתוח שיפוע צפיפות גילה עוד הטרוגניות EV בתוך כל תת -קבוצה מנותחת. באמצעות גישת ביולוגיה של מערכות, מצאנו אינטראקציות משמעותיות בין החלבונים הכלולים במכשירי ה- EV אשר מצביעים על קיומם של אשכולות פונקציונליים הקשורים לתהליכים ביולוגיים ספציפיים. זרימת העבודה המוצגת כאן מאפשרת לימוד תת -סוגים של EV בתוך סוג תא בודד ותורמת לסטנדרטיזציה של בידוד EV למחקרים פונקציונליים.


תוצאות

יישום שיטה לבידוד mtDNA מדגימות רקמה קטנות

כדי לחקור את כל ספקטרום המוטציה של mtDNA באזורי מוח קטנים של עכברים ולהימנע מההטייה הגלומה הקיימת בהגברת PCR, יישמנו שיטה לדלדול אנזימטי של ה- DNA הגרעיני (nDNA) מכלל ה- DNA [20] המופק מרקמת המוח. דלדלנו אנזימטית nDNA מ-DNA הכולל על ידי טיפול ב-exonuclease V, אנזים המכוון לקצוות החופשיים של DNA ליניארי ומותיר בעצם mtDNA מעגלי שלם [20]. השתמשנו בדגימות מועשרות ב- mtDNA ישירות להכנת הספרייה לרצף הדור הבא (איור 1 א).

ההזדקנות מגבירה את העומס של SNVs וגם מחיקות ב- mtDNA בכל אזורי המוח. א המחשה סכמטית של זרימת העבודה מהעכבר לספרייה מוכנה. בקצרה, אזורי המוח המעניינים נדגמו במהירות ונגזר ה- DNA הכולל. דנ"א לינארי התדרדר אנזימטית על ידי אקסונוקלאז (ExoV), ו- DNA לא לינארי מטוהר ומשמש להכנת ספרייה. FL: מולקולת mtDNA באורך מלא, ∆: מולקולת mtDNA עם מחיקה. ב סקירה כללית של זרימת העבודה לניתוח לייעול זיהוי גרסאות mtDNA. זמן קצר לאחר סינון איכותי, קריאות מופו ל-mm10 ללא הכרומוזום המיטוכונדריאלי (MT). קריאות לא ממופות מפותו אז מחדש להתייחסות MT שונה (dMT: שתי הפניות MT במקביל) וריאנטים שנקראו. ג סקירה כללית של mtDNA העכבר. ירוק: גנים המקודדים rRNA כחול: גנים המקודדים לחלבון אדומים: גנים המקודדים tRNA כתום: אזור לא מקודד (NCR). ד סכמטי המראה את האזורים המבודדים כמו קליפת המוח (COR), caudate putamen (CP), raphe הגבי (DR), nucleus accumbens (NAc), גרעין פרה-חדרי של התלמוס (PVT) ו-substantia nigra (SN). ה DNA המאוחסן לפני ואחרי העיכול ExoV כפוף ל- qPCR כדי לקבוע את הרמות היחסיות של שלוש mtDNA ושלוש מטרות גרעיניות לפני ואחרי העיכול (מוצג עבור שני עכברים שונים, A ו- B). עכבר C טופל כאל A ו-B אך ללא תוספת של ExoV. ברים מראים את ממוצע אותות המטרה ומציינים את סטיית התקן. †: nDNA לאחר טיפול ב-ExoV לא זוהה או זוהה רק ברמה נמוכה מאוד על ידי qPCR וייתכן שלא יהיה גלוי בערימת הבר. ו עלילת נקודה הממחישה את העלייה תלוית הגיל בעומס SNVs (משמאל) ומחיקות (מימין) על פני אזורי המוח שנחקרו (כפי שמצוין על ידי אגדת הצבע). כל הדגימות נורמלו לממוצע הווריאציות לאחר 10 שבועות. יהלומים אפורים מציינים את הממוצע של כל האזורים בגיל המצוין, ומרווח הביטחון של 95% מוצג. ANOVA תלת כיווני הראה גיל, לא אזור או בעל חיים, באופן משמעותי (ע' & lt 0.01) תרמו לרמות SNV ולמחיקה. נעשה שימוש במבחן של Tukey פוסט הוק כדי לקבוע ע' ערכים בין כל קבוצת גיל

אפשרנו מיפוי קריאה מפוצלת כדי לזהות מחיקות עם BBMap [21] (איור 1b) באמצעות התייחסות mtDNA מותאמת אישית המורכבת משתי הפניות של mm10 MT במקביל (dMT). בגישת מיפוי דו-סיבובית, הסרנו שאריות קריאות רצף שמקורן ב-nDNA, במיוחד בשל נוכחותם של מקטעי DNA מיטוכונדריאלי גרעיני (מטורפים), כלומר רצפים דמויי mtDNA בגנום הגרעיני. בשל המעגליות של mtDNA (איור 1 ג), מחיקות עשויות לחרוג מ"קצוות "ההתייחסות ל- mtDNA, שהיא בעלת אופי לינארי, מה שיפריע להתקשרות המחיקה. באמצעות dMT, עקפנו זאת והצלחנו לזהות גרסאות מהימנות בכל עמדה ב- mtDNA. מכיוון שידוע כי קריאות רצף שנוצרו על ידי Nextera מציגות הטיית GC בבסיסים הראשונים של הקריאה, קיצרנו את הבסיסים הללו והסרנו 5 bp נוספים בקצוות הקריאה במהלך קריאת וריאנטים (ראה סעיף "שיטות"). בהתבסס על זה, אין לנו שום סיבה להאמין ששיחות וריאציות מושפעות מהטיה ברצף טרנספוזאז. לזיהוי וריאנטים של mtDNA, דגמנו את הקורטקס הסנסורי (COR), caudate putamen (CP), ה-Raphe הגבי (DR), nucleus accumbens (NAc), גרעין התלמודי הפרה-חדרי (PVT) ו-substantia nigra (SN) (איור 1d) ) במהלך הזדקנות העכבר ואישור הדלדול nDNA על ידי qPCR לפני הכנת הספרייה ורצף (איור 1e).

הצטברות הקשורה להזדקנות של SNV ומחיקות בכל אזורי המוח

בתחילה מיפינו את השינויים הקשורים להזדקנות במוטציות mtDNA ברחבי המוח של עכברים בני 10, 50 ו -80 שבועות מסוג WT (איור 1f). כצפוי, מספר ה-SNVs בעכברים בני 10 שבועות היה נמוך מאוד אך עלה בממוצע פי 10 בעכברים בני 50 שבועות ונשאר ללא שינוי יחסית לאחר 80 שבועות (איור 1f, משמאל). באופן דומה, המחיקות הגיעו גם לרמה לאחר 50 שבועות לאחר עלייה של פי 2.5-3 מ-10 שבועות (איור 1f, מימין). הרמה שהגיעה הן ב-SNVs והן במחיקות לאחר 50 שבועות מצביעה על הגבלה בעומס של מוטציות mtDNA. זה עשוי להיות מוטל על ידי אובדן תפקוד המיטוכונדריה, ובכך להגביל את התפשטותו או לעורר מיטופגיה. לחלופין, שכפול סלקטיבי של מולקולות mtDNA עשוי למנוע את הגדלה נוספת של עומס המוטציות. בסך הכל, שני SNV ומחיקות נראו מצטברים באופן הומוגני ברחבי אזורי המוח שנבדקו במהלך ההזדקנות, אך עשויים להיות מושפעים מהגדרות פתולוגיות שונות.

פולג D181A ביטוי גורם להצטברות SNV ספציפית לאזור מוח עם ההזדקנות

לאחר שקבענו שניתן להשתמש בשיטה שלנו למיפוי מוטציות mtDNA הנגרמות על ידי הזדקנות, פנינו ל- פולג D181A דגמו עכברים לחקור את ההשפעה הספציפית לאזור המוח של מחסור בקריאת הוכחות. סידרנו mtDNA מששת אזורי המוח המעניינים אותם פולג D181A עכברים וזיהו את SNVs בכל אזור בגילאי 10, 50 ו -80 שבועות (איור 2 א).

SNVs מצטברים בצורה הטרוגנית על פני אזורי המוח ב פולג D181A עכברים וגורמים לדפוסי מוטציה ספציפיים למיקום mtDNA. א עלילת נקודות הממחישה את העלייה התלויה בגיל בעומס SNVs ב פולג D181A עכברים על פני אזורי המוח שנחקרו (כפי שמצוין על ידי אגדת הצבע) נורמלו לממוצע של דגימות WT לאחר 10 שבועות. יהלומים אפורים מצביעים על ממוצע דגימות אזור המוח הנגזר על ידי WT לעיון (זהה לאיור 1f). יהלומים אדומים מציינים את הממוצע של פולג D181A מוצגים דגימות של אזור מוח ו-95% רווח סמך. ANOVA תלת כיווני (גיל, אזור וחיה) של פולג D181A דגימות שנגזרו הראו שהגיל תרם משמעותית לרמות SNV (ע' ערכים של פוסט הוק הבדיקה של Tukey מוצגת). ANOVA תלת כיווני הראה תרומה משמעותית של כל המשתנים (גיל, גנוטיפ, אזור). ע' ערכים של פוסט הוק המבחן של Tukey בהשוואת WT ו- פולג D181A בכל גיל מוצגים. לתרומה באזור מצאנו תרומה משמעותית של COR, NAc ו- PVT לרמות SNV ב פולג D181A עכברים המשתמשים במודל ליניארי לאפקטים עיקריים. ב SNVs נספרו בפחים שאינם חופפים 10 bp עבור WT (אפור) ו- פולג D181A עכברים (אדומים) בשבוע 10, 50 ו -80, ומספר האזורים עם SNV בכל סל מחושב. שים לב שבמקרה שבאזור אחד יש יותר מ- SNV אחד בפח, הוא נספר רק כמופע אחד של SNV. החפיפה הוצגה עבור פחים שאינם חופפים ("1"), פחים משותפים על פני שניים או שלושה אזורים ("2-3"), ופחים משותפים על פני ארבעה עד שישה אזורים ("4-6"). ג SNVs נספרו בפחים שאינם חופפים 10 bp עבור WT (אפור) ו- פולג D181A עכברים (אדומים) בשבוע 50, ומספר בעלי החיים הבודדים עם SNVs בכל סל מחושב. שים לב שבמקרה שלחיה אחת יש יותר מ-SNV אחד בפח, זה נספר רק כמופע אחד של SNV. החפיפה הוצגה עבור פחים שאינם חופפים ("1"), פחים משותפים לשניים או שלושה בעלי חיים ("2-3"), ופחים משותפים לארבע או יותר בעלי חיים ("≥ 4"). ד אחוז מצטבר של SNVs זוהה בכל אזור מוח שנבדק (קווים דקים) הן עבור WT (אפור) והן עבור פולג D181A (אדום) בגיל 10, 50 ו -80 שבועות. קווים מודגשים מציינים את הממוצע המותנה החלק לכל גנוטיפ. ה תדירות אלל SNV הממוצעת היחסית עבור כל אזור עבור WT (אפור) ו פולג D181A עכברים (אדומים) בשבוע 10, 50 ו -80 כפי שמצוין בתור boxplots. ע' ערכים דו-צדדיים ט הבדיקות מוצגות. ו SNVs באזורי המוח אוחדו לכל גנוטיפ בכל גיל וחולקו לפחי 100 bp על פני הפניה mtDNA ושבר האלל עבור SNV בכל סל מסוכם ומנורמל (כלומר השיא הגבוה ביותר שהוגדר ל -1).אזורים אפורים מציינים אזורי mtDNA שבהם נמצאים פסגות בכל המשתנים (α), פסגות תלויות ההזדקנות (β), ונגרם על ידי הזדקנות פולג D181A פסגות תלויות (γ)

בעכברים צעירים, לא היה שינוי ברמות SNV בין WT ו- פולג D181A בעכברים בני 10 שבועות. בשבוע 50 ו -80 ראינו עלייה משמעותית ברמות SNV שהייתה בולטת במיוחד ב- COR, NAc ו- PVT (איור 2 א). זה הוכיח שההטרוגניות של התגובה המיטוכונדריאלית למחסור בהגהה קיימת על פני איבר ולא רק בין איברים [6, 16, 22, 23].

חשוב לציין שלא מצאנו קשר בין הביטוי של פולג D181A טרנסגן באזורי המוח שנחקרו ורמת SNVs שזוהו (קובץ נוסף 1: איור S5c).

SNVs חולקים באופן מוגזם בין אזורי המוח

תהינו האם העלייה ב-SNVs עם הזדקנות ו פולג D181A הביטוי השפיע על אותן עמדות ב- mtDNA בכל אזורי המוח. ואכן, בהסתכלות במרווחים לא חופפים של 10 bp, מצאנו עלייה בעמדות SNV משותפות עם ההזדקנות, אשר הוגברה על ידי פולג D181A ביטוי (איור 2 ב). החפיפה בין בעלי חיים בודדים הייתה הבולטת ביותר ב- PVT ו- NAc (איור 2 ג). כפי ש פולג D181A הביטוי הציג מעבר של התפלגות SNV לצד הימני של חלקת ההפצה (כלומר לכיוון NCR) בהשוואה ל- WT (איור 2 ד), בדקנו היכן נמצאו SNVs משותפים. מצאנו כי עמדות SNV משותפות היו שונות באופן משמעותי מעמדות SNV שאינן משותפות ב פולג D181A עכברים (ט מִבְחָן, ע' & lt 1 × 10 −5) אבל לא ב- WT (ט מִבְחָן, ע' = 0.254) כאשר מסתכלים על פני כל הגילאים וזזים לכיוון אזור 3 ′ (כלומר לכיוון NCR) (קובץ נוסף 1: איור S1a).

העלייה ב-SNVs משותפים לוותה בעלייה משמעותית בתדירות SNV עם פולג D181A ביטוי (איור 2e) אשר הונע על ידי SNVs בתדירות גבוהה באזורי mtDNA ספציפיים (איור 2f). אזורים אלה נראו תלויי הקשר מאוד, כלומר פסגות הנמצאות בכל הדגימות ("α" באיור 2f), רק בעכברים בגילאים מאוד ("β"), או שהם פולג D181A -ספציפי ("γ"). זה היה חיקוי ב פירסון מתאם, שבו רוב אזורי המוח מגיל 50 ו-80 שבועות פולג D181A עכברים יוצרים מקבץ מובחן ורוב הדגימות מעכברים בני 10 שבועות יוצרות מקבץ מובחן (קובץ נוסף 1: איור S1b) ומצאנו SNV ספציפי נקודות חמות בבעלי חיים בני 10 שבועות ללא תלות בגנוטיפ (קובץ נוסף 1: איור S1c). בנוסף, הייתה חפיפה משמעותית של המיקומים הספציפיים שבהם SNVs נמצאים ב-COR, NAc ו-PVT (אזורי המוח הרגישים ביותר ל פולג D181A expression) הן בשבוע 50 והן ב-80 פולג D181A עכברים (קובץ נוסף 1: איור S1d, מימין). בעכברי WT, החפיפה מבוטאת רק לאחר 80 שבועות ו ע' ערכים אינם מגיעים לרמות דומות של מובהקות (קובץ נוסף 1: איור S1d, משמאל).

מצאנו עלייה של SNVs בגנים NCR ובגנים מורכבים III (קובץ נוסף 1: איור S1e), בעוד שמעברים והתעברות (קובץ נוסף 1: איור S1f) היו דומים לאלה של מחקרים קודמים, ולא ראינו שום אינדיקציה לכך או בגיל- או פולג D181A מוטציות חמצוניות הנגרמות [19, 24], יחד עם כל שינוי בסוגי המוטציות (קובץ נוסף 1: איור S1g).

יחד, נתונים אלה הוכיחו תלות בהזדקנות ספציפית לאזור המוח פולג D181A ספקטרום mtDNA SNV המושרה, כאשר COR, NAc ו- PVT הם אזוריים נקודות חמות. בנוסף, עמדות mtDNA מסוימות רגישות מאוד ל-SNVs ונראה שהם מתפקדים כמוטציה תלוית הקשר מוקדים.

תלוי בגיל פולג D181A מחיקות המושרות מצטברות באותם אזורי מוח כמו SNVs

לאחר מכן הפנינו את תשומת לבנו להשפעה של פולג D181A ביטוי על הצטברות מחיקות. מצאנו הצטברות ניכרת של מחיקות בגילאי 50 ו -80 הן בהשוואה לילדים בני 10 שבועות. פולג D181A עכברים, אבל לא ראינו הבדלים משמעותיים בין WT ו- פולג D181A בכל גיל (איור 3 א). עם זאת, הצטברות מחיקה בתגובה ל פולג D181A הראו ספציפיות אזור בולטת. בעוד CP, DR ו- SN פולג D181A רמות SNV עלו רק מעט בהשוואה לעכברי WT, COR, NAc ו- PVT הראו הצטברות גבוהה מאוד של מחיקות לאחר 50 ו -80 שבועות. מצאנו הבדל משמעותי ברמות המחיקה בין האזורים הללו בהשוואה לאזורים האחרים ב פולג D181A כאשר מאגדים נתונים מעכברים בני 50 ו -80 שבועות (ע' = 0.002, ANOVA בכיוון אחד). בדומה ל-SNVs, לא מצאנו אינדיקציה לכך שרמות הביטוי של ה- פולג D181A transgene היו הגורם העיקרי לרמות המחיקה ב פולג D181A עכברים (קובץ נוסף 1: איור S5c).

הצטברות מחיקות הנגרמות על ידי פולג D181A הביטוי הם ספציפיים לאזור המוח ותלויים בהזדקנות. א עלילת נקודות הממחישה את העלייה התלויה בגיל בעומס SNVs ב פולג D181A עכברים על פני אזורי המוח שנחקרו (כפי שמצוין על ידי אגדת הצבע) נורמלו לממוצע של דגימות WT לאחר 10 שבועות. יהלומים אפורים מצביעים על ממוצע דגימות אזור המוח הנגזר על ידי WT לעיון (זהה לאיור 1f). יהלומים אדומים מציינים את הממוצע של פולג D181A מוצגים דגימות של אזור מוח ו-95% רווח סמך. ANOVA תלת כיווני (גיל, אזור וחיה) של פולג D181A דגימות שנגזרו הראו שהגיל תרם באופן משמעותי לרמות המחיקה (ע' ערכים של פוסט הוק הבדיקה של Tukey מוצגת). ע' ערכים של ANOVA תלת כיוונית (גיל, גנוטיפ, אזור) עם פוסט הוק המבחן של Tukey מוצג עבור כל קבוצת גיל. לתרומה באזור מצאנו תרומה משמעותית של COR, NAc ו- PVT לרמות המחיקה ב פולג D181A עכברים המשתמשים במודל ליניארי לאפקטים עיקריים. ב דיאגרמות אקורדים המצביעות על המחיקות שהצטברו בשבוע 10, 50 ו -80 ב- DR ו- PVT מ- WT ו- פולג D181A עכברים. הנתונים מנורמל pr. אזור המוח, והרוחב של כל גן מציין את חלק האלל המסוכם של מחיקות המשתרע על הגנים המצוינים. צבע האקורד מציין את הגן שבו ממוקמת נקודת השבירה 5′. עלילות נעשו באמצעות להקיף

ההבדלים באזורי המוח עם הזדקנות WT ו- פולג D181A ניתן להעריך עכברים על ידי דיאגרמות אקורד המציגות את טווח כל המחיקות בכל נקודת זמן (איור 3 ב). כאשר PVT הראה הן הזדקנות והן תלויות הזדקנות ברורות פולג D181A הצטברות מחיקות, DR רק הראתה הצטברות המושרה על ידי הזדקנות של מחיקות, והדגישה את רגישות ה- mtDNA ספציפית לאזור המוח להגדרה של חוסר יציבות של שכפול. פירסון המתאם הצביע על קווי דמיון במחיקות שנמצאו עם ההזדקנות של פולג D181A עכברים (קובץ נוסף 1: איור S2a), המצביע על כך פולג D181A הביטוי גורם לנוף ספציפי של מחיקות mtDNA.

מחיקות חולקות מאפיינים ללא תלות בגנוטיפ

המיקומים שבהם מחיקות מתחילות ומסתיימות נקראות נקודות שבירה ומבוססות על המחיקות המתרחשות במקביל בין אזורי מוח מ פולג D181A עכברים, שיערנו שחייבים לחלק את נקודות השבירה בין דגימות שונות. בדקנו בפחים של 100 bp לאורך mtDNA ומצאנו שאשכול נקודות פריצה משותף במיקומים מאוד מובחנים (קובץ נוסף 1: איור S2b). כמה נקודות שבירה משותפות אינן תלויות גיל וגנוטיפ (

5 kb) בעוד שאחרים תלויים בגנוטיפ (

15 קילו -בתים). גדלים של מחיקות עצמן עוקבים אחר התפלגות דו -מודאלית ללא תלות בגיל וגנוטיפ וניתן לחלק אותם באופן גס ל- 100 bp לאלו ו- gt 1 kb, עם מעט תצפיות בטווח הביניים (איור 4 א). למרות שמספר המחיקות בבעלי חיים בני 10 שבועות נמוך, הם עדיין עוקבים אחר התפלגות זו, אם כי חלקן של מחיקות קטנות מאוד גבוה בהשוואה לבעלי חיים מבוגרים.

מאפייני המחיקה משתנים עם הגיל, אך לא הביטוי של פולג D181A . א חלקת צפיפות של גדלי מחיקה עבור WT (אפור) ו- פולג D181A (אדום) לעכברים 10- (קו מקווקו), 50- (קו מקווקו) ו -80 שבועות (קו מלא). ב המרחק הממוצע הקצר ביותר בין זוגות נקודת מחיקה של 5 ′ ו- 3 ′ לזוג חוזר ישיר בגנום המיטוכונדריאלי למחיקות שנצפו (צבע כהה יותר) ואקראי בספרייה תואמת מחיקה באורך סיליקו (צבע בהיר יותר) לשני ה- WT (משמאל) , באפור) ו פולג D181A (מימין, באדום) באמצעות נתונים מאוגדים מכל הגילאים ואזורי המוח שנבדקו עבור כל גנוטיפ. ע' ערכים דו-צדדיים ט הבדיקות מוצגות. ג מַחַט ציון זהות מחושב בחלון של ± 10 bp בנקודות השבירה של 5' ו-3' המחיקה כפונקציה של גודל המחיקה לאחר איגום של WT ו פולג D181A דגימות. מתאם לכל גיל מסומן על ידי הקווים המלאים ונתוני המתאם המצוינים באותו קוד צבע

גורמים מולקולריים של מחיקות

מחקר קודם הציע שרוב מחיקות mtDNA בחולי פרקינסון מתרחשות בחזרות ישירות [17], תכונה מוצעת [25] אם כי ניכרת דיון רב [26] במחיקות mtDNA אנושיות. כדי לחקור את ההשפעה של חזרות ישירות בהיווצרות נקודת שבירה במוח העכבר, זיהינו חזרות ישירות ≥ 8 bp ב- mtDNA (קובץ נוסף 1: איור S2c). לאחר איגום מחיקות לכל גנוטיפ, זיהינו את הזוג החוזר הישיר עם המרחק הממוצע הקצר ביותר מנקודות השבירה של 5' ו-3' של WT ו פולג D181A מחיקות וכן עבור ספריות מחיקה תואמות אורך של סיליקו עבור כל גנוטיפ (ראה סעיף "שיטות"). המרחק הממוצע הקצר ביותר היה קצר יותר עבור מחיקות שנגזרו בניסוי מאשר מחיקות שנוצרו באקראי עבור WT ו פולג D181A עכברים (איור 4 ב), אך לא היה הבדל בין WT ל- פולג D181A (ט מִבְחָן, ע' = 0.905). זה מצביע על כך שחזרות ישירות עשויות לתרום לפחות לחלק מהמחיקות שזוהו. מצאנו שזה המקרה בשבועות 10 ו-50 אך לא בשבועות 80 (קובץ נוסף 1: איור S2d), מכיוון שמחיקות קרובות יותר באופן משמעותי לחזרות ישירות מאשר ספריות המחיקה בסיליקו עבור WT וגם פולג D181A עכברים.

הגבלת הדמיון ברצף לחזרות ישירות היא קריטריון קפדני. לפיכך חישבנו את ציוני זהות הרצף בחלון של 20 bp המקיף את כל נקודות השבירה של 5' ו-3' (כלומר 10 bp בכל צד של נקודת השבירה). מצאנו מתאם שלילי בין ציון זהות הרצף לבין אורך המחיקה אצל ילדים בני 50 ו -80 שבועות פולג D181A עכברים (איור 4 ג) ועוד ראו הבדל משמעותי בין ציוני הזהות של מחיקות & lt 100 bp ו- gt 100 bp בגילאי 50 ו -80 שבועות פולג D181A כמו גם עכברי WT (קובץ נוסף 1: איור S2e). נתונים אלה מרמזים על תרומה דיפרנציאלית של דמיון רצף חוזר לא ישיר למחיקות קצרות וארוכות.

מרובי NCR בשפע הם בלעדיים ל פולג D181A -ביטוי

כצפוי, כיסוי הרצף הציג שונות מסוימת, הקשורה ככל הנראה לספציפיות רצף קלה של הטרנספוזאז המשמש להכנת הספרייה [27,28,29]. עם זאת, באזורי מוח ספציפיים של בני 50 ו -80 שבועות פולג D181A עכברים, ראינו כיסוי מוגבר באזור 15 kb+ כולל לפחות חלק מה- NCR (קובץ נוסף 1: איור S3a). כיסוי מוגבר מקומי נחשב לעתים קרובות קשור לאזורים משוכפלים. מכיוון שה- DNA המיטוכונדריאלי מעגלי, לא ניתן להבחין בין כפילויות קטנות ממחיקות לטווח ארוך מאוד (VLRD) (קובץ נוסף 1: איור S3b). לכן תהינו אם הנתונים שלנו של מחיקות mtDNA יכולים לתמוך בנוכחותם של מולטימרים. על ידי סיווג VLRD כמחיקות & gt 15 kb, גילינו כי VLRD מועשרים במיוחד ב- NAc ו- PVT מגילאי 50 ו -80 שבועות פולג D181A עכברים (איור 5a) ומועשרים באזור 15 kb+ (איור 5b וקובץ נוסף 1: איור S3c), התומכים ברעיון שמולטימרים mtDNA הכוללים לפחות חלק מה-NCR מצטברים באזור מוח ספציפי ו- פולג D181A -אופן תלותי עם הגיל. מצאנו גם עלייה בקריאה לא סבירה אצל בני 50 שבועות פולג D181A עכברים, התומכים עוד יותר בנוכחות סידורים גנומיים כגון מולטימרים (איור 5 ג וקובץ נוסף 1: איור S3c).

מולטימרים משוערים של NCR הם פולג D181A -ספציפיות ומצטברות עם הגיל באופן ספציפי לאזור המוח. א עלילת נקודות הממחישה את העלייה התלויה בגיל בעומס VLRDs ב פולג D181A עכברים ברחבי אזורי המוח שנחקרו (כפי שמצוין באגדת הצבעים). כל הדגימות נורמלו לדגימה עם המספר הנמוך ביותר של גרסאות שזוהו. ב אחוז מצטבר של מיקום 5 ′ של VLRDs (כלומר מיקום ההתחלה של הרצף המולטימרי המשוער) המסוכם על פני אזורי המוח עבור WT (אפור) ו- פולג D181A (אדום) לעכברים 10- (קו מקווקו), 50- (קו מקווקו) ו -80 שבועות (קו מלא). ג מספר ממוצע של קריאות סתירות כפי שחולצו על ידי samtools בשבוע 10, 50 ו -80 עבור WT (אפור) ו פולג D181A (אדום) וסטיית התקן מסומנת. ע' ערכים דו-צדדיים ט הבדיקות מוצגות. ד ניתוח מסוכם של נקודות שבירה mtDNA של VLRDs מ פולג D181A עכברים ב- NCR ובאזור שמסביב. נקודות שבירה של 5' (סגול) ו-3' (טורקיז כהה) מסוכמות בכל מיקום בכל אזורי המוח בגיל 50 (שמאל) או 80 (ימין) שבועות, ומתווים אמצעים מותנים חלקים. הלוח התחתון מציג את phastCons ציון שימור באמצעות דפדפן הגנום של UCSC באותו אזור. ע' ערכים דו-צדדיים ט הבדיקות מוצגות. ה Boxplot מציג את המרחק הממוצע הקצר ביותר לחזרה ישירה מכולם פולג D181A VLRDs מופרדים על ידי מיקום VLRD 5 ′ לתוך & lt 15 kb (תכלת) או & gt 15 קילו־בייט (כחול כהה). ע' ערכים דו-צדדיים ט הבדיקות מוצגות. ו Boxplot המציג את מַחַט ציון הזהות של WT ו- פולג D181A VLRDs שנגזרו מאוחדים על פני גילאים ואזורי מוח שנבדקו מפוצלים ל-VLRDs עם מיקום 3′ < 15 kb (תכלת) ו-> 15 kb (כחול כהה). ע' ערכים דו-צדדיים וילקוקסון הבדיקות מוצגות

נראה כי מולטימרים משוערים אלה נוצרים באזור מוגבל למדי של mtDNA כאשר "נקודות השבירה" של 5 ′ ו- 3 ′ (המצביעות על הסוף וההתחלה של הרצף המשוכפל, בהתאמה), מצטברות במיקומים די נפרדים (איור 5 ד) המשתרע על פני אזור עם ציון שימור נמוך על פני יונקים (איור 5 ד, לוח תחתון). נתונים קודמים הצביעו על הימצאותם של מולטימרים במוח מעכבר המוטציה [16]. השתמשנו באותה גישה PCR כמו Williams et al. ואימת את פולג D181A -נוכחות ספציפית של מולטימרים (קובץ נוסף 1: איור S4a, הלוח העליון והאמצעי). מערך PCR חלופי שיניב מוצר רק בנוכחות מולטימרים אישרה את התוצאות הללו (קובץ נוסף 1: איור S4a, לוח תחתון) ונתונים שלאחר מכן הצביעו גם על נוכחות של היפוכים (קובץ נוסף 1: איורים S4b,c) .

יחד, נתונים אלה תומכים בנוכחות של הזדקנות המושרה במיוחד לאזור המוח פולג D181A מולטימרים תלויים שהם מאוד ספציפיים למקטע המכיל NCR חלקי של mtDNA במיוחד ב-NAc וב-PVT.

חזרות ישירות עשויות להיות מעורבות בהיווצרות מולטימר NCR

מולטימרים יכולים להיווצר על ידי מספר מנגנונים. מנגנון אחד הוא על ידי החלקה של גדילים במהלך שכפול שעשוי להיות מושפע מהסביבה המקומית המקיפה את ה- NCR, אשר ידוע כאינטראקציה עם הממברנה המיטוכונדרית הפנימית [9]. מנגנון נוסף מתווך על ידי רצף ה- DNA המקיף את מיקומי ההתחלה והסיום של אזור המולטימר. כתמיכה ברעיון של החלקת גדיל, אנו מוצאים ש-VLRDs באזור 15 kb+ קרובים יותר לחזרות ישירות בהשוואה למולטימרים בחלקים אחרים של ה-mtDNA (איור 5e), אם כי הדמיון הכולל של הרצף סביב נקודות השבירה אינו שונה (איור .5ו). SNV מועשרים ליד נקודות שבירה של 5 ′ VLRD וכן

7 kb במעלה הזרם עם מרחק ממוצע של 75 ± 462 bp ל- SNV הקרוב ביותר (קובץ נוסף 1: איור S5a). חמישה עשר אחוזים מנקודות השבירה של VLRD משתתפות במיקום משותף עם SNV, מספר שאינו מושפע מקריאות לא מתיישבות. SNVs לא היו מועשרים באזור המולטימאי המשוער (קובץ נוסף 1: איור S5b).

רמת הביטוי של טרנסגן אינה מניע גרסאות

הביטוי של טרנסגנים לרוב אינו דומה ברקמות, וזה נכון גם לגבי פולג D181A ביטוי [14]. כדי לאשר שהבדלי הביטוי לא הניעו את ההבדלים שצפינו בהצטברות של מוטציות בתגובה ל פולג D181A ביטוי, הערכנו את רמות הביטוי של אנדוגני פולג וטרנסגנית פולג D181A . חשוב לציין, התעניינו ברמות הביטוי היחסיות של שני התמלילים, כאנדוגניים וטרנסגניים. פולג יתחרה על גישה ל- mtDNA במהלך השכפול. כפי שהוצג בחלקים קודמים, אנו לא מוצאים מתאם בין רמות המוטציה של mtDNA לבין היחסים פולג D181A /פולג רמות בכל גיל (קובץ נוסף 1: איור S5c). יחד, זה מדגים שרמות ביטוי טרנסגנים לא היו המניע העיקרי של הספציפיות של אזור המוח למחסור בהגהה במיטוכונדריה.

גרסאות mtDNA מתקבצות יחד לאורך אזורים גנומיים

לאורך כל הניתוח שלנו של ספקטרום המוטציות של mtDNA הן מ- WT והן מ- פולג D181A עכברים, התברר יותר ויותר כי לעתים קרובות נמצאו סוגים שונים של גרסאות באזורים ספציפיים של mtDNA. כדי לחקור זאת עוד יותר, צירפנו את כל הווריאציות שנותחו - SNVs, מחיקות, VLRDs (כלומר מולטימרים) - על פני mtDNA במגרש מעגלי (איור 6a). בדיקה חזותית של חלקה זו הראתה שסוגים שונים של וריאנטים מועשרים זה בקרבת השני. מצאנו מתאם חזק וחיובי בין SNV לעומס המחיקה ברמת הגן שאינו תלוי בהזדקנות ובגנוטיפ (איור 6b), המעיד על רגישות מיקומית להצטברות של מוטציות שעלולות לחשוף חוסר יציבות גנומית בסיסית באזורים ספציפיים או להיגרם על ידי מבנים מסדר גבוה יותר.

רמות של וריאנטים שונים מתואמים בין גנים של mtDNA. א גרסאות מזוהות מתואמות על פני הפניה mtDNA עבור WT (למעלה) ו- פולג D181A (למטה) דגימות בכל האזורים בשבוע 10, 50 ו -80 כפי שצוין. רצועות מבחוץ לפנים: (1) שמות גנים mtDNA (שים לב ששמות גנים של tRNA אינם מוצגים), (2) גנים mtDNA לפי אורך, (3) הרמה היחסית של VLRDs (למשל מולטימרים והיפוכים), (4) SNVs זוהה בכל האזורים עם גובה המציין תדר אלל שהפך טרנספורמציה log2, ו (5) מחיקות המתואמות כקווים המחוברים לעמדות התחלה וסיום. שים לב שנקודות ההתחלה והסיום של המחיקות אינן מצוינות. ב עומס של SNV ומחיקה עבור כל גן mtDNA חלקי אורך הגן משורטטים עבור WT (אפור) ו פולג D181A (אדום) לעכברים בני 10-, 50 ו -80 שבועות. הנתונים הותאמו (מ-0 ל-1) לפני ביצוע התווים לצורך הבהירות. פירסון המתאם ומשמעות המתאם מוצגים מתחת לכל חלקה הן ל- WT (אפור) והן ל- פולג D181A (אָדוֹם)


2. חומרים ושיטות

2.1 דוגמנות קלט הפחמן הנדרש לאדמה

(1) כאשר SOC הוא וקטור ממד 4 בעל ארבעה רכיבים, כל רכיב מתייחס לתכולת הפחמן האורגני באחד מארבעת התאים הדינמיים של דגם RothC: בריכת הצמחים העמידה (סל"ד), בריכת הצמחים המתפרקת (DPM), הבריכה המיקרוביאלית (BIO) והבריכה ההומית (HUM). הוא וקטור ממד 4 המייצג את כמויות C המשולבות בארבע הבריכות הדינמיות, ו- ו הוא מטריצה ​​4 × 4 המייצגת מינרליזציה של SOC וזרימת פחמן בין בריכות. סוג הצמחייה משפיע על התפלגות תשומות C לתוך בריכות הסל"ד וה-DPM ולכן, היחס DPM:RPM תלוי בדרך כלל בסוג הצמחייה. ב- RothC נשקלים ארבעה סוגי צמחיה: שטחי גידול, שטחי דשא משופרים, שטחי דשא לא משופרים ויערות עם יחס DPM: RPM של 1.44, 1.44, 0.67 ו -0.25, בהתאמה. עבור תפוקת פחמן כוללת ושיעור מינרליזציה נתון, שימוש בקרקע עם ערכים נמוכים יותר של יחס DPM:RPM יציג מלאי SOC סך גבוה יותר.

איפה , שייקרא להלן שיווי המשקל או המצב היציב, ניתן לחשב בקלות ותלוי בקצבי הזנת הפחמן האורגני (OC) וב- ו מַטרִיצָה: (2) איפה היא מטריצת הזהות של הממד 4 × 4 ו הוא הווקטור של תשומות פחמן קבועות. לעומת זאת, אם הערכות של ו קיימים, ניתן, בתורו, להעריך, בהנחה שהאדמה הגיעה לשיווי משקל ושתנאי האקלים קבועים. שים לב ש- SOC מתייחס ל- SOC הכפוף לדינמיקה של SOC. עבור מודל RothC, SOC דינמי זה מהווה חלק קטן מסך ה- SOC.

איפה הוא ה- SOC הכולל שניתן למדוד אותו, ו- IOM ה- SOC האינרטטי, שהוא, על פי RothC, קבוע לאורך זמן. IOM מוערך בדרך כלל באמצעות Falloon et al. (1998) משוואה. משוואה (2) נותנת: (3)

כמו במשוואה (1), הוא וקטור ממד 4. לצורך הפשטות, (ובהמשך ) להלן מתייחס לתשומות הפחמן הכוללות לאדמה, כלומר סכום ארבעת המרכיבים של הווקטור הזה.

במחקר הנוכחי, השתמשנו במודל RothC כדי להעריך (i) את תשומות ה- SOC הדרושות לשמירה על מניות SOC הנוכחיות, תוך השערה כי הן במצב יציב ו- (ii) הגידול בתשומות ה- SOC הדרושות להגעה למניות SOC בעוד 30 שנה מהיום, בהנחה שקצב גידול שנתי קבוע של 4 אינץ 'ב- SOC. שים לב כי השערת המצב היציב אינה נתמכת על ידי נתונים כלשהם מאחר ומערך נתונים חזק עדיין אינו זמין לצרפת היבשתית. זה נבדק בשלב מאוחר יותר של עבודתנו כאשר השווינו רמות קלט פחמן שהוערכו על ידי RothC תחת השערה זו ורמות NPP שהושגו באופן עצמאי מ-RothC (ראה סעיף 2.3).

  1. מחשב SOC 0 as (Falloon et al., 1998)
  2. שימוש במשוואות (2) ו- (3)
    1. לְפַצֵל בין , , ו
    2. לחשב צריך להתבונן
    שלב 4 נעשה באמצעות אלגוריתם אופטימיזציה של אבולוציה דיפרנציאלית (Ardia et al., 2016). מ ה ההערכה, הגידול בקלט SOC חושב כ (4)

    בנוסף, כדי להעריך את ההשפעה של שינויי אקלים על תשומות SOC הדרושות לשמירה או הגדלת מניות SOC, RothC הופעל עם שני מערכי נתונים אקלימיים: נתונים שנצפו (1980–2010) ונתונים מדומים תוך התחשבות בשינויי האקלים (RCP 8.5). תרחיש זה נבחר מכיוון שהוא חוזה את העלייה הגבוהה ביותר בטמפרטורה וב-CO המצטבר2 פליטות, עם השלכות שעלולות להיות חשובות על הדינמיקה של SOC המושפעת הן מהעלייה בטמפרטורה והן מהעלייה בתשומות C עקב CO2 אפקט ההפריה (Meinshausen et al., 2011 Wieder et al., 2015). יתר על כן, Schwalm et al. (2020) הראה כי בהתייחסו לאמצע המאה ולמוקדם יותר, RCP 8.5 היא בבירור הבחירה השימושית ביותר: היא עולה בקנה אחד עם סך הפליטות המצטברות ההיסטוריות לתקופה הנוכחית, ובהתחשב במדיניות הנוכחית והמוצהרת, היא נותנת את הפליטות המצטברות הסבירות ביותר. לתקופה 2030–2050. התוצאות לתנאי האקלים שנמצאו בשנים 1980–2010 מוצגות תחילה, ואלו לתרחיש 8.5 RCP (1980–2010 ו- 2020–2050) משמשות עוד כדי לדון בהשפעת שינויי האקלים.

    מודל RothC יושם בתוך חבילת RothC R (מרטין, 2018), פעולות GIS באמצעות תוכנת GRASS GIS (צוות פיתוח GRASS, 2018) וניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנת R (R Core Team, 2015).

    2.2 נתונים להערכת עם RothC

    RothC צריך מספר משתני קלט כדי לדמות דינמיקת פחמן ומינרליזציה של SOC. מינרליזציה של SOC היא פונקציה של תכולת חימר הקרקע (המניעה ייצוב SOC בבריכות שונות ולחות הקרקע), טמפרטורה, משקעים, אידוי פוטנציאלי וכיסוי קרקע (חשוף או מכוסה). כיסוי הקרקע מניע את המינרליזציה הן במישרין והן בעקיפין באמצעות תכולת הלחות בקרקע. הטמפרטורה מניעה מינרליזציה באופן ישיר, ומשקעים ופוטנציאל evapotranspiration מניעים מינרליזציה בעקיפין באמצעות תכולת לחות הקרקע. בנוסף, במסגרת שלנו, היינו זקוקים למפות של SOC ב -23 סנטימטרים העליונים של האדמה (מכיוון שה- RothC מתבצע פרמטר למודל של מניות SOC בשכבת האדמה 0–23 ס"מ) כתשומות למשוואה (3) ולחלק הכולל של C תשומות בין שאריות צמחים והפריה אורגנית שכן שתי קטגוריות אלו של תשומות C מאופיינות בפרמטרים ספציפיים.

    2.2.1 נתוני קרקע

    השתמשנו בנתונים ממוצרי GlobalSoilMap שיוצרו לאחרונה עבור צרפת (Mulder et al., 2016), הן עבור חימר והן עבור SOC. מוצרי GlobalSoilMap מספקים הערכות בין היתר לשכבות העומק 0–5, 5–15, 15–30 ס”מ ברזולוציה של 90 מ ’לצרפת. מערכי הנתונים של חימר ו- SOC נאספו לשכבה 0–23 ס"מ באמצעות ממוצעים משוקללים של אומדנים לשכבות GlobalSoilMap. מלאי SOC חושבו בהנחה של תכולת שברי סלע קבועה (2%) והערכת צפיפות הצבר עם פונקציית פדוטרנספר (ראה Meersmans et al., 2012 לפרטים). לגבי קרקעות בצרפת, הערכות GSM של צפיפות בתפזורת עדיין אינן זמינות בעיקר בגלל מחסור בנתונים ובעיות הקשורות לשיטות מדידה. אותו דבר לגבי תוכן שברי רוק. אומדני עומק הקרקע (Lacoste et al., 2016) שימשו לקיצוץ פרופילי קרקע בפיקסלים. למשל, שם עומק הקרקע ד הוא פחות מ 23 ס"מ, המניות מחושבות על 0-ד ס"מ במקום על 0–23 ס"מ. כל החישובים בוצעו תחילה ברשת רזולוציה של 90 מ ', ולאחר מכן נאגרו לרשת ברזולוציה של ק"מ אחד. כל העבודות הבאות בוצעו ברשת רזולוציה של קילומטר אחד כדי לצמצם את זמן החישוב. רזולוציה עדינה יותר לא נדרשה למחקר שלנו, שכן המפות שהופקו שימשו רק לניתוח דפוסים אזוריים ולאומיים.

    2.2.2 נתוני אקלים

    כמות המשקעים החודשית (מ"מ חודש -1), אוופוטרנספראציית התייחסות (PET, מ"מ חודש -1) והטמפרטורה (ממוצעים חודשיים, במעלות צלזיוס) נמדדו בממוצע במהלך התקופה 1980–2010 מהניתוח החוזר של SAFRAN הצרפתי על מנת להניב שנת ייחוס המייצגת. האקלים הנוכחי בצרפת על 8 × 8 ק"מ 2 פיקסלים (Quintana-Segui et al., 2008). PET חושב בשיטת FAO Penman-Monteith (Allen et al., 1998). נתוני תחזיות האקלים הם ממודל האקלים הצרפתי ALADIN (CNRM-CM5/CNRM-ALADIN53) עבור CO2 תרחיש ריכוז RCP 8.5. תחזיות האקלים נפגעו עם ניתוח מחדש של SAFRAN על כל פיקסל באמצעות שיטת הקטנת קנה מידה סטטיסטית המבוססת על גישת מיפוי קוונטיל. PET חושב שוב עם נתוני אקלים מופחתים (טמפרטורה, לחות יחסית, קרינת השמש ומהירות הרוח).

    2.2.3 כיסוי לאדמה

    Landcover הוערך באמצעות נתוני אקוקליפמה (Faroux et al., 2013), ברזולוציה של קילומטר אחד (ראה איור 1 מידע תומך S1). תחזיות האקוקליפמה היו מקובצות לארבע קטגוריות עיקריות (כלומר שטחי יבולים, שטחי דשא, יערות ואחרים). סימולציות בוצעו רק על שטחי יבשה, שטחי דשא קבועים ויערות. הבחינו בין שטחי דשא קבועים משופרים לבין שטחי דשא קבועים לא משופרים באמצעות נתונים על סוגי שטחי דשא ממחקר קודם (Tibi & Therond, 2018), אשר הסתמך על סיווג שהוצע על ידי Devun and Legarto (2011).

    2.2.4 תרחיש נתוני ניהול וקלט עבור RothC

    כאשר הוא מופעל במצב הפוך, זאת על מנת לאמוד את רמות הכניסה הפחמניות הנדרשות כדי להגיע לרמת SOC נתונה, RothC זקוקה אך ורק לשני נתוני קלט הקשורים לניהול. הראשון הוא מספר החודשים שבהם קרקעות נותרות חשופות. משתנה קלט זה, המתאים רק לאדמות גידול, נקבע ל -4 חודשים, למעט כאשר קרקעות השתייכו לאזורים פגיעים לחנקות שבהן הוא נקבע לחודשיים מאחר שגידולי כיסוי הם חובה באזורים אלה. משתנה הקלט השני הוא שיעור תשומות הפחמן לאדמה המורכב משינויים אורגניים. תשומות OC לקרקע הן בעיקר תוצאה של שאריות צמחים ומתוספות של זבל בעלי חיים ומוצרים אורגניים אחרים (להלן תיקונים אורגניים). ב-RothC, גורל הפחמן המסופק על ידי שאריות צמחים ותיקונים אורגניים הוא ספציפי, המשקף את ההבדל ביניהם במונחים של יכולת הפירוק. לכן, על מנת להשתמש ב-RothC עם המסגרת שהוצגה לעיל, כדי להעריך את כמות תשומה C הדרושה לשמירה על מלאי פחמן נתון, או כדי להגדיל אותו, צריך להחליט על החלק בין שאריות צמחים ותיקונים אורגניים בתשומות C. שיעור זה נקבע לפיכך, בהתבסס על מחקרים קודמים שהעריכו אותו בקנה מידה אזורי עבור צרפת (Tibi & Therond, 2018). יתר על כן, סברנו כי הסוג היחיד של תיקון אורגני היה זבל חצר חקלאיות, ש-RothC מספק עבורו הרכב ברירת מחדל ואשר מהווה כ-60% מהתיקונים האורגניים המופצים על קרקעות חקלאיות בצרפת (Houot et al., 2014). ב- RothC, OC בחומר אורגני זה מתחלק לבריכות סל"ד, DPM ו- HUM בפרופורציות הבאות: 49%, 49%ו -2%. למרות שהוצע פרמטרזציה נוספת עבור RothC (Peltre et al., 2012), עם חלק גבוה יותר של HUM לתיקונים אורגניים, לא ניתן היה לקחת זאת בחשבון מכיוון שנתונים מרחביים על טיבם של תיקונים אורגניים לא היו זמינים עבור המחקר שלנו. שינויים אורגניים הורשו רק על שטחי יבשה וכרי דשא, לא על יערות. שקלנו גם שעלייה בסך כל תשומות ה-OC במהלך תקופת אחסון הפחמן של 4‰ (כלומר בין ט0 ו ט0 + 30 שנים) היה אפשרי רק באמצעות עלייה בתשומות שאריות הצמחים, ולא באמצעות תוספות של תיקונים אורגניים. ביבשת צרפת, כל זבל בעלי החיים כבר מפוזר על קרקעות חקלאיות כך שלא ניתן להגביר את זמינותו של משאב זה (Houot et al., 2014). יתר על כן, בגלל הקבלה החברתית הנמוכה של הפצת מוצרים אורגניים עירוניים ותעשייתיים, הגדלת כמות התפשטות על קרקעות חקלאיות אינה סבירה. שים לב שבמחקר זה נעשה שימוש במידע אחר על נוהלי ניהול באדמות גידולים, אדמות דשא ויערות, אך בשלב מאוחר יותר בתהליך, כלומר, להערכת עצמאית מ-RothC את ה- NPP הזמין הזורם לקרקע (ראה גם איור 1), המוצג בפרק הבא.

    2.3 NPP זמין ומאזן הפחמן של המערכות האקולוגיות

    (5) כאשר NPP הוא הפריון העיקרי נטו, היא כמות ה- NPP שהוקצתה להגדלת הביומסה של הצמח, יצוא הנובע מפעילות אנושית, הפחמן חזר באמצעות צואה של בעלי חיים ויישום זבל, ו הוא החלק של סך תשומות ה-C לקרקעות המוקצה לשכבת האדמה 0–23 ס"מ בלבד (שהיא השכבה הנחשבת במודל RothC, ואשר תואמת, עבור צרפת, את העומק הממוצע של שכבת המחרשה Arrouays et al., 2001). נגזר מהערכות שפורסמו לאחרונה של זרימות NPP תת קרקעיות (Balesdent et al., 2018), בהתאם לשימוש הקרקע, תכולת חימר, הטמפרטורה השנתית הממוצעת והיחס הממוצע של משקעים שנתיים להתאדות פוטנציאלית. עבור שטחי דשא ושטחי גידול, ההנחה הייתה שווה ל 0 בהתחשב בכך שמבוסס על ממוצע שנתי, כמות הפחמן במצפת הביומסה הצמחית התת קרקעית והתת קרקעית נשארת קבועה לטווח הארוך, בניגוד למערכות יער שאינן בוגרות. הגדרנו את מאזן הפחמן של אדמה נתונה כהבדל בין NPP זמין הזורם לשכבת הקרקע הנחשבת () והקלט הפחמן בקרקע (), כפי שנאמד במודל RothC, נחוץ לשמירה על רמות SOC הנוכחיות או כדי להגיע למניות ה- SOC היעדות של 4 ‰. (6) עם שווה ל אוֹ (ראה סעיף 2.1 על מסגרת המידול), מניב, בהתאמה, ו .

    NPPלִגלוֹשׁ ו הוערכו בשיטות ובמקורות נתונים נפרדים, וחישוב האיזון ביניהם התייחס לשאלה הבאה: האם קלט הפחמן לקרקעות נדרש כדי לקיים את המניות הנוכחיות או כדי להגיע ליעד 4 אינץ '? איור 2 מסכם גישה זו בהתבסס על השוואה בין קלט הפחמן הנדרש, המיוצג על ידי משתנה, והקלט הפחמן הזמין מיוצג על ידי ה- NPPלִגלוֹשׁ משתנה, נאמד כאן באמצעות נתונים אודות פריון הצמחים ופעילות אנושית. לומד את הסימן של עשויה להוביל למסקנות שונות בהתאם להשערה אודות היציבות של מניות SOC. אם שונה מאפס, השערת המצב היציב אינה תקפה כרגע. מעיד על כך אינו מספיק כדי לקיים מניות SOC קיימות הנמצאות במגמת ירידה. אם , מניות SOC עשויות להיות במגמת עלייה. לחלופין, כאשר RothC משמש לחישוב כלומר, פחמן הנדרש כדי להגיע ליעד 4 לאחר 30 שנה, שלילי ערכים מצביעים על כך, בהתחשב ברמות NPP ופעילות אנושית, אכן אין מספיק פחמן כדי להגיע ליעד זה. ערכים חיוביים מצביעים על כך שאכן ניתן להגיע ליעדים גבוהים יותר. ציין זאת החישובים בוצעו באמצעות מאגר נתונים עדכני, ובכך מבוסס על פריון הצמחים הנוכחי ומערכות חקלאיות ויערות קיימות. יתר על כן, המסגרת המוצעת מתעלמת מכמה מהשטפים הזעירים יחסית המביאים לתשומות ותפוקות C. אלה כוללים שחיקה, שריפות, שטיפת פחמן אורגני מומס, פליטת מתאן ופליטות פחמן אורגני נדיף (ראה Soussana et al., 2019 להסבר מלא של רכיבים אלה). בחירה זו נעשתה בגלל נתונים זמינים ולמען הפשטות. עם זאת, מכיוון שכל השטפים הללו מביאים להפסדי SOC, זה עלול לגרום להערכת יתר עולמית של מאזני הפחמן המוצעים כאן. RothC עצמו אינו מייצג כמה שטפי פלט, כולל הובלה אנכית בשכבה העמוקה עקב ביולוגית או סחיפה או הובלה לרוחב עקב שחיקה. זה עשוי לתרום גם להערכת יתר של איזון הפחמן, אך השטפים שאינם מיוצגים נחשבים לסדר שני לעומת הנשימה הטרוטרופית (Jagercikova et al., 2014 Naipal et al., 2018 Warner et al., 2019) וקשה במיוחד ל מודל בקנה מידה אזורי.

    תרשים של הגישה המוצעת. משתני הקלט העיקריים הם מלאי הפחמן האורגני הנוכחי בקרקע (), פרודוקטיביות ראשונית נטו זמינה () ותוכן חימר. שני מקרים נשקלים. הראשון עוסק במניות SOC הנוכחיות והשני ביעד 4 אינץ '. שני מאזני הפחמן (, משוואה 6) והגירעון הרוויה בפחמן (, משוואה 7) משמשים להערכת הסטטוס של מניות SOC הנוכחיות והיתכנות היעד של 4 ‰. שים לב שמשתנה הקלט של אדמת חרס משמש לחישובי RothC לשניהם ו . השערת המצב היציב מאפשרת להעריך באמצעות משוואה (3), הצד הימני שלה נקרא כאן למען התמציתיות. המגמות הצפויות של המניות הנוכחיות והיתכנותן של 4 אינן מהוות בחשבון שינויים אפשריים עתידיים בשיעורי המינרליזציה של SOC

    מספר מערכי נתונים אוחדו להניב הערכות מרחביות של , , ו ברשת שלנו 1 ק"מ × 1 ק"מ, תלוי בשימוש הקרקע של תאי הרשת. לאחר מכן נעשה שימוש בהשוואת התוצאות שהניבו מקורות נתוני הקלט כדי לדון בחוסר הוודאות של התוצאות שלנו. מערכי נתונים אלה כללו אומדני NPP הנגזרים מ- MODIS לתקופה 2001–2012 (Zhao et al., 2005), NPP וההתייחסות האנושית שלו לשנת 2006 (Plutzar et al., 2016, באמצעות מודל LPJml ליערות ולשטחי דשא וכן מודל המבוסס על נתונים סטטיסטיים של תשואות אזוריות עבור חקלאות). LPJml הוא מודל עולמי (GM), כלומר למרות שהוא מהווה וריאציות של פריון הצמחים, באזורים מנוהלים ולא מנוהלים, הוא עושה זאת פחות ספציפי מאשר מודלים של תחומים (DM), למשל, דגמים המוקדשים לכרי דשא ושטחי אדמה. נתוני המלאי הצרפתיים שימשו להערכת ניכוס אנושי ביערות (IGN, 2018). נתוני NPP וניכוס אנושי שהניבו סימולציות קודמות (Tibi & Therond, 2018) עם מודלים מתחום STICS (מודל גידול, Brisson et al., 1998, 2003) ו- PASIM (מודל הדמיית מרעה, Riedo et al., 1998) שימשו גם. לבסוף, עבור משתנה, השתמשנו בנתונים שהורכבו ממלאי לאומי כדי להעריך הפריה אורגנית (Tibi & Therond, 2018). אופן שילוב מקורות הנתונים השונים בהתאם לשימוש הקרקעי מפורט בטבלה 1 של מידע תומך S1.

    2.4 אומדנים של רמות הרוויה של SOC וגירעון הרוויה

    מספר מחקרים העריכו פוטנציאל לרכישת C או גירעון רוויה C (כלומר SOC נוסף שניתן לייצב בחלק העדין) על פני שימושים שונים של קרקע (יבולים, שטחי יער, יערות) במידה רבה (Angers et al., 2011 Chen et al., 2018 Wiesmeier, Hübner, Spörlein, et al., 2014). הערכנו את רמת הרוויה של SOC () מבוסס על ריכוזים של שברים עדינים מינרלים ויישם את המשוואה שהציע Hassink (1997). תוכן השברים הדקים כולל את החלקיק בגודל & lt20 מיקרומטר (%). כדי להעריך שברי סחף עדינים (2–20 מיקרומטר) לכל אחד מתאי הרשת של קילומטר × 1 ק"מ, שילבנו את תחזיות החימר של GlobalSoilMap של חימר (& lt2 מיקרומטר) עם הערכות של חימר: יחס סחט עדין המבוסס על נתוני רשת ניטור הקרקע הצרפתית ( Réseau de Mesures de la Qualité des Sols: RMQS, Jolivet et al., 2006). סכום החימר ושברי הסחטה הדקים שימש לאחר מכן במשוואת האסינק כדי לאמוד את רמות הרוויה ב- SOC. מתוך תוכן SOC ברוויה, מלאי SOC ברוויה נאמד באותה שיטה כפי שהוסברה בעבר עבור תחזיות המבוססות על תוכן GobalSoilMap SOC. גירעון הרוויה ב- SOC הוערך אז כ- (7) איפה (Mg ha -1) היא מניית SOC ברוויה ו ו הם מניית SOC בבריכות HUM ו- IOM כפי שחזו על ידי RothC עבור מניית SOC הנוכחית. בכך הנחנו כי בריכות הסל"ד וה- DPM של RothC זהות לחומר אורגני חלקיקי, מעצם הגדרתו לא נכלל בחומר אורגני בקרקע הקשור לשבר העדין (סטיוארט ואח ', 2007), ובהמשך, הנחנו שפחמן בריכת ה- BIO הייתה זניחה בהשוואה לזו שבבריכות HUM ו- IOM.

    2.5 ניתוח אי וודאות

    ניתוח אי הוודאות שלנו כלל הערכת השונות של מאזן הפחמן 4 () ושל גירעון הרוויה (). כללנו את כל המשתנים והפרמטרים ששימשו בחישובם ואשר לגביהם היה מידע על השונות זמין. השתמשנו בהערכות אי הוודאות של הערכות החימר וה-SOC המצורפות לנתוני GlobalSoilMap. למרות שאי הוודאות הקשורה למוצרי NPP לא הייתה זמינה, כללנו בניתוח במפורש את השונות הנובעת משימוש במקורות שונים של נתוני NPP. שונות זו נחשבה כמייצגת את אי הוודאות הקשורה בידע הנוכחי של רמות NPP. כללנו גם אי ודאות הקשורה לפרמטרים כשהיא הייתה זמינה, כלומר לפרמטרים של ה- ע'לִגלוֹשׁ פונקציה (Balesdent et al., 2018), לפרמטרים של הפונקציה המשמשת להערכת כמות הפחמן האורגני האינרט (Falloon et al., 1998) ולפרמטרים של המשוואה המשמשת להערכת הגירעון של רוויית הפחמן (Hassink, 1997). התפשטות אי הוודאות המצורפת למשתני הפרמטרים והפרמטרים הללו התבססה על ניסוח אנליטי של ו תוך ניצול, בין היתר, מהפשטות של מודל RothC והזמינות של פתרונות מפורשים של משוואה (1) (ראה מידע תומך S3). יישמנו ניתוח טיילור מסדר ראשון כדי לחשב את השונות של פונקציות ביניים של ו , גישה אשר יושמה בעבר במדעי הקרקע (Heuvelink et al., 1989 Román Dobarco et al., 2019). השימוש בניתוח טיילור מאפשר לאדם להעריך את השונות של כל פונקציה מובחנת ברציפות של קבוצת משתנים או פרמטרים. לגישה זו היתרון הגדול לצמצום זמן החישוב (בהשוואה לגישות מונטה-קרלו) ולהקל על זיהוי מקורות אי הוודאות השונים. פרטים על ההליך שלנו מוצגים במידע התומך S2.


    תוצאות

    יכולת שחזור של מדידות בודדות חוזרות

    לא היו הבדלים מוחלטים או יחסיים שיטתיים ב- VO2 ו- HR בין אירוע המדידה הראשון לשני במעבדה (טבלה 3).

    מיצוב שיעורי העבודה עבור HR-VO2 יחסים במעבדה

    שלושת קצבי העבודה התת-מקסימליים, המשמשים בשני הדגמים של HR-VO2 משוואות רגרסיה, רמות ממוצעות של HR הנע בין 97 ± 8 עד 139 ± 18 פעימות לדקה אצל הזכרים, ובין 98 ± 8 עד 150 ± 10 עבור הנקבות (טבלה 3). לקבלת משאבי אנוש מקסימליים והיבטים תיאוריים אחרים של קצבי העבודה בשימוש, ראה טבלאות 3 ו-4.

    רמות HR מרכיבה על אופניים נוסעים משמשות להערכת רמות VO2

    הערכים הממוצעים של 20% מקטעי הדופק הנמוכים ביותר, הביניים והגבוהים ביותר במהלך הרכיבה על אופניים וערכי ה-HR הממוצעים שלהם מתוארים בטבלה 5.

    הרמות המקבילות של אחוז עמידות הדופק ואחוז HRמקסימום ניתנים גם (ממוצע ± SD).

    הרמות הממוצעות של כל משאבי האנוש (לא מוצג) היו נמוכות במקצת מחמישית הביניים מהגודל שהוזמן. הסיבה לכך היא שה-1/5 הנמוך ביותר של HR הוא בבירור רחוק יותר מ-1/5 הביניים מהמרחק ל-1/5 הגבוה ביותר של HR.

    שחזור של HR-VO2 משוואות רגרסיה ורמות משוערות של VO2 (דגם 1)

    הבדיקה והבדיקה החוזרת של HR-VO2 משוואות רגרסיה ורמות ספיגה משוערות של ספיגת חמצן משלוש רמות HR מוצגות בטבלאות 6 ו 7. הייתה נטייה ליירוט y נמוך יותר ושיפוע גדול יותר במשוואות הרגרסיה במבחן החוזר בהשוואה לבדיקה (טבלה 6) . בהתבסס על חישובים של כל הנבדקים, לא היו הבדלים שיטתיים ברמות המוחלטות המוערכות של VO2 בין הבדיקה לבדיקה חוזרת. ההבדלים היחסיים בין בדיקה לבדיקה חוזרת היו 0.99 ± 11.0 (נ.ש.), 2.67 ± 6.48 (p<0.1) ו-3.57 ± 6.24% (p<0.05) בהתבסס על הערכות מהרמה הנמוכה ביותר לגבוהה ביותר של HR (טבלה 7). הנתונים האישיים של כל הטבלאות (טבלאות 6-11) קשורות להערכות של HR-VO2 היחסים ניתנים כתוצאות מידע תומכות S1. מגבלות ההסכמה של 95% לשונות הבודדות בהבדלים ב- VO המשוער2 בין הבדיקה לבדיקה חוזרת השתנו בין -0.3155 ל- 0.2923) (L · דקה -1) עבור ה- HR הנמוך, -0.3922 ו- 0.2764 עבור HR באמצע, ו- -0.4735 ו- 0.3029 עבור ה- HR הגבוה (איור 2).

    צירי ה- y מראים הבדלים מוחלטים ב- VO2 כנגד הערכים הממוצעים של האומדנים מהמידות החוזרות על צירי ה- x.

    יכולת שחזור של HR-VO2 משוואות רגרסיה ורמות משוערות של VO2 (דגם 2)

    הבדיקה והבדיקה החוזרת של HR-VO2 משוואות רגרסיה ורמות משוערות של ספיגת חמצן משלוש רמות של HR מוצגות בטבלאות 8 ו-9. לא היו הבדלים מובהקים בין בדיקה לבדיקה חוזרת במרכיבי משוואות הרגרסיה (יוחט y, שיפוע וערך r) (טבלה) 8). בהתבסס על חישובים של כל הנבדקים, לא היו הבדלים שיטתיים ברמות מוחלטות של ספיגת החמצן בין הבדיקה לבדיקה חוזרת. ההבדלים היחסיים בין הבדיקה לבדיקה חוזרת, בהתבסס על הערכות משלוש רמות HR שונות, היו 1.09 ± 10.6, 1.75 ± 6.43 ו 2.12 ± 5.92% (כל מס ') (טבלה 9). גבולות ההסכמה של 95% עבור השינויים האישיים בהבדלים ב-VO המשוער2 בין בדיקה לבדיקה חוזרת השתנו בין -0.2894 ל-0.2684)(L · min -1) עבור HR נמוך, -0.3233 ו-0.2539 עבור HR האמצעי, ו-0.3649 ו-0.2722 עבור HR גבוה (איור 3).

    צירי ה- y מראים הבדלים מוחלטים ב- VO2 כנגד הערכים הממוצעים של האומדנים מהמידות החוזרות על צירי ה- x.

    השוואות במשוואות רגרסיה וב- VO משוער2 בין HR-VO2 יחסים במודל 1 ו -2

    ההבדלים בין שני HR-VO2 מודלים בחיתוך y, שיפוע, ערך r וכן בשלוש הרמות של VO משוער2 במבחן ובמבחן החוזר הושוו עבור כל הנבדקים (טבלאות 10 ו-11). כל ההבדלים בין הדגמים היו קטנים ולא משמעותיים. ההבדלים הממוצעים המוחלטים והיחסיים ב- VO2 נע בין 0.00 ± 0.04 ל-0.04 ± 0.10 ליטר/דקה (כל נ"ס) ו-0.10 ± 3.39 עד -1.46 ± 3.30% (כל נ"ס), בהתאמה.


    איזור לימוד

    אזור המחקר היה ממוקם בפארק הטבעי של אל אסטרכו, בטאריפה (דרום ספרד) על החוף הצפוני של מיצר גיברלטר (איור 1 36°07′−36°06′N, 5°45′−5° 46′W). אזור זה היה האזור המוגן הדרומי ביותר באירופה. זה היה פארק ימי -יבשתי לאורך 54 ק"מ של קו החוף באנדלוסיה ואזור ציפורים חשובות (Guerra García et al. 2009, BirdLife International 2017). בתחום זה, פרר ואחרים. (2012) דיווחו על שיעורי ההתנגשות הגדולים ביותר שפורסמו אי פעם עבור ציפורים (1.33/טורבינה/שנה) כאשר נשר הגריפון הוא המין המומת בתדירות הגבוהה ביותר (0.41 מקרי מוות/טורבינה/שנה). היו מספר מושבות נשר של גריפון באזור, המורכבות מכ -320 זוגות רבייה בסך הכל. התמקדנו במושבה במדרון הנמשך מצפון – דרום, 4 קילומטרים מצרי גיברלטר עם כ -65 זוגות רבייה (Del Moral 2009). הניתוח שלנו הוגבל למרחב ששימש עפר ​​גריפון מתויג אחד, המרחב הקיף שטח של 152 קמ"ר וכלל 20 חוות רוח עם 269 טורבינות תפעוליות (טבלה 1).

    דֶגֶם צבע באיור 1 מספר טורבינות גובה רכזת אורך הלהב גובה כולל
    ECOTECNIA ECO-74 34 70 35.5 105.5
    ENERCON E-70 20 84 33.5 117.5
    GAMESA G-80 30 67 40.0 107.0
    GAMESA G-87 11 78 42.3 120.3
    תוצרת AE-56 43 60 27.3 87.3
    תוצרת AE-59 55 60 28.8 88.8
    VESTAS V-72 4 78 36.0 114.0
    VESTAS V-80 6 78 40.0 118.0
    VESTAS V-90 66 80 44.0 124.0

    2 זרימת עבודה של ניקוי ואינטגרציה של נתונים

    כפי שתואר על ידי 2016, Enquist et al. ) ., 2013) (2) מזהה ומסמן תצפיות עם קואורדינטות גיאוגרפיות שגויות ו-(3) מסמן זנים ומינים לא מקומיים באמצעות ה-Native Species Resolver (http://bien.nceas.ucsb.edu/bien/tools/nsr/ ). קואורדינטות סומנו כטעות אם הן נפלו מחוץ לאזורים הפוליטיים שצוינו, אם קו הרוחב היה בדיוק 0 או 90 מעלות, האורך היה 0 או 180 מעלות בדיוק, או אם הנקודה נפלה באוקיינוס. זיהוי זנים ורשומות לא מקומיות מסתמך על רשימות מינים מקומיים, שאינם זמינים בכל העולם החדש, ולכן סינון זה אינו מושלם.

    מפות טווח נבנו עבור כל מין בשיטה שנקבעה על פי מספר התצפיות של אותו מין. למין בעל תיעוד בודד הוקצה טווח שכלל רק את התא של 100 ק"מ 2 שבו הוא נמצא. טווחים עבור מינים עם 2-3 תיעודים היו תיבות תוחמות מלבניות עם הגבולות שנקבעו על ידי קו הרוחב והאורך המינימלי והמקסימלי של כל ההתרחשויות. טווחים למינים עם 4-9 תיעודים נבנו עם קליפות קמורות (המצולע המתאים למינימום המקיף את כל ההתרחשויות של אותו מין). למינים עם רשומות & gt9, בנינו מודלים של הפצת מינים באמצעות האלגוריתם Maxent (Phillips, Anderson & Schapire, 2006). רק שיא התרחשות אחד לכל תא (במקרים של רישומים מרובים) שימש לבניית מודל Maxent. בניית מודל מקסנט פעלה בדרך כלל על פי ההמלצות המפורטות ב (Merow, Cory, & Silander, 2014 Merow, Cory, Smith, & Silander, 2013). נבחרו הגדרות דגמים כדי לאזן התאמת יתר, הממעיטה בממדי גודל טווח, עם תת התאמה, מה שמביא למודלים חלקים מדי החזקים את גודל הטווח. נעשה שימוש רק בתכונות לינאריות, ריבועיות ומוצרים והסדרה נקבעה בערך ברירת המחדל.

    מנבאים סביבתיים ל- SDM התקבלו מנתוני האקלים הנוכחיים (1960–1990) של WorldClim ברזולוציה של 10 דקות קשת (Hijmans, Cameron, Parra, Jones, & Jarvis, 2005) ונדגמו מחדש לרזולוציה של 10 ק"מ. החזאים כללו טמפרטורה שנתית ממוצעת, טווח טמפרטורות יומי ממוצע, משקעים שנתיים, עונתיות משקעים, משקעים ברבע החם ביותר/(משקעים ברבע החם ביותר + משקעים ברבע הקרה ביותר), וחמישה וקטורים עצמיים מרחביים (De Marco, Diniz-Filho, & Bini, 2008 ). הווקטורים העצמיים המרחביים תפסו בעצם הבדלים אזוריים בקנה מידה גדול בהתרחשות ושימשו בעיקר כמגבלת פיזור בקנה מידה רחב של טווחי מינים, והגבילו תחזיות רחוקות במרחב הגיאוגרפי ממיקומי נוכחות (Blach-Overgaard, Svenning, Dransfield, Greve, & Balslev, 2010) .

    התחזיות הרצופות של מקסנט הומרו לתחזיות נוכחות/היעדרות בינאריות על ידי בחירת סף המבוסס על האחוזון ה -75 של התפוקה המצטברת.

    בנינו פילוגניה של 18,641 מינים המבוססים על רשימה סטנדרטית של מינים מהעולם החדש ואזורי הגן atpB-rbcL, ndhF, psbA, psbA-psbH, rbcL ו- trnT-trnL-trnF, תוך שימוש בתוכנת PHLAWD (Smith, Beaulieu , ודנוגה, 2009). הפילוגניה נבנתה עם RAxML (7.3.0 Stamatakis, 2006) עם חיפושים בלתי מוגבלים של ML וזמני ההבדלים נאמדו באמצעות סבירות שנענשה וחבילת תוכנת העץ PL (Smith & O'Meara, 2012). פרטים נוספים על המתודולוגיה המשמשת לחילוץ נתונים אלה מ- GenBank ויישורם מוצגים בהינליף וסמית (2014). על פילוגניה זו, השתלנו את הטקסים הנוספים ממערך הנתונים של BIEN תוך שימוש בטקסונומיה (חברות בסוג) כמדריך לשאר ג. 72,000 מינים. השתלה זו חזרה על עצמה ליצירת מערך של 100 פילוגניות כדי להסביר את אי הוודאות במיקום מינים ללא מידע גנטי. מידע נוסף על הפילוגניות של BIEN זמין באינטרנט (http://bien.nceas.ucsb.edu/bien/biendata/bien-2/phylogeny/).


    3. תוצאות

    3.1 PRF שומר על הכדאיות ומגביר את ריבוי המקרופאגים

    כדי לחקור את ההשפעה של תמציות מסיסות של ממברנות PRF על כדאיות התא, בוצע בדיקת MTT המשקפת את ייצור הפורמזן תלוי NAD(P)H. ריכוזים מתחת ל-10% של PRF הגבירו באופן ניכר את ייצור הפורמזן במקרופאגים ראשוניים ובתאים RAW264.7 (איור 1A). יתר על כן, 30% lysates PRF לא השפיעו על הכדאיות של תאי מח עצם עכברים מבודדים טריים (נתונים לא מוצגים). כדאיות התא אושרה עוד יותר על ידי צביעה חיה-מתה בתאי RAW264.7 (איור 1B). בנוסף, PRF שיפרה עוד יותר את שילוב ה- BrdU המעיד על ריבוי מוגבר של תאי RAW264.7 (ראה טבלת מידע תומך 2 באינטרנט כתב העת לפריודונטולוגיה). יתר על כן, PRF נטה להפחית את רמות הביטוי של Bax פרו-אפופטוטית ו- caspase-3 יחד עם הגן הסמן האנטי-אפופטוטי לימפומה תא B (BCL2L1) (ראה טבלה 3 של מידע תומך באינטרנט כתב עת לפריודונטולוגיה). נטייה זו נתמכה עוד יותר על ידי חשיפת תאי RAW264.7 ל-30% PRF. Lysates של PRF דיכאו את הרמות הבסיסיות של caspase-3 שסוע (ראה איור 1 משלים באינטרנט כתב העת לפריודונטולוגיה) וגרמה לירידה חלשה בפעילות caspase-3 (ראה מידע תומך איור 1 באינטרנט כתב העת לפריודונטולוגיה). בסך הכל, תוצאות אלה מגלות כי תמציות מסיסות של ממברנות PRF שומרות על כדאיות ומגבירות את התפשטות המקרופאגים הראשוניים.

    3.2 PRF מפחית את הביטוי של TRAP ו-Cathepsin K

    כדי לקבוע את המצב הניסוי המתאים ביותר, הערכנו את ההשפעה של ריכוזים שונים של PRF על ביטוי גנים. תאי מח עצם מוגרים הודגרו עם ריכוזים שונים של תמציות מסיסות של ממברנות PRF בנוכחות RANKL ו-M-CSF. עקומות מינון-תגובה חשפו דיכוי של הגנים לסמן האוסטאוקלסטים TRAP ו-Cathepsin K על ידי תוספת של PRF (איור 2A). לאחר מכן, הודגרו תאי מוח עצם עכברים עם אותם ריכוזים של PRF אך בנוכחות RANKL, M-CSF ו- TGF-β. שוב, PRF הפחית את הביטוי של הגנים לסמן האוסטאוקלסטים TRAP ו-Cathepsin K באופן תלוי מינון (איור 2B). יחדיו, תוצאות אלו מצביעות על כך ש -50% מהתמציות המסיסות של ממברנות ה- PRF מהוות ריכוז מתאים להפחתה מהותית של גני הסמן האוסטאוקלסט הנ"ל.

    3.3 PRF מפחית את התמיינות האוסטאוקלסט במבחנה

    כדי לבחון עוד את התפקיד הפוטנציאלי של PRF בהתמיינות אוסטאוקלסטית, גודלו תאי מח עצם של עכברים בנוכחות של 50% תמציות מסיסות של ממברנות PRF עם RANKL ו-M-CSF. אנו מדווחים כאן כי PRF הפחית מאוד את מספר התאים מרובי הגרעינים שצובעו חיוביים עבור TRAP (איורים 3A ו- 3B) וגם את מספר הגרעינים בהתאמה לתאים (ראה מידע תומך בטבלה 4 במקוון כתב העת לפריודונטולוגיה). בהתאם לתצפית זו, PRF הפחית את הביטוי של TRAP ושל Cathepsin K, שניהם אנזימים הדרושים לספיגת עצם (איור 3C). בנוסף, גנים אחרים של סמן האוסטאוקלסט DCSTAMP, NFATc1 ו- OSCAR דוכאו גם על ידי תמציות מסיסות של ממברנות PRF (איור 3C). בסך הכל, תצפיות אלה מצביעות על כך ש- PRF יכול לעכב אוסטאוקלסטוגנזה.

    3.4 PRF מפחית את התמיינות האוסטאוקלסט הנגרמת על ידי RANKL, M-CSF ו- TGF-β

    כדי לעורר אוסטאוקלסטוגנזה עוד יותר, TGF-β נוספה ל- RANKL ו- M-CSF כפי שתואר לעיל. 20 כצפוי, תוספת של TGF-β העלתה באופן ניכר את האוסטאוקלסטוגנזה בהשוואה לתרביות RANKL ו-M-CSF. 20 בעיקר, תמציות מסיסות של ממברנות PRF בריכוז של 50% הפחיתו באופן משמעותי את האוסטאוקלסטוגנזה בתנאים אלה כפי שמצוין במספר התאים החיוביים של TRAP רב -גרעיניים (איורים 4 א ו -4 ב) ומספר מופחת של גרעינים לתאים (ראה טבלת מידע תומך 4 ב באינטרנט כתב העת לפריודונטולוגיה). יתר על כן, lysates PRF הפחית את הביטוי של TRAP ו- Cathepsin K כמו גם DCSTAMP, NFATc1 ו- OSCAR (איור 4C). דיכוי זה של אוסטאוקלסטוגנזה על ידי lysates PRF אומת עוד על ידי מבחן היווצרות בור (ראה מידע תומך איור 2 באינטרנט כתב העת לפריודונטולוגיה). יחדיו, ממצאים אלה מצביעים על כך ש- PRF מדכא אוסטאוקלסטוגנזה ללא תלות במבחן הביולוגי.

    3.5 PRF אינו יכול להפוך אוסטאוקלסטוגנזה בשלבים מאוחרים יותר

    בהתחשב בכך ש- PRF הפחית את הבידול של אוסטאוקלסטים מאבותיהם, נשאלת השאלה אם PRF יכול להפוך את התהליך הזה. כדי לענות על שאלה זו, גודלו תאי מח עצם של עכברים בנוכחות RANKL ו-M-CSF. לאחר 72 שעות נוספה PRF לתאים למשך 72 שעות נוספות. כפי שמוצג באיורים 5A ו- 5D, תאים גדולים מרובי גרעינים המוכתמים ל- TRAP נצפו ללא קשר אם נוספה PRF. יתר על כן, PRF לא הצליח להפחית את מספר האוסטאוקלסטים (איורים 5D ו- 5F) ולא את מספר הגרעינים לכל תא (הנתונים אינם מוצגים). יתר על כן, PRF לא הצליח לשנות באופן משמעותי את ביטוי הגנים של גני סמן האוסטאוקלסט (איור 5C), גם בנוכחות TGF-β (איור 5F). ממצאים אלה מצביעים על כך ש- PRF אינו מסוגל להפוך את האוסטאוקלסטוגנזה כאשר התהליך החל.

    3.6 גורמי גדילה המשתחררים באופן טבעי על ידי PRF מפחיתים אוסטאוקלסטוגנזה

    לבסוף, כדי לדמות שחרור טבעי של גורמי גדילה ממברנות PRF, הועברו ממברנות לתוך מצע תרבות. לאחר 24 ו -72 שעות נאסף המדיום המותנה. 18 הנתונים שלנו מראים כי בינוני מותנה ב- PRF, ללא תלות בזמן הקציר, הפחתת האוסטאוקלסטוגנזה בנוכחות RANKL, M-CSF ו- TGF-β, המסומנים על ידי צביעת TRAP (לא מוצג) והביטוי של TRAP ו- Cathepsin K (איורים 6A ו- 6B). בסך הכל, תצפיות אלה מצביעות על כך ש- PRF משחרר פעילות המפחיתה אוסטאוקלסטוגנזה.


    אדנוזין טריפוספטאזים מסוג Vesicular או Vacuolar (V-ATPases) הם משאבות פרוטון מונעות ATP המונעות בתפקידים חשובים בתהליכים פיזיולוגיים רבים על ידי החמצת שלפוחיות תאיים, אברונים והסביבה החוץ-תאית. אתגרים ארוכי שנים בטיהור V-ATPases של יונקים הגבילו את המחקר הביוכימי והמבני של V-ATPase של יונקים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לטיהור מיליגרם של V-ATPase אנושי ומפרט נהלים לשחזור המבנה שלו על ידי cryo-EM. ניתן ליישם את השיטה שלנו על כל מחקר ביוכימי וביופיזי על V-ATPase אנושי.

    לפרטים מלאים על השימוש והביצוע של פרוטוקול זה, עיין ב-Wang et al. (2020).


    צפו בסרטון: xds סדרת הרמקולים של אוסטרלין מוניטור (נוֹבֶמבֶּר 2022).