מֵידָע

כיצד קליטת פלסמידים על הלם חום אבולוציונית מועילה לחיידקים?

כיצד קליטת פלסמידים על הלם חום אבולוציונית מועילה לחיידקים?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

במהלך פרוטוקול הטרנספורמציה אנו מפעילים הלם חום על חיידקים כדי לגרום להם לקלוט פלסמידים מסביבתם. זה ממש שימושי במעבדה.

עם זאת, הוא מציג פרדוקס אבולוציוני בהקשר גדול יותר, אם חיידקים יתחילו לתפוס פלסמידים צפים חופשיים במצוקה, סביר להניח שהם ירכשו גנים מהחיידקים האחרים, שנספו באותה מצוקה, כך שסביר להניח שהגנים האלה לא יהיו שימושי נגד המצוקה שלהם.

אני בטוח שיש כאן גורמים נוספים כדי לפתור את הפרדוקס הזה. מה הם?


הדבר הפשוט ביותר הוא שהם לא. לא כל מה שאורגניזם עושה או שיש לו הוא יתרון, רבות מהן תופעות לוואי של מנגנונים אחרים או במקרה של הלם חום אתה יוצר בכוונה תנאים מאוד לא סבירים לשבור מנגנונים קיימים. במקרה של הלם חום, חום גבוה יחד עם רמות סידן גבוהות מאוד מפרק את המנגנונים התקינים שמונעים מפלסמידים להיכנס לתא, לאחר שהדיפוזיה הנורמלית משתלטת. זה כמו לשאול מדוע התפתחנו לספוג חומר שהוזרק לנו, לא הזרקנו עוקף את מנגנוני ההגנה הרגילים. זה דומה לשימוש ב-DMSO כדי לשאת מולקולות על פני העור, DMSO הוא כל כך לא סביר בטבע שמעולם לא הייתה סיבה לפתח עבורו הגנה.


חיבור עם חיידק מגן חדש מאפשר הסתגלות של המארח לסביבה מלחיצה

סימביונטים מגנים יכולים לאפשר למארחים לכבוש נישות שאינן ניתנות למגורים. למרות החשיבות של סימביונים באבולוציה של המארח, אנו יודעים מעט על האופן שבו נוצרות אסוציאציות אלו. מפגש עם חיידק שיכול לשפר את כושר המארח בסביבה מלחיצה עשוי להעדיף אינטראקציות מתמשכות עם החיידק הזה, דבר שעלול להקל על קשר ארוך טווח. החיידק Bacillus subtilis מגן Caenorhabditis elegans נמטודות מהלם חום על ידי הגדלת פוריות המארח בהשוואה לא -מגן אי קולי. במחקר זה אנו שואלים כיצד ההגנה המספקת החיידק משפיעה על מסלול האבולוציה של המארח. בגלל ניגוד הכושר הגמור בין המארחים החום הלם B. subtilis נגד אי - קולי, בדקנו האם ההגנה שמעניקים החיידקים יכולה להגביר את קצב ההסתגלות של המארח לסביבה מלחיצה. עברנו נמטודות הלאה B. subtilis אוֹ אי - קולי, תחת לחץ חום או תנאים סטנדרטיים עבור 20 דורות מארח של בחירה. כאשר נבדקו תחת לחץ חום, גילינו כי המארחים הציגו את העלייה הגדולה ביותר בכושר כאשר התפתחו עם B. subtilis תחת לחץ לעומת כאשר התפתח עם אי - קולי או בתנאים סטנדרטיים (ללא לחץ). יתר על כן, למרות שלא בחרו ישירות עבור גדל B. subtilis כושר, גילינו שהמארחים התפתחו כדי להכיל יותר B. subtilis כפי שהם הסתגלו ללחץ חום. הממצאים שלנו מראים שההקשר שבו מתפתחים מארחים חשוב להתפתחות האסוציאציות המועילות וכי חיידקים מגנים יכולים להקל על הסתגלות המארח ללחץ. בתורו, הסתגלות מארח כזו יכולה להועיל לחיידק.


תַקצִיר

הביטוי של גנים של הלם חום ב אי קולי מוסדר על ידי הפעולה האנטגוניסטית של מפעיל התעתיק, יחידת המשנה σ 32 של פולימראז RNA ומאפננים שליליים. מאפננים הם מערכת המלווים של DnaK, אשר מבטלת ומייצרת את σ 32 ואת פרוטאז ה- FtsH, האחראי במידה רבה להתדרדרות σ 32. השערה שטרם הוכחה היא שמידת ההקפדה של המאפננים באמצעות קישור לחלבונים המקופלים בצורה לא נכונה קובעת את רמת התעתיק של גן הלם חום. השערה זו נבדקה על ידי שינוי ריכוז המאפנן בתאים המבטאים dnaK, dnaJ ו ftsH ממקדמי IPTG ומקדמים מבוקרי ערבינוזה. עליות קטנות ברמות ה-DnaK וה-DnaJ co-chaperone (פי 1.5 מט מהסוג הבר) הביאו לירידה ברמה והפעילות של σ 32 בטמפרטורת ביניים ולכיבוי מהיר יותר של תגובת הלם החום. ירידות קטנות ברמות שלהם גרמו להשפעות הפוכות, ובנוסף, הפחיתו את יעילות הקיפול מחדש של חלבון שעבר דנטורציה בחום וצמיחה בטמפרטורות הלם חום. פחות מ 1500 מולקולות של מצע של מערכת DnaK, לוציפראז גחלילית לא יציב מבחינה מבנית, הביאו לרמות גבוהות של חלבוני הלם חום ולשלב כיבוי ממושך של תגובת הלם החום. לעומת זאת, ירידה ברמות ה- FtsH הגדילה את רמות σ 32, אך ה- σ 32 שהצטבר לא היה פעיל, מה שמעיד על כך שהסתירה של FtsH בלבד אינה יכולה לגרום לתגובת הלם החום ביעילות. DnaK ו-DnaJ מהווים אפוא את מערכת חישת הלחץ וההמרה העיקרית של ה- אי - קולי תגובת הלם חום, המזהה קיפול מוטעה של חלבון ברגישות גבוהה.


אינדוקציה Hsp72 תוך תאית

הגן ל- Hsp72 מכיל לפחות שני אלמנטים רגולטוריים המתקיימים אינטראקציה עם גורמי תעתוק הלם חום (HSF) [9, 10]. באופן ספציפי, אינדוקציה של חלבון Hsp72 דורשת קישור HSF1 לאלמנט הלם החום באזור האמרגן של הגן Hsp70 [11]. Hsp70 mRNA מועתק, וכתוצאה מכך לסינתזה והצטברות של חלבון Hsp72 ציטוזולי [12]. גורמים רבים גורמים לשעתוק ולתרגום של חלבון Hsp72 תוך -תאי, ואלו משתנים בהתאם לרקמה שנבדקה. בין האותות השונים להשראת Hsp72 תוך תאי ניתן למצוא הורמון אדרנוקורטיקוטרופין [13, 14], קורטיקוסטרון [151617], מניעת גליקוגן [18, 19], נוראדרנלין (NE) או אפינפרין (E) [5, 7, 82, 202] , חום או היפרתרמיה [15, 24252627], ומתח חמצוני [282930]. ברור שמגוון רחב של אותות פיזיולוגיים מסוגל לעורר סינתזה של Hsp72 תוך תאיים, מה שהופך את זה לתגובה בכל מקום ללחץ התאי.


תאים מגנים על עצמם מפני לחץ על ידי שמירה על ביחד

מגעי תא לתא הכרחיים להישרדותם של תאים אנושיים בתנאים ופוגעים בלחץ. זו הייתה אחת המסקנות שהגיעו על ידי צוות מחקר שעובד בהנהגתה של לאה סיסטונן, פרופסור לביולוגיה של תאים ומולקולרית באוניברסיטת ארינגבו אקדמיה. תוצאות המחקר שלהם פורסמו לאחרונה ב- דוחות תאים כתב עת.

החוקרים הופתעו מהממצאים מכיוון שהמולקולות שלמדו בדרך כלל מקושרות לתפקודים סלולריים אחרים.

"התוצאות שלנו מראות, לראשונה, שהמגעים בין התאים, המכונים הידבקות תאים, חיוניים לתאים לשרוד מתח. הממצאים גם מצביעים על כך שפגיעה בהדבקות תאים עלולה לגרום לרגישות של תאים סרטניים לתרופות הפוגעות בחלבונים של תאים וגורמים ללחץ. , "מסביר סיסטונן.

פרויקט המחקר התמקד בגורם הלם חום 2 (HSF2), גן מיוחד המווסת חלבון, והשפעתו על יכולת התאים לשרוד מתח הפוגע בחלבונים. לחץ פוגע בחלבון נגרם, למשל, מטמפרטורות גבוהות, זיהומים בנגיפים ותרופות מסוימות נגד סרטן.

התוצאות הראו כי HSF2 תורם להגנה על התאים מפני מתח על ידי ויסות הגנים המתווכים את מגעי הידבקות התאים.

התוצאות הושגו על ידי לימוד בין היתר כיצד תאים סרטניים מגיבים לתרופות מסוימות הנפוצות נגד סרטן. תאים סרטניים עם מגעי הידבקות תאים לקויים הצליחו באופן משמעותי פחות לשרוד את הטיפול התרופתי מאשר התאים המראים הידבקות תאים שלמה.

"אנשי הקשר בין התא לתאים חיוניים לתפקוד ולמנגנונים של רקמות תקינות. ידוע שתאי סרטן מנצלים את המגעים הללו ליצירת גידולים וגרורות אגרסיביות. התוצאות שלנו מראות, אכן, שתאים סרטניים הופכים לפגיעים יותר לטיפול תרופתי, כאשר התא שלהם המגעים נחלשים ", אומר סיסטונן.

"מגעי הידבקות תאים מתווכים על ידי חלבונים המכונים קדהרינים, המשמשים מקור לרשתות המסרים המסדירות את מוות התאים, אך הבנת הבסיס המולקולרי לתהליכים אלה דורשת מחקר נוסף. הבדלים אינדיבידואליים בתהליכי התא הספציפיים הללו עשויים להסביר באופן חלקי מדוע מסוימים תרופות פועלות ביעילות עבור חלק מהחולים אך לא עבור אחרים ".

המחקר בראשות פרופסור סיסטונן הוא חלק מפרויקט CellMech, פרויקט פנימי של מרכז מצוינות במכונוסטזיס סלולרי (2019-2023) באוניברסיטת ארינגבו אקדמיה, החוקר את ההשפעות של מתח מכני על האיתות והתפקוד של תאים ורקמות. את פרויקט CellMech מובילה ססיליה סהלגרן, פרופסור לביולוגיה של התא. פיתוח ואבחון תרופות הוא אחד מתחומי המחקר המרכזיים באוניברסיטת ארינגבו אקדמי.


כפרונינים מרובים בחיידקים-פונקציות חדשות והתנהגויות לא קנוניות

Chaperonins הם סוג של מלווים מולקולריים המתאספים לארכיטקטורת טבעת כפולה גדולה כאשר כל טבעת מהווה שבע עד תשע יחידות משנה ומקיפה חלל לאטום מצע. הנחקרים היטב אי קולי chaperonin GroEL קושר מצעים שאינם מקומיים ומכסה אותם בחלל ובכך מסיר את המצעים מתנאים לא נוחים ומאפשר למצעים להתקפל. באמצעות מנגנון זה, GroEL מסייע בקיפול של כ -10-15 % מהחלבונים הסלולריים. באופן מפתיע, כ-30% מהחיידקים מבטאים מספר גנים של צ'פרונין. נוכחותם של צ'פרונינים מרובים מעלה שאלות האם הם מגבירים את יכולת הצ'פרון הכללית בתא או שפיתחו תפקידים תאיים חדשים ספציפיים. למרות שהדעה האחרונה זוכה לתמיכה רחבה, ראיות לראשונה מתחילות להופיע. חלק מהכפרונינים הללו יכולים להחליף באופן פונקציונלי את GroEL in אי - קולי והם בדרך כלל הכרחיים, בעוד שאחרים אינם יעילים וכמו כן הם בלתי ניתנים להפעלה. בנוסף, הודגמו פונקציות של אור ירח למספר צ'אפרונינים, מה שמעיד על מגוון תפקודי בקרב הצ'פרונינים. יתר על כן, מחקרים פרוטאומיים זיהו בריכות מצע מגוונות עבור צ'פרונינים מרובים. אנו סוקרים את התפיסה הנוכחית לגבי צ'פרונינים מרובים והספציפיות הפיזיולוגיות והתפקודיות שלהם.

זוהי תצוגה מקדימה של תוכן המנוי, גישה באמצעות המוסד שלך.


חומרים ושיטות

זנים, פאג' ומדיה

אי - קולי K-12, זן MC4100 [araD Δ (argF-lac) U169 rpsL relA flbB deoC ptsF rbsR] (Casadaban 1976) שימש עבור כל הניסויים in vivo. הווקטור λTLF97-3 (סנט פייר ולין 1996) שימש לבנייתrpoH–lacZ איחוי גנים. בינוני M9 בינוני (Nagai et al. 1991) בתוספת 0.2% גלוקוז, תיאמין (2 מיקרוגרם/מ"ל) וכל חומצות האמינו למעט מתיונין (20 מיקרוגרם/מ"ל כל אחת) שימשו לניסויי תיוג דופק. אגר לקטוז MacConkey (DIFCO) ו- L agar המכילים 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β- d -galactopyranoside (X-gal 30 μg/ml) שימשו לבידוד ליזוגנים λ המכילים rpoH – lacZ היתוך גנים. DNA רקומביננטי וטכניקות כלליות אחרות בוצעו כמתואר על ידי Sambrook et al. (1989) ועל ידי מילר (1972).

כימיקלים, אנזימים וחוצצים

אי - קולי tRNA לא טעוןו Met נרכש מסיגמא, ותעתיק הפוך של נגיף מיאלובלסטוזיס עופות (AMV) היה מ-Life Sciences. מאגר A כלל 10 מ 'טריס-אצטט (pH 7.4), 60 מ' NH4חיץ Cl, 6 מ"מ β-מרקפטואתנול B היה מורכב ממאגר A שאליו נוספו 10 מ"מ Mg-אצטט. מאגר שעתוק הפוך היה מאגר B המכיל 0.375 מ 'dNTPs ו -0.1 U/μl של תעתיק AMV הפוך.

בנייה של rpoH–lacZ איחוי גנים

היתוך הגנים (היתוך תרגום) TLF247, נגזרותיו הנושאות תחליפי בסיס, היתוך גנים מינימלי TLF229Δ(stemIII)GG ופלסמידים המשמשים לבניית היתוכים אלו [pBSK247 ונגזרות pBSK229Δ(stemIII)GG] תוארו (Morita et al. 19999) ). קבוצה של תחליפי בסיס של TLF229Δ(stemIII)GG נבנתה על ידי שימוש בערכת המוטגנזה מבוססת ExSite PCR (Stratagene) עם פריימרים סינתטיים של אוליגונוקלאוטידים הנושאים תחליפי בסיס ו-pBSK229Δ(stemIII)GG כתבנית ה-DNA.Claאני-בםשברי HI של DNAs המוגברים ב- PCR שוכנו לתוך pBSK229Δ (stemIII) GG על ידי החלפת האזור המתאים. רצפי נוקליאוטידים של אזורים מוגברים PCR אושרו על ידי רצף dideoxy. ה Xhoאני-בםשברי HI של הפלסמידים המתקבלים המכילים rpoH מקדמים וחלק 5' של אזור הקידוד הוכנסו לאחר מכן לוקטור λTLF97-3 כדי ליצור היתוך בתוך-frame ל lacZ. מבני היתוך הגנים שהתקבלו הועברו ל- MC4100 על ידי אריזה חוץ גופית ואחריה זיהום. לאחר בידוד מושבה בודד חוזר, המונוליזוגניה של כל מבנה אושרה על ידי PCR כמתואר על ידי פאוול ואח '. (1994).

חיזוי של מבנה משני של RNA

מבנים משניים של RNA ויציבותם (ΔG) ב 30 ° C ו- 42 ° C ניבאו על ידי שימוש בתוכנית mfold שסיפקו צוקר וטרנר באינטרנט (http://www.ibc.wustl.edu/zuker/rna) .

קביעת קצבי סינתזה של חלבוני היתוך

ההליך בו נעשה שימוש היה בעיקרו כפי שתואר קודם לכן (Nagai et al. 1994). מנות (0.1 מ"ל) של תרביות שלב לוג סומנו בדופק עם l-[35S] מתיונין (1200 Ci/mmol, 200 μCi/ml) למשך 2 דקות. תמציות הוכנו לאחר משקעים והשעיה של TCA במאגר SDS, וחלקים בעלי רדיואקטיביות שווה היו מעורבים בכמות קבועה של תמצית תא JM103 (המסומנת ב- [35 S] מתיונין) המכילה חלבון β-galactosidase,, וטופלה בנוגדן כנגד β- galactosidase (Organon Teknika Cappel). המשקעים האימוניים הועברו ל-SDS-PAGE (7.5% ג'ל), והעוצמות של פסים רדיואקטיביים נכומתו באמצעות מנתח הדמיה Fujix BAS2000 לקביעת שיעורי סינתזה של חלבון היתוך לאחר תיקון להתאוששות עם חלבון θ כנקודת התייחסות.

מדידת פרופילי טמפרטורה של ספקטרום CD mRNA (עקומת התכה)

RNA המכילים את הזרם וחלק מה- rpoH אזור הקידוד הוכן במבחנה על ידי T7 RNA פולימראז וערכת MEGAscript (Ambion). ה אקוRV (ממוקם ב -22) -בםשברי HI של pBSK247, pBSK229Δ (stemIII) GG, או נגזרותיהם הנושאות מוטציות הוכנסו לשליטת מקדם ה- T7 של הווקטור pSP72. הפלסמידים שהתקבלו עוכלו עםבםHI ומשמש כתבניות לסינתזת RNA. כל הדגימות למדידות CD הופלו על ידי שימוש בעמודת שלב הפוך (COSMOSIL, Nacalai Tesque) במכשיר HPLC וכמתו על ידי ספיגת UV ב -260 ננומטר לאחר עיכול נוקלאז P1. ה- pH של הפתרון לספקטרום CD נאגר עם 25 מ 'נתרן פוספט (pH 7.0). ריכוז ה- RNA השתנה בין 0.05 ל -9 מיקרומטר עבור ה- RNA הבקרה הנגזר מ- pSP247, ובין 0.3 ל -3 מיקרומטר עבור RNAs אחרים. פרופילי הטמפרטורה של ספקטרום התקליטורים נמדדו באמצעות ספקטרו-קוטר-מד של Jasco J-720WI המצויד בבקר טמפרטורה מסוג Pertier, PTC-348WI. ספקטרום CD נרכשו מ-220 עד 320 ננומטר ב-0°C-81°C (כל 3°C) עם מהירות סריקה של 50 ננומטר/דקה, קבוע זמן של שנייה אחת, רוחב פס ספקטרלי של 1.0 ננומטר ושבע סריקות לכל אחת מהן. טֶמפֶּרָטוּרָה. הטמפרטורה משתנה עם חימום (סריקה למעלה) או קירור (סריקה למטה). בספקטרום התקליטורים בכל טמפרטורה נמצאו ניתנים לשחזור במספר ניסויים. פרופילי טמפרטורה של ספקטרום CD נרשמו לפתרונות בריכוזים שונים כדי לקבוע אם תהליכי הדנטורציה של כל הדגימות היו תהליכים חד -מולקולריים. התוצאות היו עקביות זו עם זו בטווח של רמת רעש, כפי שהונחה כתהליך חד מולקולרי. ספקטרום CD בריכוז RNA של 3 מיקרומטר (סריקה למטה) עובדו בהמשך כמתואר (Kodama et al. 1998). כל עוצמת אות ב-255 ננומטר הוצגה כנגד טמפרטורה, והתאמת עקומה לנתונים לעיל נעשתה כמתואר (Petersheim and Turner 1983 Kodama et al. 1997) בהנחה של שיווי משקל של שלושה מצבים, שכן נצפו שני מעברים (נתונים לא מוצגים) . לאחר מכן, עוצמת האות CD ב 255 ננומטר עבור כל טמפרטורה חולץ ונורמל על ידי שימוש בעוצמות האות ב 0 ° C ו 81 ° C.

מבחני עיכוב הרחבת פריימר (טביעת הרגליים).

RNA המכיל את הזרם וחלק מה rpoH אזור הקידוד (נוקלאוטידים -60 עד +247) הוכן במבחנה על ידי פולימראז T7 RNA עם ערכת שעתוק RNA (Stratagene). הAflII–בםשברי HI של pBSK247 הונחו תחת שליטה של ​​מקדם T7 של וקטור pSP72, והפלסמידים שנוצרו עוכלו עם בםHI ומשמש כתבנית לסינתזת RNA. היווצרות קומפלקס טרינרי המורכב מתת-היחידה הריבוזומלית 30S, mRNA מטרה ו-tRNAו Met, וניתוח עיכוב הארכה בוצעו בעיקרון על פי Hartz to al. (1988). דגימות מטוהרות של ריבוזומים 30S סופקו בחביבות על ידי ד"ר A. Wada (Osaka Medical College Wada 1986). RNAs (100 ננומטר) התחדשו בנוכחות פריימר FAM1p (5 מיקרומטר) פלורסנט המסומן לנוקלאוטידים מ -227 עד +247 על ידי חימום התערובת ב 65 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ואחריו קירור איטי לטמפרטורת החדר. ב 10 μl של מאגר A. לאחר מכן, Mg-acetate נוספה לתערובת RNA המחודש בריכוז סופי של 10 מ"מ. תערובת התגובה (10 μl) הכילה 4 μl של RNA מחודש, 0.375 מ"מ dNTPs, 500 nm 30S ריבוזום ו- 1 μ m יוזם tRNA במאגר B. לאחר הדגירה למשך 5-60 דקות בטמפרטורות שצוינו, התגובות הופסקו. על ידי תוספת של 190 μl של חיץ שעתוק הפוך (דילול פי 20 ראה להלן). היווצרות מורכבים שלוש -צדדית הוערכה כמותית על ידי ביצוע סינתזת cDNA ב -42 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. דגימות טופלו עם proteinase K ו-ribonuclease A, וה-DNA של המוצר חולץ עם פנול/כלורופורם ואחריו משקעים אתנול. חלקים ממוצרי הארכת פריימר הועמסו על ג'ל רצף אוריאה של 8% פוליאקרילאמיד/8 מ ', ואלקטרופורזה ב -1400 וולט למשך 2.5 שעות. מוצרי הרחבת פריימר נמדדו עם פלואורסצנטי BioImage Analyzer FMBIO II Multi-View (Hitachi). המיקומים של הדפסי העותק נקבעו על ידי השוואה עם סולם רצף לרוץ בו זמנית עם אותם פריימרים שכותרתם בסוף.

כאזור B של rpoH mRNA המעורב בדיכוי התרגום ממוקם רחוק במורד הזרם מהעמדה toeprint, רצינו להימנע מסיבוכים אפשריים הנובעים ממתחמי toeprint שנוצרו במהלך הדגירה לצורך שעתוק הפוך. לפיכך, מבחן toeprint בוצע בשני שלבים היווצרות מורכבת ושעתוק הפוך. לאחר היווצרות מורכבת, תערובת התגובה מדוללת פי 20, מה שמנע למעשה היווצרות של מתחמים נוספים. לא זיהינו היווצרות קומפלקס טרינרי כאשר יחידות משנה mRNA ו-30S היו מעורבות בריכוז נמוך כל כך (נתונים לא מוצגים). לאחר שנוצר קומפלקס טרינרי במהלך הדגירה הראשונה, הקומפלקס נשאר יציב וכמעט לא התנתק במהלך הדגירה השנייה (נתונים לא מוצגים).


מנגנונים של חישת חום

היכולת של חיידקים להגיב במהירות לעלייה פתאומית בטמפרטורה תלויה במנגנוני חישת חום המשלבים רמזים סביבתיים כדי להפעיל מסלולי תגובה מתאימים. עד כה תוארו מנגנונים שונים של ויסות תרמי בחיידקים והם כוללים כמעט כל סוגי הביו -מולקולות כולל ליפידים, חלבונים וחומצות גרעין (כלומר. גם DNA וגם RNA). כל המחלקות הללו יכולות לשמש כחיישנים תרמויים המזהים שינויים בטמפרטורה הסביבתית ומניעים תגובות סלולריות רלוונטיות. מנגנוני חישת חום יכולים להיות ישירים, שבאמצעותם הטמפרטורה משפיעה ישירות על פעילותה של הביומולקולה החישה, או יכולים להיות עקיפים, שבאמצעותם מתגלות ההשלכות של עליית טמפרטורה פתאומית (לדוגמה, הצטברות חלבונים שגויים בציטופלזמה). . אף על פי שהטמפרטורה היא אות בכל מקום שמשפיע על מספר מסלולים סלולריים, פרק זה מתמקד בעיקר במנגנוני חישה המפעילים ביטוי גנים של הלם חום, ותתואר רק דוגמאות בודדות של חיישני תרמו המעורבים בוויסות גורמי הקורבן (נסקרה בהרחבה על ידי קלינקרט ונרברהאוס 2009 שפירו וקוון 2012).

חישת טמפרטורה באמצעות RNA

הדרך המהירה ביותר לשנות את ביטוי הגנים בתגובה לשינויים בטמפרטורה מבוססת על א cis-אלמנט רגולטורי שהוא חלק מה-mRNA המקודד לחלבון הלם חום שיש לווסת. מנגנון זה של ויסות תרמי מבטיח תגובה מהירה מאוד על תפיסת האות מכיוון שהטמפרטורה משפיעה על יעילות התרגום של המאגר התוך -תאי של מולקולות ה- mRNA, כמו גם של התעתיק שכבר מתבצע. העיקרון הכללי מבוסס על היווצרות מבנים משניים דמויי רוכסן, רגישים לטמפרטורה, המאפיינים את ה- mRNA הכפופים לתקנה מסוג זה (איור 7 א). בפרט, בטמפרטורה הפיזיולוגית אזור 5 of של קטגוריה זו של mRNA יוצר מבנה המפריע לרכיבי רצף חיוניים ליזום התרגום, כגון האתר המחייב ריבוזום (הידוע גם בשם רצף שיין-דלגרנו) והתחלת התרגום קודון. כאשר רכיבי רצף כאלה מעורבים במבנה משני, ההכרה והקישור של התמליל על ידי הריבוזום נפגמים, ובכך משפיעים לרעה על תרגום ה- mRNA. עם עליית טמפרטורה, המבנה המשני עובר סידור מחדש או התכה חלקית. כתוצאה מכך, ריבוזומים יכולים בקלות לקבל גישה לאזור ה- mRNA 5 אינץ 'והתרגום משתפר. מספר רצפי RNA חיישי טמפרטורה, הידועים גם כמדחום RNA, התגלו ואופיינו בחלק מהפרטים בשני העשורים האחרונים ולאחרונה נסקרו במאמר מקיף ומפורט מאת Kortmann and Narberhaus (2012). מדחום ה- RNA הראשון התגלה ב אי - קולי ומסדיר את הביטוי של גורם הסיגמה האלטרנטיבי של הלם חום σ 32, שכבר נדון לעיל. הוא מייצג את אחד ממדחומי ה- RNA המורכבים ביותר שהיו ידועים עד כה, עם מבנה משני מורחב שאינו מוגבל רק לאזור ה- mRNA 5 ΄ RpoH (איור 1 א). באופן ספציפי, למרות שבמבנה המשני המאופיין רצף שיין-דלגרנו חשוף חלקית, התרגום של RpoH mRNA מונע בטמפרטורה נמוכה על ידי זיווג תוך-מולקולרי בין האזור הבלתי מתורגם 5 and לבין חלק מרצף הקידוד במורד הזרם של קודון ההתחלה של AUG ( קורטמן ונרבהאוס 2012). עם זאת, קיימים מדחומי RNA פשוטים בהרבה, כפי שמדגים זאת השולטת בביטוי Bradyrhizobium japonicum hspA גֵן. זֶה cis-רצף הרגולציה מהווה את החבר המייסד מהמחלקה הנפוצה ביותר של מדחומי RNA הנקרא ROSE for רדיכאון of חום-שגנים של זנב הxpression. יסודות ROSE מעורבים בדרך כלל בוויסות חלבוני הלם חום קטנים ויש להם אורך שנע בין 60 ל -120 נוקלאוטידים. אלמנטים של ROSE הבחינו כיסוד DNA שמור לפני מספר גנים של הלם חום בריזוביה שונים. בתחילה, הועלתה השערה שהם פועלים ברמת ה-DNA ומנגנון הרגולציה שלהם נחשב כתלוי בקישור של חלבון מדכא (Narberhaus ואח '. 1998). שים לב שניתן היה לחזות מבנה משני דומה עבור כל 15 מרכיבי ה-ROSE הידועים, מנגנון פוסט-תעתיק הוצע ואומת על ידי ניתוח מוטציה מפורט של ROSE-hspA-lacZ היתוך תרגום (Nocker ואח '. 2001). אפיונים מולקולריים ומבניים נרחבים לאחר מכן חשפו כמה מאפיינים מרכזיים מסוגים כאלה של מדחום RNA (Chowdhury ואח '. 2003, 2006). מעניין שהוכח כי מדחומי RNA מבוססי ROSE כוללים שניים עד ארבע לולאות גזע וכי הם יכולים להגיב בהדרגה לשינויים בטמפרטורה ולספק רמות דיפרנציאליות של ויסות הביטוי בהתאם לחומרת לחץ החום. יתר על כן, הניתוח של אינטראקציות תוך-מולקולריות מכריעות המעורבות בהיווצרות מבנה משני גילה כי למרות שאלמנטים של ROSE מאופיינים בקטע קצר של נוקלאוטידים (U (U/C) GCU), נראה כי גם זוגות בסיס לא-קנוניים הם בעלי חשיבות מכרעת. עבור חישת טמפרטורה דיפרנציאלית עדינה. דוגמאות נוספות למדחומי RNA המכילים יסודות דמויי ROSE או ROSE נמצאו גם במיני חיידקים אחרים כגון קאולובקטר, סלמונלה ו אי קולי. במינים האחרונים, מדחום RNA דמוי ROSE שולט בביטוי התלוי בטמפרטורה של חלבון הלם החום הקטן IbpA (מקודד לחלבון קושר גוף הכללה), שהשעתוק שלו תלוי ב-σ 32 (Nocker ואח '. 2001 וולדמינגהאוס ואח '. 2009). מחלקה נוספת של מדי חום של RNA מבוססת על מתיחה קצרה של ארבעה אורידינים שמורים שמשתדכים עם רצף הנוקלאוטידים AGGA המהווים את רצף Shine-Dalgarno. אלמנט זה, שנקרא fourU, התאפיין בתחילה ב סלמונלה אנטריקה, שם הוא שולט בביטוי תלוי הטמפרטורה של agsA גן המקודד לחלבון הלם חום קטן (Waldminghaus ואח '. 2007). בניגוד לאלמנטים של ROSE, היווצרות המבנה המשני של RNA כפול-גדילים ברכיבי fourU נשלטת אך ורק על ידי זיווג בסיס קנוני (קורטמן ונרבהאוס 2012). יתר על כן, תכונה מוזרה של ארבעת האלמנטים, שנגזרה במהלך חקירה מבנית מפורטת של agsA מדחום, הוא שתהליך ההיתוך בתגובה לתנודת הטמפרטורה תלוי בריכוז יוני Mg 2+, עקב נוכחות של אתר קישור של Mg 2+ הממוקם ישירות על אלמנט ה-4U (Rinnenthal) ואח '. 2011). ראוי לציין כי ויסות חום המבוסס על מבנים של חישת RNA לא התפתח אך ורק ביחס לגנים של הלם חום. מספר חיידקים פתוגניים, הנתונים לשינויים בטמפרטורה במהלך מחזור חייהם (מטמפרטורת סביבה של 28°C-30°C לטמפרטורת גוף של 37°C או אפילו יותר במהלך זיהום), יכולים לווסת את הביטוי של כמה שקשור ארסיות גנים בתגובה לשינויי טמפרטורה באמצעות מדי חום של RNA (Grosso-Becera, Servín-González and Soberón-Chávez 2015). לדוגמה, בהתחייבות המחויבת של האף גרון האנושי Neisseria meningitidis, מדחומי RNA נמצאו באזור 5 אינץ 'של שלושה גנים המעורבים בהתנגדות המנינגוקוקית נגד הריגה חיסונית. במיוחד, cssR, fHbp ו ראשון גנים (הקידוד הראשון לאנזים המעורב בביוסינתזה האקסופוליסכרידית, השני המקודד לחלבון ה- H-binding גורם המווסת המשלים המארח והשלישי המקודד לחלבון הנחוץ ל Sialylation LPS) מחזיקים מדחומי RNA הסמוכים לרצף שיין-דלגרנו המשפרים הביטוי שלהם ב-42 מעלות צלזיוס, טמפרטורה שמגיעים אליה בלוע האף במהלך נייסריה וזיהומים נגיפיים משותפים (Loh ואח '. 2013 ברנוול ואח '. 2016).

מנגנוני חישת חום. (א) החישה באמצעות RNA כרוכה במבנים משניים רגישים לטמפרטורה באזור 5 אינץ 'של ה- mRNA הנתון לוויסות מסוג זה. בתנאי גידול רגילים, צורות מבנה משני ורכיבי רצף חיוניים ליזום יעיל של תרגום הם רעולי פנים ונגישים בצורה גרועה לקשירת ריבוזום. עם עליית הטמפרטורה, סידור מחדש או רזולוציה מבני של המבנה חושפים רכיבי רצף כאלה והתרגום משופר. סמלים: SD, רכיב רצף Shine-Dalgarno AUG, קודון התחלה של תרגום. (ב) חישת טמפרטורה באמצעות DNA: מודל של ויסות תלוי טמפרטורה של virF תמלול ב S. flexneri. אזור ה-DNA המוקף באתרי הקישור של H-NS מניח עקמומיות בטמפרטורה נמוכה המאפשרת מגע בין דימרים H-NS הקשורים לאתרי קישור נפרדים ויצירת קומפלקס נוקלאופרוטאין מדכא. בטמפרטורה גבוהה יותר, עקמומיות זו נחלשת והמקדם נגיש יותר ל-RNA פולימראז עבור virF שעתוק גנים. (ג) וויסות תעתיק כחיישני חום פנימיים. מדכאי חישת חום מהותיים מוכשרים לקשירת DNA בטמפרטורה מתירנית (אליפסה ירוקה), והתעתוק של גנים של הלם חום מדוכא. עם אתגר חום, מעבר מבני הנגרם על ידי טמפרטורה (המוצג על ידי מלבן ירוק) מוביל לירידה בפעילות מחייבת ה- DNA של הדכא והשיעתוק יורד. (ד) מנגנון חישת חום עקיף המתווך על ידי מלווים. פעילות קושרת ה-DNA של מווסת תעתיק מווסתת על ידי מלווים. בתנאי גידול רגילים, המלווה מתקשר עם וסת הלם החום ומפעיל את תפקידו הרגולטורי. כמה מדכאים מאופיינים באופן חיובי (כגון HrcA ו- HspR בכמה מינים של חיידקים) זוכים לפעילות מחייבת DNA על אינטראקציה של מלווה, בעוד שבמקרים אחרים האינטראקציה עם המלווה מביאה לרצף הפעיל (למשל, אי - קולי σ 32). בעקבות לחץ חום, המלווים מתפרקים על ידי חלבונים שקופלו בצורה לא נכונה המצטברים בציטופלזמה ומשחררים רגולטורים לתעתיק ותוצאות הפעילות שלהם מחייבות DNA מושפעות חיובית או שלילית.

מנגנונים של חישת חום. (א) החישה באמצעות RNA כרוכה במבנים משניים רגישים לטמפרטורה באזור 5 אינץ 'של ה- mRNA הנתון לוויסות מסוג זה. בתנאי גידול רגילים, צורות מבנה משני ורכיבי רצף חיוניים ליזום יעיל של תרגום הם רעולי פנים ונגישים בצורה גרועה לקשירת ריבוזום. עם עליית הטמפרטורה, סידור מחדש או רזולוציה מבני של המבנה חושפים רכיבי רצף כאלה והתרגום משופר. סמלים: SD, אלמנט רצף Shine-Dalgarno AUG, קודון התחלת תרגום. (ב) חישת טמפרטורה באמצעות DNA: מודל של ויסות תלוי טמפרטורה של virF תמלול ב S. flexneri. אזור ה- DNA שלצידו אתרי הקישור H-NS מניח עקמומיות בטמפרטורה נמוכה המאפשרת מגעים בין דימרים H-NS הקשורים לאתרי כריכה נפרדים וליצירת קומפלקס נוקלאופרוטאין מדכא. בטמפרטורה גבוהה יותר, עקמומיות זו נחלשת והאמרגן נגיש יותר ל- RNA פולימראז עבור virF שעתוק גנים. (ג) וויסות תעתיק כחיישני חום פנימיים. מדכאי חישת חום מהותיים מוכשרים לקשירת DNA בטמפרטורה מתירנית (אליפסה ירוקה), והתעתוק של גנים של הלם חום מדוכא. עם אתגר חום, מעבר מבני הנגרם על ידי טמפרטורה (המוצג על ידי מלבן ירוק) מוביל לירידה בפעילות מחייבת ה- DNA של הדכא והשיעתוק יורד. (ד) מנגנון חישת חום עקיף בתיווך מלווים. פעילות קושרת ה-DNA של מווסת תעתיק מווסתת על ידי מלווים. בתנאי גידול רגילים, המלווה מתקשר עם וסת הלם החום ומפעיל את תפקידו הרגולטורי. כמה מדכאים מאופיינים באופן חיובי (כגון HrcA ו- HspR בכמה מינים של חיידקים) זוכים לפעילות מחייבת DNA על אינטראקציה של מלווה, בעוד שבמקרים אחרים האינטראקציה עם המלווה מביאה לרצף הפעיל (למשל, אי - קולי σ 32). בעקבות סטרס חום, המלווה נספגים על ידי חלבונים שלא מקופלים בצורה שגויה המצטברים בציטופלזמה ומווסתים שעתוק משתחררים ותוצאות פעילות קושרת ה-DNA שלהם מושפעות לחיוב או לרעה.

חישת טמפרטורה באמצעות DNA

במקרים מסוימים, שינויים בטמפרטורה ניתן לחוש ישירות על ידי ה-DNA של תא החיידק. מספר מסלולים מטבוליים פיזיולוגיים של מיקרואורגניזם מושפעים מהתנאים החיצוניים שחווים בנישה האקולוגית שלו. בתורו, המצב המטבולי של התא מושפע, כולל יחס ADP ל- ATP. כתוצאה מכך, אנזימים הדורשים ATP כקו-פקטור, כגון DNA gyrase, יושפעו. This enzyme, whose activity is strictly linked to the topological state of the DNA, is dependent on ATP and inhibited by ADP (so change in the ATP:ADP ratio influences DNA gyrase activity). For this reason, external fluctuating conditions that affect metabolic processes, including osmotic and heat-shock, can ultimately influence the global level of DNA supercoiling (Hsieh, Burger and Drlica 1991 Dorman and Corcoran 2009). Considering that DNA supercoiling can influence gene transcription, DNA can be considered as a thermosensor of environmental temperature change acting through variations of the global topological state of the chromosome in response to external stimuli. One of the primary parameters of DNA topology that responds to temperature changes is plasmid supercoiling. In particular, it was demonstrated both in mesophilic and hyperthermophilic bacteria that sudden temperature variations lead to transient changes in plasmid DNA topology and this effect, in turn, has a significant impact on transcription efficiency (López-García and Forterre 1997). In some other cases, however, local DNA structures mediate temperature sensing and affect transcription of neighboring genes. Some DNA sequences identified in אי - קולי and in several other bacteria are characterized by a sequence specific topological conformation that is able to assume various conformations in response to temperature variation. When these DNA regions are proximal to promoters, the local conformational variation induced by heat-shock is transduced into a modulation of RNA polymerase binding efficiency, thereby affecting the transcription of the downstream genes (Nickerson and Achberger 1995). An example is represented by the region upstream of the plc gene, encoding the phospholipase C (PLC) in Clostridium perfrigens (Katayama ואח '. 1999). In this case, the three phased A-tracts that precede the PLC encoding gene confer a strongly bent conformation to this DNA sequence. על ידי שימוש ב בַּמַבחֵנָה transcription assays, it was demonstrated that the stimulatory effect on the promoter activity of the A-tract sequence was temperature dependent, probably due to changes in the bending angle upon temperature fluctuations. Besides the direct activation of transcription mediated by bent DNA through the facilitation of RNA polymerase binding, temperature-dependent local DNA curvatures can indirectly regulate the efficiency of transcription by affecting the interaction of proteins with a regulatory role on gene expression. In this respect, nucleoid-associated proteins such as IHF, Fis, HU and H-NS have been shown to be involved in this kind of process. One of the best studied examples concerns the temperature-dependent regulation of virF transcription in שיגלה פלקסנרי, a pathogenic bacterium able to invade human intestinal epithelium (Fig. 7B). The AraC-like VirF regulator, a protein that triggers the activation of several genes with invasive functions, must be expressed only after the shift from the outside environment to the host. It has been demonstrated that the transcription of the virF promoter is kept repressed at non-permissive temperatures (below 32°C) by the nucleoid-associated protein H-NS (Colonna ואח '. 1995). Moreover, it was shown that the virF promoter harbors two H-NS binding sites separated by an intrinsically bent region, whose existence was predicted בסיליקו and demonstrated by בַּמַבחֵנָה experimental results (Falconi ואח '. 1998 Prosseda ואח '. 2004). Intriguingly, upon temperature increase, this DNA region undergoes an abrupt structural transition (at ∼32°C) that affects H-NS accessibility to target DNA sites and represses the virF promoter (Prosseda et al. 2004). A similar interplay between temperature-dependent DNA bending and H-NS binding was demonstrated to modulate hemolysin gene expression in the model organism אי - קולי (Madrid ואח '. 2002) and to enhance the expression of a type III secretion system above 30°C in S. enterica (Duong ואח '. 2007).

To summarize, even though several examples of temperature-dependent regulation of gene expression point to the role of DNA as a sensor biomolecule, it appears that this mechanism of heat sensing is much more pertinent to regulating the expression of virulence genes rather than in the heat-shock response.

Sensing through proteins

Bacteria can also sense and respond to temperature fluctuations in their ecological niches by using proteins as heat sensors. Different classes of proteins, including kinases, heat-shock transcriptional repressors and chaperones, have been characterized as sensors of temperature changes (Klinkert and Narberhaus 2009). However, the two latter categories of proteins are primarily employed to transduce heat stress signals that trigger a transcriptional heat-shock response. Intrinsic heat-sensing transcriptional repressors are able to directly modulate the transcription of target genes in response to temperature fluctuation. Specifically, they are competent for promoter binding and repress gene transcription only at physiological temperature. Upon heat-shock, these thermosensing repressors undergo a conformational change that lowers relative binding affinity for their operators. As a consequence, target gene transcription becomes derepressed (Fig. 7C). With respect to the previous point, CtsR, the global repressor of heat-shock genes of Bacillus subtilis and other low-GC Gram-positive bacteria, is one of the best characterized examples (Elsholz ואח '. 2010). בַּמַבחֵנָה DNA-binding assays carried out at different temperatures showed that CtsR-binding activity to the clpC promoter drastically drops under heat-shock conditions (50°C), compared to normal growth temperature at 37°C. Interestingly, the temperature-dependent loss of DNA-binding activity of CtsR was demonstrated to be reversible. In fact, when CtsR was first incubated at a non-permissive temperature and then at 37°C, the regulator regained DNA-binding activity. In the case of CtsR, the temperature-dependent conformational change responsible for the loss of DNA-binding activity was shown to be limited to a short glycine-rich loop region within the DBD, constituting the precise functional site for heat sensing (Elsholz ואח '. 2010). ה Streptomyces albus heat-shock repressor RheA described above was shown to be capable of sensing temperature variations in the absence of other factors, behaving similarly to CtsR. Upon heat challenge, RheA loses DNA-binding activity and the transition from active to inactive form was related to a temperature-induced reversible conformational change (Servant, Grandvalet and Mazodier 2000). A similar paradigm of temperature-dependent DNA-binding capacity was also clearly demonstrated for the virulence-associated RovA regulator of Yersinia pestis and for the TlpA regulator of S. enterica serovar Typhimurium (Hurme ואח '. 1997 Herbst ואח '. 2009). In the latter example, in particular, temperature reversibly affects the DNA-binding competent coiled-coil domains of the oligomerized state of the protein, thereby affecting DNA-binding ability. Another widespread heat-shock repressor, HrcA, can act, in some cases, as an intrinsic protein thermometer. The observation that the thermal denaturation profiles of B. subtilis and of B. thermoglucosidasius HrcA-CIRCE complexes (assayed by light scattering) were highly consistent with the different growth temperatures of the two microorganisms led to the proposal that the HrcA repressor might have a role as a thermosensor (Hitomi ואח '. 2003). A direct role as thermosensor was recently demonstrated for the HrcA repressor of הליקובקטר פילורי. במיוחד, בַּמַבחֵנָה DNaseI footprinting assay results showed that HrcA-mediated DNA binding is strictly temperature dependent (Roncarati, Danielli and Scarlato 2014). מתי H. pylori HrcA was exposed to temperatures above 37°C (physiological growth temperature), it dramatically lowered binding affinity to CIRCE operators and became essentially inactive. Intriguingly, the loss of binding activity upon heat-shock treatment appeared to be irreversible בַּמַבחֵנָה, likely as a consequence of the major structural change as the temperature exceeded 40°C. However, the situation is different in vivo, where HrcA is able to recover its repressive function after the temperature challenge (Roncarati, Danielli and Scarlato 2014). Furthermore, it was demonstrated that the GroESL chaperonin plays a key role and that it is able to restore HrcA-binding activity lost upon heat challenge. The working model for HrcA-mediated heat sensing in H. pylori postulates that, after a sudden increase of temperature, heat-mediated inactivation of the regulator leads to promoter derepression and increased transcription of the heat-shock gene promoters. Then, following the induction step, at least a fraction of the denatured repressor is refolded by GroESL and can take part, together with the newly synthetized HrcA, in transcriptional regulation of the target genes. Considering the key role of GroESL in regulating HrcA-binding activity upon heat sensing, this functional interaction could be exploited by H. pylori to adjust the transcriptional response under various stress conditions. That is to say that, depending on the severity of a particular stress stimulus, the amount of GroE chaperonin available for the functional interaction with HrcA will change, influencing the restoration of target gene regulation. A different situation was observed for כלמידיה טרכומטיס HrcA-dependent heat-shock gene regulation. In this obligate intracellular human pathogen, HrcA binds to CIRCE operators within groESL ו dnaK promoters and represses their transcription under normal growth conditions. Heat-shock gene transcription is then induced upon a sudden temperature increase. However, it was shown that HrcA-binding activity to CIRCE was not affected by elevated temperature בַּמַבחֵנָה (Wilson and Tan 2004). Recently, Hanson and Tan ( 2015) developed a method based on ChIP to study heat-shock gene regulation during an intracellular infection, and they were able to monitor in vivo HrcA binding to target promoters at various temperatures. This approach allowed demonstration that, upon a sudden temperature increase, the in vivo induction of heat-shock gene transcription was due to a decrease of HrcA binding to groESL ו dnaK מקדמים. The discrepancy between the בַּמַבחֵנָה ו in vivo results for HrcA temperature sensitivity suggests that elevated temperature is not sufficient כְּשֶׁלְעַצמוֹ to modulate chlamydial HrcA-binding capacity and implies that additional in vivo factors must be involved in the regulation of the HrcA-mediated heat-shock response. Based on previous observations of a functional interaction between HrcA and GroE (Wilson ואח '. 2005), it has been proposed that the chaperonin is the actual heat sensor of the regulatory circuit. The latter example represents a well-characterized mechanism employed in several cases that link environmental stress signals to a corresponding transcriptional response. This signal-sensing system does not directly detect the temperature increase rather, the consequences of heat-shock on cellular proteins are sensed. Specifically, this strategy, represented in Fig. 7D, is based on the direct interaction between heat-shock transcriptional regulators and the major cellular chaperones. DNA-binding activity of transcriptional regulators is positively or negatively regulated by chaperones that are available for interaction during normal growth conditions. Upon sudden temperature upshift, chaperones are titrated away by denatured proteins that accumulate in the cytoplasm and transcriptional regulators are released. As described above (Figs 2 and Fig. 4A and B), the activity of HrcA and HspR repressors of several bacterial species, but also of the heat-shock σ 32 of אי - קולי, is regulated in this way by the principal cellular chaperones such as the GroE chaperonin and DnaK-DnaJ-GrpE system (Straus, Walter and Gross 1990 Babst, Hennecke and Fischer 1996 Mogk ואח '. 1997 Bucca ואח '. 2000 Reischl, Wiegert and Schumann 2002 Wilson ואח '. 2005). According to this indirect heat-sensing mechanism, chaperones, and not transcriptional regulators, are the actual ‘stress sensors’.

An interesting aspect emerging from the examples of the sensing mechanisms described above is that, in several cases, the regulation of the heat-shock response involves both direct temperature sensing (through RNA thermometers and intrinsic heat-sensing transcriptional regulators) and indirect chaperone-mediated sensing of unfolded proteins. These composed systems allow bacteria to respond differentially, depending on severity and type of environmental stresses. For example, RNA thermometers can detect minor temperature variations allowing the system to immediately respond, before cellular processes are altered. In this respect, אי - קולי σ 32 regulation represents a perfect example. Here temperature-regulated translation of RpoH mRNA combines with two feedback loops that control σ 32 activity and stability. An interesting implication of these combined systems of signal sensing is that cells might discriminate heat stress from any other type of stress. Consequently, bacteria might differentially induce the expression of specific set of genes, thus increasing specificity of stress response.


Protein aggregation disorders and HSP expression

Chaperone suppression of aggregation and altered subcellular proteasome localization imply protein misfolding in SCA1

Christopher J. Cummings 1,5 , Michael A. Mancini 3 , Barbara Antalffy 4 , Donald B. DeFranco 7 , Harry T. Orr 8 & Huda Y. Zoghbi 1,2,6
Nature Genetics 19, 148 – 154 (1998) http://dx.doi.org:/10.1038/502

Spinocerebellar ataxia type 1 (SCA1) is an autosomal dominant neurodegenerative disorder caused by expansion of a polyglutamine tract in ataxin-1. In affected neurons of SCA1 patients and transgenic mice, mutant ataxin-1 accumulates in a single, ubiquitin-positive nuclear inclusion. In this study, we show that these inclusions stain positively for the 20S proteasome and the molecular chaperone HDJ-2/HSDJ. Similarly, HeLa cells transfected with mutant ataxin-1 develop nuclear aggregates which colocalize with the 20S proteasome and endogenous HDJ-2/HSDJ. Overexpression of wild-type HDJ-2/HSDJ in HeLa cells decreases the frequency of ataxin-1 aggregation. These data suggest that protein misfolding is responsible for the nuclear aggregates seen in SCA1, and that overexpression of a DnaJ chaperone promotes the recognition of a misfolded polyglutamine repeat protein, allowing its refolding and/or ubiquitin-dependent degradation.

Effects of heat shock, heat shock protein 40 (HDJ-2), and proteasome inhibition on protein aggregation in cellular models of Huntington’s disease

Huntington’s disease (HD), spinocerebellar ataxias types 1 and 3 (SCA1, SCA3), and spinobulbar muscular atrophy (SBMA) are caused by CAGypolyglutamine expansion mutations. A feature of these diseases is ubiquitinated intraneuronal inclusions derived from the mutant proteins, which colocalize with heat shock proteins (HSPs) in SCA1 and SBMA and proteasomal components in SCA1, SCA3, and SBMA. Previous studies suggested that HSPs might protect against inclusion formation, because overexpression of HDJ-2yHSDJ (a human HSP40 homologue) reduced ataxin-1 (SCA1) and androgen receptor (SBMA) aggregate formation in HeLa cells. We investigated these phenomena by transiently transfecting part of huntingtin exon 1 in COS-7, PC12, and SH-SY5Y cells. Inclusion formation was not seen with constructs expressing 23 glutamines but was repeat length and time dependent for mutant constructs with 43–74 repeats. HSP70, HSP40, the 20S proteasome and ubiquitin colocalized with inclusions. Treatment with heat shock and lactacystin, a proteasome inhibitor, increased the proportion of mutant huntingtin exon 1-expressing cells with inclusions. Thus, inclusion formation may be enhanced in polyglutamine diseases, if the pathological process results in proteasome inhibition or a heat-shock response. Overexpression of HDJ-2yHSDJ did not modify inclusion formation in PC12 and SH-SY5Y cells but increased inclusion formation in COS-7 cells. To our knowledge, this is the first report of an HSP increasing aggregation of an abnormally folded protein in mammalian cells and expands the current understanding of the roles of HDJ-2yHSDJ in protein folding.


איור מיקומים

שולחן 1 Fitting performance of inactivation models fitted to inactivation data of ליסטריה אינוקואה. The first-order and Weibull model types were fitted to the data of Miller et al. (2009) (see also Figure 1) obtained from the Combase database (http://www.combase.cc)

Model typeמשוואהReference equationParameter (unit)Parameter value (95% CI)Shape parametersCorrelation coefficient shape parametersFirst order Stumbo 1973log10 נ(0) (log10 cfu/ml)
ד (min)6.4 (6.2, 6.6)

a Time to obtain 5 decimal reductions.

Abbreviations: CI, confidence interval. NA, not applicable.

שולחן 2 Fitting performance of inactivation models fitted to example inactivation data sets. The biphasic model is fitted to the data of Metselaar et al. (2016) (see also Figure 2א) the biphasic model plus shoulder is fitted to the data of den Besten et al. (2006) (see also Figure 2ב)

Model typeמשוואהReference equationParameter (unit)Parameter value (95% CI)Shape parametersCorrelation coefficient shape parametersBiphasic
Cerf 1977log10 נ(0) (log10 cfu/ml)
ו (−)
דחוש (min)
דמילואים (min)7.0 (6.6, 7.5)

den Besten et al. 2006
Geeraerd et al. 2005
log10 נ(0) (log10 cfu/ml)
ו (−)

Metselaar et al. 2013log10 נ(0) (log10 cfu/ml)
log10 ו (−)
טש (min)
קחוש (min −1 )
קמילואים (min −1 )6.9 (6.8, 7.0)

Abbreviation: CI, confidence interval.

שולחן 3 Mean log10ד-values at reference temperature טref, and variability expressed in the upper and lower 95% prediction interval for log10דref and standard deviation (σ), and z-values for three spore-forming bacteria (Bacillus subtilis, Geobacillus stearothermophilus, ו Bacillus cereus) and two non-spore-forming bacteria (חיידקי ליסטריה ו Lactobacillus plantarum)

a Heat-resistance parameters based on strains producing high-level heat-resistant spores.

b Heat-resistance parameters based on strains producing low-level heat-resistant spores.

c Heat-resistance parameters based on all B. subtilis זנים.

טבלה 4 Variability in heat resistance of spores of Bacillus subtilis, Geobacillus stearothermophilus, ו Bacillus cereus and variability in heat resistance of vegetative cells of חיידקי ליסטריה ו Lactobacillus plantarum. Variability was calculated based on linear regression following the approach of Van Asselt & Zwietering (2006) (Approach A) and variability was calculated following the approach of Aryani et al. (2015) (Approach B). Variability was obtained from the meta-analysis of the specified species

a Heat-resistance parameters based on strains producing high-level heat-resistant spores.

b Heat-resistance parameters based on strains producing low-level heat-resistant spores.

c Strains were heat-characterized at one temperature, and therefore approach A could not be used.

ד ק-Values were obtained from K. Koutsoumanis, Aristotle University of Thessaloniki, Greece (pers. commun.).

e Three sets of multistrain composites of סלמונלה strains were used in this study.

f Reference to the study that heat-characterized the species.

g Reference to the meta-analyses results presented in Figure 5 and Figure 6 (gray symbols ו gray 95% prediction interval lines).

Abbreviations: σ, standard deviation DF, degrees of freedom NA, not applicable.

Table 5 Log10ד-values (log10min) and reduction (log10cfu/ml) and corresponding 95% prediction intervals (PIs) according to different heat treatment regimes at the specified טref והזמןref.

a Heat-resistance parameters based on strains producing high-level heat-resistant spores.

b Heat-resistance parameters based on strains producing low-level heat-resistant spores.

ג ד-value and reduction calculated using generic values טref = 121.1°C, ד121.1 = 0.21 min, and z-value = 10°C (Bean et al. 2012, Stumbo 1973). ה ו0 in minutes for the five heating regimes are <0.01, <0.01, <0.01, 3.0, 4.0, respectively, with ,

Table 6 Percentiles of ד72-values and the corresponding reduction (ר is the log10 reduction achieved with 15 s at 72°C)

Table 7 Probability of cells with certain ד72 values and their log10 reduction (ר), the number of cells out of the initial 10 9 that have this ד-value, and the number of these that survive


דִיוּן

Both Skn7 and Hsf1 have previously been shown to play important roles in the cellular response to oxidative stress. In the case of the response regulator Skn7, it has been shown to cooperate with the yeast AP-1 homologue Yap1 at the TRX2 promoter and to specifically activate transcription of the thioredoxin and thioredoxin reductase genes in the presence of hydrogen peroxide (Morgan ואח '., 1997). Similarly, Hsf1-dependent activation of the CUP1metallothionein gene was observed in yeast cells treated with the superoxide generator menadione (Liu and Thiele, 1996). Here, we provide evidence that Skn7 is required for efficient heat shock gene activation in response to hydrogen peroxide. We also show that Skn7 and Hsf1 interact physically and genetically and have identified target genes known to be regulated by Hsf1 that are also regulated by Skn7 in response to free radical stress.

Physical and Genetic Interactions between Hsf1 and Skn7

A genetic interaction between Hsf1 and Skn7 is indicated by several observations. First, the restrictive temperature of anhsf1 ts skn7Δ strain is decreased relative to that of the parentalhsf1 ts strain. Second, the growth defect of the hsf1 ts strain is partially suppressed by high-copy expression of the SKN7 גֵן. That this suppression is partial indicates that Skn7 can fulfill some but not all of the functions of Hsf1 in the cell. This observation is not surprising given the pleiotropic nature of the hsf1-m3mutation (Smith and Yaffe, 1991). Third, by reducing the activity of Hsf1 in skn7Δ cells through construction of the double mutant strain hsf1 ts skn7Δ, the sensitivity of skn7Δ cells to hydrogen peroxide is greatly enhanced. This hypersensitivity could be suppressed by ectopic expression of either SKN7 אוֹSKN7 D427N . These observations indicate that Skn7 and Hsf1 have overlapping functions in the stress response, presumably in the activation of particular stress-responsive genes.

Consistent with these observations, we have obtained several lines of evidence suggesting that Skn7 and Hsf1 interact physically. First, in extracts prepared from strains coexpressing Skn7-HA and GST-Hsf1, HA-tagged Skn7 copurified with GST-Hsf1 on glutathione-Sepharose beads. Physical interaction between these proteins was also shown with the use of a complementary pull-down assay Hsf1 associated with 6His-tagged Skn7 on nickel–agarose beads. Previous work had suggested that Skn7 interacts with a number of proteins, including Yap1 (Morgan ואח '., 1997), Rho1 (Alberts ואח '., 1998), Sln1-Ypd1 (Liואח '., 1998), and Mbp1 (Bouquin ואח '., 1999). In no case has coimmunoprecipitation been demonstrated with any of these proteins. Only a small proportion of total cellular Skn7 may associate with any of these proteins at one time, rendering coimmunoprecipitation studies difficult. Nonetheless, the copurification of Skn7 with Hsf1 described here argues strongly for a physical interaction.

Skn7 Is Required to Activate Heat Shock Gene Expression Specifically in Response to Hydrogen Peroxide

An implication of the interaction between Hsf1 and Skn7 is a role for Skn7 in regulating heat shock gene expression. Preliminary studies with the use of an SSA1-LacZ fusion construct indicated that Skn7 was required for HSE-mediated LacZinduction in response to hydrogen peroxide but was not required for the heat shock induction of the reporter (Table 1). Northern analysis of heat shock gene expression in wild-type and skn7Δ cells confirmed that SKN7 was not required for induction of these genes in response to heat shock. For example, when cells are shifted from 25 to 39°C, the heat shock induction of HSP12 בskn7Δ cells was identical to that in the isogenic wild-type strain. In contrast, the 5-fold induction of this gene by hydrogen peroxide in the wild type was largely abolished in the isogenic skn7Δ מתח. ה skn7Δ mutation also significantly reduced the 20-fold induction of HSP26and the 9-fold induction of HSP104 by hydrogen peroxide without affecting their responses to heat shock activation (Figure 4). The residual induction of these genes in response to oxidative stress could be dependent on the other known activators of these genes, such as Hsf1 and the Msn2/Msn4 transcription factor. The latter can activate expression through upstream activation sequence elements unrelated to HSEs (Martı́nez-Pastor ואח '., 1996 Schmitt and McEntee, 1996).

The requirement for Skn7 in hydrogen peroxide induction ofHSP12 is intriguing given that induction of this gene by a variety of other stresses has been shown to be mediated through STRE sequences by Msn2/Msn4 (Martı́nez-Pastor ואח '., 1996) and, in response to osmotic shock, by the high osmolarity glycerol (HOG) MAPK pathway (Varela ואח '., 1995). We note, however, that hydrogen peroxide induction of this and other STRE-regulated genes does not appear to be affected significantly by mutations in Msn2 or Msn4 (Schüller ואח '., 1994). It appears likely, therefore, that regulation of HSP12 (and perhaps other STRE-regulated genes such as HSP26 וHSP104) in response to hydrogen peroxide–generated oxidative stress is mediated principally by Skn7 and Hsf1, whereas activation in response to other stress conditions is regulated through the STRE elements and downstream effectors of the HOG pathway. In this context, it is interesting that the HOG1 pathway is itself regulated by the SLN1 histidine kinase, which also seems to regulate the activity of the Skn7 response regulator (Li ואח '., 1998).

Structural Homology between Skn7 and Hsf1

With regard to the Skn7–Hsf1 interaction in the oxidative stress response, the structural similarities of the two proteins are of particular interest. We have shown through EMSA that Skn7 purified from yeast or אי - קולי can bind to a 26-base pair probe derived from the HSE2 regulatory region of the SSA1 מְקַדֵם. This binding is of a similar specificity to that of Hsf1, insofar as mutation of the GAAnnTTC sequence to AAAnnTTT ablates binding of both Hsf1 and Skn7. Previously, we identified a regulatory site within the TRX2 promoter through which Skn7 can act (Morgan ואח '., 1997). The site contains the sequence CCGAAA in which mutation of the CG nucleotides to AT was found to reduce the binding of Skn7 by 20-fold. The common motif between this regulatory sequence and HSEs is the GAA triplet, three inverted repeats of which in the sequence AGAAn constitute a consensus HSE. Although the exact consensus binding site for Skn7 has not been established, the triplet GAA evidently represents a potential core recognition sequence.

In terms of sequence specificity of Skn7 recognition of HSEs versus that of Hsf1, there is one notable divergence between their otherwise highly conserved DNA-binding domains. This occurs at the last residue of the α3 sequence recognition helix of Hsf1 (Harrison ואח '., 1994), where the invariant M58 and G60 residues are replaced by K58 and D60, respectively, in the Skn7 protein (with residues numbered according to Figure 1). These substitutions may have a significant effect on DNA-binding specificity or the stability of Skn7 relative to Hsf1 because G60 of Hsf1 has been proposed to contact the DNA (Damberger ואח '., 1994). All other residues proposed to contact the DNA, however, are conserved between Skn7 and Hsf1.

The other region of structural homology between these two proteins lies between residues 222 and 303 of the Skn7 protein. This stretch contains five heptad repeats, with hydrophobic residues at positions 1 and 4 and polar residues elsewhere in the repeat units, characteristic of regions that form coiled-coil structures (Lupas, 1996). Hsf1 contains six heptad repeats that have been shown to mediate trimerization of the protein through the formation of triple-stranded α-helical coiled coils (Sorger and Nelson, 1989 Peteranderl and Nelson, 1992 Rabindranואח '., 1993). These coiled coils are also known to mediate heterodimerization and homodimerization, e.g., of the yeast GCN4 member of the bZIP transcription factor family (Harbury ואח '., 1993). We have demonstrated that Skn7, in common with Hsf1, can interact with itself in vivo and that these proteins can interact with each other. We have also shown that the Skn7 response regulator is constitutively localized to the nucleus and can bind to HSEs with a similar specificity to that of Hsf1. We are currently exploring the possibility that it is through the formation of heterodimers and/or heterotrimers that Skn7 and Hsf1 can mediate the activation of heat shock genes, and possibly other sets of genes, in response to oxidative stress. The markedly increased sensitivity to oxidative stress of anhsf1 ts skn7Δ strain relative to either single mutant (Figure 6) supports such a cooperative association.

In summary, we have shown that Skn7 interacts with Hsf1 and can bind to the same consensus sequence as Hsf1. We have further shown thatSKN7 is required for the induction of heat shock genes in response to ט-butyl hydrogen peroxide, although it is not required for their heat shock induction. In addition, we have demonstrated for the first time the nuclear localization of a response regulator in yeast, which was found to be independent of the presence or absence of oxidative stress. In the light of these data, we propose a model whereby Skn7 becomes activated in response to hydrogen peroxide stress and either by dimerization or through the formation of a heterotrimeric Skn7–Hsf1 complex binds to the promoters of stress-responsive genes. The actual mechanism by which either Skn7 or Hsf1 activates gene expression in response to stress remains unclear, although recent evidence suggests that Hsf1 can interact with TATA-binding protein (Mason and Lis, 1997) and with a phosphatase that may modulate the transcriptional activity of a subset of promoters, including CUP1, through interaction with the repressor region of Hsf1 (Lin and Lis, 1999). Hsf1 can also antagonize nucleasomal repression (Erkine ואח '., 1996). It is possible, therefore, that the transcription activation function of Hsf1 is enhanced by its interaction with Skn7 or that Skn7 itself potentiates the interactions with components of the basal transcription apparatus at heat shock core promoters in response to oxidative stress.