מֵידָע

7.11: Purine de novo Biosynthesis - ביולוגיה

7.11: Purine de novo Biosynthesis - ביולוגיה


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.


PRPP amidotransferase מוסדר בחלקו על ידי GMP ובחלקו על ידי AMP. הנוכחות של אחד מאלה יכולה להפחית את פעילות האנזים. רק כאשר שניהם קיימים, האנזים מושבת לחלוטין. תגובות עוקבות כוללות הוספת גליצין, הוספת פחמן (מ-N 10-formyltetrahydrofolate), הוספת אמין (מגלוטמין), סגירת הטבעת הראשונה, הוספת קרבוקסיל (מ( ext{CO}_2)), הוספת אספרטאט, אובדן פומראט (רווח נקי של אמין), הוספת פחמן נוסף (מ( ext{N}_10)-formyltetrahydrofolate), וסגירת הטבעת השנייה ליצירת אינוזין מונופוספט (IMP).


IMP היא נקודת הסתעפות לסינתזה של נוקלאוטידים אדנין וגואנין. המסלול המוביל מ-IMP ל-AMP כולל הוספת אמין מאספראט ודורש אנרגיה מ-GTP. המסלול מ-IMP ל-GMP כולל חמצון והוספה של אמין מגלוטמין. זה גם דורש אנרגיה מ-ATP. המסלול המוביל ל-GMP מעוכב על ידי המוצר הסופי שלו והמסלול ל-AMP מעוכב על ידי המוצר הסופי שלו.


לפיכך, איזון של נוקלאוטידים פורין מושג מנקודת הסניף של IMP קדימה. בנקודה זו מתבררת המשמעות של הרגולציה החריגה של PRPP amidotransferase. אם יש חוסר איזון של AMP או GMP, האנזים מואט, אך לא עוצר, ובכך מאפשר לתגובות המובילות ל-IMP להתקדם, אם כי באיטיות. ב-IMP, הנוקלאוטיד בעודף משוב מעכב את הסינתזה שלו, ובכך מאפשר ליצור נוקלאוטיד פורין בן הזוג ולהשיג איזון. כאשר שני הנוקלאוטידים נמצאים בשפע, אז PRPP amidotransferase מעוכב לחלוטין וייצור הפורינים מופסק, ובכך מונע מהם להצטבר יתר על המידה.


הפעלת AMPK באמצעות מודולציה של ביו-סינתזה של דה נובו פורין עם מעכב של ATIC Homodimerization

5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide (הידוע בשם ZMP) הוא מטבוליט המיוצר בביוסינתזה של פורין דה נובו ובביוסינתזה של היסטידין, אך מנוצל רק בתא על ידי אנזים דו-פונקציונלי הומודימרי (המכונה ATIC) המזרז את שני השלבים האחרונים של דה נובו ביו-סינתזה של פורין. ידוע כי ZMP פועל כמפעיל אלוסטרי של חיישן האנרגיה הסלולרית חלבון קינאז המופעל על ידי אדנוזין מונופוספט (AMPK), כאשר הוא מנוהל באופן אקסוגני כריבונוקלאוזיד החדיר לתאים המקביל. כאן, אנו מדגימים כי ZMP אנדוגני, המיוצר על ידי המסלולים המטבוליים שהוזכרו לעיל, מסוגל גם להפעיל AMPK. באמצעות מעכב הומודימריזציה של ATIC כדי לחסום את השלב התשיעי של ביו-סינתזה של פורין דה נובו, אנו מדגימים שהעלייה שלאחר מכן ב-ZMP אנדוגני מפעילה את AMPK ואת מסלולי האיתות שלו במורד הזרם. אנו ממשיכים להמחיש את הכדאיות של שימוש בגישה זו להפעלת AMPK כאסטרטגיה טיפולית עם מודל עכבר in vivo להפרעות מטבוליות.

זכויות יוצרים © 2015 המחברים. פורסם על ידי Elsevier Ltd.. כל הזכויות שמורות.


7.11: Purine de novo Biosynthesis - ביולוגיה

כל המאמרים המתפרסמים על ידי MDPI זמינים באופן מיידי ברחבי העולם תחת רישיון גישה פתוחה. אין צורך באישור מיוחד לשימוש חוזר במלואו או בחלקו של המאמר שפורסם על ידי MDPI, לרבות איורים וטבלאות. עבור מאמרים שפורסמו תחת רישיון Creative Common CC BY בגישה פתוחה, ניתן לעשות שימוש חוזר בכל חלק מהמאמר ללא רשות בתנאי שהמאמר המקורי מצוטט בבירור.

מאמרים מייצגים את המחקר המתקדם ביותר עם פוטנציאל משמעותי להשפעה גבוהה בתחום. מאמרים נושאיים מוגשים על פי הזמנה או המלצה פרטנית של העורכים המדעיים ועוברים ביקורת עמיתים לפני הפרסום.

מאמר הפיצ'ר יכול להיות מאמר מחקר מקורי, מחקר מחקר חדשני מהותי הכרוך לעתים קרובות במספר טכניקות או גישות, או מאמר סקירה מקיף עם עדכונים תמציתיים ומדויקים על ההתקדמות האחרונה בתחום הסוקרת באופן שיטתי את ההתקדמות המרגשת ביותר בתחום המדעי. סִפְרוּת. נייר מסוג זה מספק השקפה על כיווני מחקר עתידיים או יישומים אפשריים.

מאמרים של Editor's Choice מבוססים על המלצות של העורכים המדעיים של כתבי עת MDPI מרחבי העולם. העורכים בוחרים מספר קטן של מאמרים שפורסמו לאחרונה בכתב העת שלדעתם יהיו מעניינים במיוחד עבור מחברים, או חשובים בתחום זה. המטרה היא לספק תמונת מצב של כמה מהעבודות המרגשות ביותר שפורסמו בתחומי המחקר השונים של כתב העת.


סינתזת ריבוז-5-פוספט ל-IMP

שלב 1: אמינציה

חומר המוצא לביוסינתזה של פורין הוא Ribose-5-P, תוצר של ה-Hexose MonoPhosphate Shunt או Pentose Phosphate pathway (HMP Shunt). הריבוז-5-P הופך לפירופופוספט פוספוריבוסיל על ידי Pyrophospho Kinase בתגובה זו נצרך ATP.

שלב 2: הוספת N9

חנקן אחד מתווסף על Ribose-5-P, ליצירת 5-phosphoribosyl-1-amine (PRA). החנקן נתרם על ידי גלוטמין. Ribose-5-Phosphate מופק מ-PRPP.

התגובה זקוקה לאנרגיה מהידרוליזה של ATP. זה גבול דירוג אנזים של מסלול זה. שלב זה מעוכב על ידי אזזרין, התרופה נגד סרטן.

שלב 3: שילוב של C4, C5 ו-N7

הפוספוריבוסילאמין (PRA) מעובה עם גליצין ויוצר גליצינאמיד ריבוטיד (GAR). תגובה זו מזורזת על ידי GAR סינתזה.

שלב 4: תוספת של C8

Glycinamide ribotide הופך ל- Formyl glycine amide ribotide (FGAR). תגובה זו מזורזת על ידי טרנספילאז. כאן תורם הפורמיל הוא N 10 -Formyl-THF.

שלב 5: הוספת N3

Formyl Glycine ribotide הופך ל- Formylglycinaidine ribotide (FGAM) בנוכחות האנזים FGAM synthetase. כאן תורם האמיד הוא גלוטמין וזו התגובה הנצרכת ATP. אנזים זה מעוכב גם על ידי אזזרין.

שלב 6: מחזוריות (סגירת הטבעת)

FGAM הופך ל-5-amino imidazole ribotide (AIR). תגובה זו מזורזת על ידי AIR Synthetase. כאן ATP זולל.

שלב 7: הוספת C6

Amino imidazole ribotide הופך ל-5-amino-4-Carboxy-Amino-Imidazole Ribonucleotide (CAIR). תגובה זו מזורזת על ידי AIR carboxylase. בתגובה זו, חומצה פחמית מוחלפת על אטום פחמן 4 כמו בצורת קבוצת הקרבוקסיל (CAIR).

תגובת קיבוע פחמן דו חמצני זו אינה דורשת ביוטין או ATP.

שלב 8: הוספת N1

Carboxy Amino Imidazole הפך ל-5-AminoImidazole (N-Succinylocarboxamide) ריבוטיד (SACAIR). תגובה זו מזורזת על ידי סינתזה של SACAIR. בתגובה זו נצרכת חומצה אספרטית אחת המקושרת לקבוצת Carboxyl ATP.

שלב 9: הסרת חומצה פומארית

SACAIR מומר ל-5-AminoImidazole-4-CarboxyAmide Ribotide (AICAR). תגובה זו מזורזת על ידי Adenosuccinate Lyase. החומצה האספרטית המקושרת עברה הידרוליזה כפומאראט, הנכנסת ישירות למחזור TCA.

קבוצת האמינו של חומצה אספרטית הופכת לחנקן הראשון של טבעת הפורין.

שלב 10: הוספת C2

AICAR מומר ל-5-FormaminoImidazole-4-Carboxamide Ribotide (FAICAR). תגובה זו מזורזת על ידי Transformylase. כאן תורם קבוצת הפורמיל הוא N 10 -Formyl THF. פחמן זה מופק ממאגר הפחמן האחד. במחסור בחומצה פולית, שלב זה נחסם ולכן FAICAR בצבע כתום מופרש בשתן.

שלב 11: מחזוריות

FAICAR מומר לאינוזין מונו פוספט (IMP) בתהליך הקטליזציה. תגובה זו מזורזת על ידי IMP Cyclohydrolase. הוא מכיל את הפורין, היפוקסנטין.

אטום תורםנוספו תכונותמיוחדמוצר
גלוטמיןN9גבול דירוגPRA
גליציןC4, C5 ו-N7נדרש ATPGAR
מתניל-THFAC8FGAR
גלוטמיןN3נדרש ATPFGAM
סגירת טבעתצורך ב-ATPאוויר
פחמן דו חמצניC6ACAIR
חומצה אספרטיתN1 נדרש ATPSAICAR
פומראט הוסרAICAR
פורמיל THFAC2FAICAR
סגירת טבעתשֵׁד


ביוסינתזה של נוקלאוטידים פורין, נוקלאוטידים פירמידין ודאוקסיריבונוקלאוטידים

דה נובו (בכל פעם מחדש) סינתזה של נוקלאוטידים פורין היא סינתזה של פורינים מחדש. טבעת הפורין מסונתזת יחד עם הנוקלאוטיד, כלומר מחוברת לסוכר הריבוז המסופק ממסלול HMP. מסלול זה מספק סוכר ריבוז ליצירת הנוקלאוטיד. צורה פעילה של D-ribose-5-phosphate משמשת כחומר המוצא עליו נבנית טבעת פורין צעד אחר צעד.

מבשרי טבעת הפורין הם:

אני. N-1 תורם על ידי חנקן של אספרטאט.

ii. N-3 ו-N-9 נובעים מחנקן אמיד של גלוטמין.

iii. C-2 ו-C-8 מקורם בפורמט.

iv. C-6 מוטבע מפחמן דו חמצני בדרכי הנשימה.

v. C-4, C-5 ו-N-7 נלקחים מגליצין.

ויסות ביוסינתזה של נוקלאוטיד פורין:

ביוסינתזה של פורין מווסתת על ידי עיכוב משוב. עיכוב זה נמצא בשלב הראשון. זהו הצעד המחויב שהוא בדרך כלל בלתי הפיך. ברגע שהשלב המחויב עובר, יש ליצור את המוצר.

המנגנונים השונים שבהם הוא מוסדר הם:

נתיב הצלה:

סינתזה דה-נובו אינה מתרחשת בכל התאים. תאי מוח ולויקוציטים חסרים מנגנון זה. בתאים אלה מתרחשת סינתזה של פורין על ידי מסלול הצלה. מסלול ההצלה כולל סינתזה של נוקלאוטידים פורין מבסיסי פורין חופשיים, אשר ניצלים ממקורות תזונתיים ופירוק רקמות. מסלול זה מקודם על ידי פעולתם של שני אנזימים הממירים פורינים חופשיים לנוקלאוטידים פורין לשימוש חוזר.

האנזימים הם:

(1) אדנין פוספוריבוסיל טרנספראז ו

(2) Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT).

זוהי הפרעה גנטית הנגרמת עקב מחסור באנזים ‘Hypoxanthine Guanine Phospho Ribosyl Transferase (HGPRT)’. כאשר אנזים זה חסר, גואנין, קסנטין והיפוקסנטין אינם ניצלים ולכן מתכלים לחומצת שתן. זה נראה במיוחד אצל ילדים זכרים. בילדות הגן הוא רצסיבי והוא נשא. זהו גן דומיננטי גברי. זכרים כאלה מראים (1) פיגור שכלי ו-(2) נטייה להרס עצמי.

ביוסינתזה של נוקלאוטידים פירמידין:

ביוסינתזה של נוקלאוטידים של פירמידין מתרחשת באופן שונה מזה של נוקלאוטידים פורין. טבעת הפירימידין בעלת שישה איברים נוצרת תחילה ולאחר מכן מחוברת לפוספט ריבוז. הסינתזה מתחילה עם שילוב של פחמן דו חמצני ואמוניה ליצירת קרבמויל פוספט המזרז על ידי האנזים הציטוסוליים קרבמויל פוספט סינתטאז-II.

פוספט קרבמויל מתחבר עם אספרטאט ויוצר אספרטאט קרבמויל בסיוע האנזים אספרטאט טרנסקרבמוילאז. Dihydroorotate נוצר מקרבמויל אספרטאט על ידי הסרת מים וסגירת הטבעת בהשפעת האנזים דיהידרואורוטאז.

דיהידרואורוטאז מחומצן לחומצה אורוטית על ידי דהידרוגנאז המשתמש ב-NAD + כמקבל האלקטרונים. חומצה אורוטית מחוברת לריבוז כדי להניב חומצה אורוטידילית. לאחר מכן מבצעים decaroxylation של Orotidylate ליצירת אורידילאט. לאחר מכן מומר אורידילאט לכל הנוקלאוטידים האחרים של פירמידין, כלומר CMP, UMP ו-TMP. שלבי התגובה המעורבים בביוסינתזה של נוקלאוטידים פירמידין ניתנים תחת.

ויסות ביוסינתזה של פירמידין:

ויסות הביוסינתזה של פירמידין היא על ידי עיכוב היזון חוזר בשלב המחויב, כלומר התגובה המזרזת על ידי האנזים aspartate transcarbamoylase. זה מעוכב לרעה על ידי המוצר הסופי, כלומר CTP. האתר השני הוא ב-carbamoyl phosphate synthase- II שהוא משוב מעוכב על ידי UMP.

חומצה אורוטית:

זוהי הפרעה מטבולית של ביוסינתזה של פירמידין המאופיינת בהצטברות של חומצה אורוטית בדם והפרשה מוגברת שלה בשתן. זה נגרם עקב מחסור באנזים פוספורילאז של חומצה אורוטידילית וחומצה אורוטידילית דקרבוקסילאז או פוספוריבוסיל טרנספראז אורוטי. זה מוביל לאי-המרה של חומצה אורוטית ל-UMP. זה עשוי אפילו להשפיע על הסינתזה של נוקלאוטידים אחרים. זה נמצא בדרך כלל בילדים שמפגינים התפתחות וצמיחה נפשית מאחר שאין סינתזה נכונה של DNA. הם מראים אנמיה מגלובלסטית. ניתן להתגבר על כך על ידי הזרקת CTP ו-UTP.

ביוסינתזה של Deoxyribonucleotides:

Deoxyribonucleotides מתקבלים ribonucleotides. Thioredoxin הוא חלבון שלוקח חלק בהמרה של ריבונוקלאוטידים לדאוקסיריבונוקלאוטידים.


ניתוח כמותי של נוקלאוטידים פורין מצביע על כך שפורינוזומים מגבירים את הביוסינתזה של פורין דה נובו

אנזימים במסלול הביוסינתזה של פורין דה נובו מגויסים ליצירת קומפלקס מטבולי דינמי המכונה פורינוזום. מחקרים קודמים הוכיחו שהרכבת פורינוזומים מגיבה לרמות פורין במצע התרבות. טיפול במדיום מדולדל פורין או 2-dimethylamino-4,5,6,7-tetrabromo-1H-benzimidazole (DMAT) מגרה את הרכבת הפורינוזומים בתאי HeLa. כאן, כמה טכנולוגיות מטבולומיות יושמו כדי לכמת את הרמות הסלולריות הסטטיות של נוקלאוטידים פורין ולמדוד את קצב הביוסינתזה דה נובו של IMP, AMP ו-GMP. השוואה ישירה של תאים עשירים בפורינוזומים (מתורבתים במדיום מדולדל בפורין) ותאים נורמליים הראתה עלייה פי 3 בריכוז IMP בתאים עשירים בפורינוזומים ורמות דומות של AMP, GMP ויחסים של AMP/GMP ו-ATP/ADP לשניהם. בנוסף, נצפתה רמה גבוהה יותר של IMP גם בתאי HeLa שטופלו ב-DMAT. יתר על כן, נצפו עליות בקצב השטף הביוסינתטי של IMP/AMP/GMP דה נובו במצב של דלדול פורין. האנזימים הסינתטיים, אדנילוסוצ'ינט סינתאז (ADSS) ואינוזין מונופוספט דהידרוגנאז (IMPDH), במורד ה-IMP הוכחו גם הם כחלק מהפורינוזום. ביחד, תוצאות אלו מספקות ראיות נוספות לכך שהרכבת הפורינוזומים קשורה ישירות לביו-סינתזה דה נובו פורין מופעלת, בהתאם לפונקציונליות של הפורינוזום.

מילות מפתח: ספקטרומטריית מסה (MS) Metabolic Flux Metabolomics Nucleoside/Nucleotide Biosynthesis Protein Complex Purine Purinosome.

© 2015 מאת The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, Inc.


7.11: Purine de novo Biosynthesis - ביולוגיה

מילים נרדפות: ביו-סינתזה של פורין 2

נוקלאוטידים של פורין משתתפים בהיבטים רבים של מטבוליזם תאי כולל מבנה ה-DNA וה-RNA, המשמשים כקו-פקטורים של אנזים, מתפקדים באותות תאי, פועלים כתורמים של קבוצות פוספט, ומייצרים אנרגיה תאית [Carter08]. שמירה על האיזון התקין של בריכות תוך-תאיות של נוקלאוטידים פורין היא קריטית לתפקוד תקין [Zhang08c]. זה מתרחש באמצעות שילוב של דה נובו ביו-סינתזה של פורין ומסלול-על של הצלת נוקלאוטיד פורין [Zhao13]. ה דה נובו ביו-סינתזה של פורין צורכת יותר אנרגיה מאשר מסלול ההצלה של פורין.

ה דה נובו המסלול הביוסינתטי לנוקלאוטידים פורין שמור מאוד בקרב אורגניזמים, אך הוויסות והארגון שלו של הגנים המקודדים לאנזימים משתנים. המסלול יוצר IMP מ-PRPP וגלוטמין באמצעות מספר מולקולות של ATP בעשר תגובות אנזימטיות [Ng10]. התגובות של מסלול זה מזורזות על ידי עשרה אנזימים נפרדים ברוב הפרוקריוטים [Senecoff96]. עם זאת, בבני אדם, עשרת השלבים השמורים ביותר המובילים לסינתזת IMP מזורזים על ידי שישה אנזימים בלבד, כולל אנזימים תלת-פונקציונליים ושני אנזימים דו-פונקציונליים.

מסלול זה מציג את השלבים הנוספים במורד ה-IMP המובילים ליצירת GTP, dGTP, ATP ו-dATP.

מחקרים במיקרוסקופ פלואורסצנטי על תאים סרטניים הראו שששת החלבונים של המסלול המוביל להיווצרות IMP, מתאספים בקומפלקס מולטי-אנזים פונקציונלי המכונה "פורינוזום", בתוך הציטופלזמה [An08]. קומפלקס זה הפיך דינמית [Deng12]. חקירה נוספת של הפורינוזום שפכה אור על חלק מהחלבונים הנלווים שעשויים לסייע בהרכבת הפורינוזום ומכאן דה נובו ביו-סינתזה של פורין, הכוללת קינאזות חלבון וחלבוני הלם חום Hsp70 ו-Hsp90 [An10][French13].

צבירי הפורינוזומים הציטוסוליים מתחברים לחוטי מיקרוטובוליים שאינם מחוברים לרשת האקטין. Nocodazole, מעכב היווצרות מיקרוטובוליות, שיבש את היווצרות הפורינוזומים והפחתת השטף דרך דה נובו מסלול ביוסינתטי פורין [An10a].

תאים המתחלקים במהירות מעדיפים את דה נובו מסלול ביו-סינתטי פורין, והוא נחשב מזמן למטרה אידיאלית עבור כימותרפיה אנטי-סרטנית, אנטי-ויראלית ואנטי-מיקרוביאלית. פולאטים הם קו-פקטורים נדרשים עבור רבים מהאנזימים של ביו-סינתזה של פורין, ואנטי-פולאטים זכו גם לשימוש נרחב כסוכנים כימותרפיים כדי לשבש את המסלול [Zhao13].


שיבוט של שלושה גנים ביו-סינתטיים דה נובו פורין רב-תכליתיים אנושיים על ידי השלמה פונקציונלית של מוטציות שמרים.

השלמה פונקציונלית של מוטציות בשמרים Saccharomyces cerevisiae שימשה לשבט שלושה גנים אנושיים רב-תכליתיים המעורבים בביוסינתזה של פורין דה נובו. ספריית HepG2 cDNA שנבנתה בוקטור ביטוי שמרים שימשה להמרת זני שמרים עם מוטציות בגנים ביו-סינתטיים של אדנין. בודדו שיבוטים המשלימים מוטציות בגנים ADE2, ADE3 ו-ADE8 של השמרים. ה-cDNA שהשלים את המוטציה של ade8 (phosphoribosylglycinamide formyltransferase, GART), השלים גם את המוטציות ade5 (phosphoribosylglycinamide synthetase) ו-ade7 [phosphoribosylaminoimidazole synthetase (AIRS הידוע גם בשם PAIS)] המצביע על כך שזה הגן התלת-פונקציונלי האנושי. הנתונים התומכים כוללים הומולוגיה בין תחומי ה-AIRS וה-GART של גן זה והרצף שפורסם של תחומים אלו מאורגניזמים אחרים, ולוקליזציה של הגן המשובט לכרומוזום 21 אנושי, שבו הוכח שהגן GART ממפה. ה-cDNA שהשלים את ade2 (phosphoribosylaminoimidazole carboxylase) השלים גם את ade1 (phosphoribosylaminoimidazole succinocarboxamide synthetase), התומך בנתונים מוקדמים יותר המצביעים על כך שבחלק מהאורגניזמים פונקציות אלו הן חלק מחלבון דו-פונקציונלי. ה-cDNA שהשלים את ade3 (formyltetrahydrofolate synthetase) שונה מה-cDNA האנושי שבודד לאחרונה המקודד לאנזים זה ובמקום זאת נראה שהוא מקודד לאנזים מיטוכונדריאלי קשור.


חומרים ושיטות

כימיקלים

גליצין מסומן איזוטופי (U-13 C2, 15 N) נרכש ממעבדות קיימברידג' איזוטופ (אנדובר, MA, ארה"ב). AICAR, 5-aminoimidazole-4-carboxamide riboside (AICar) וחומצה אדנילוסוצצינית (SAMP) נרכשו מ- Toronto Research Chemicals Inc. (צפון יורק, קנדה). הוכנו SAICAR, succinylaminoimidazolecarboxamide riboside (SAICar), succinyladenosine (SAdo), AIR, 5-aminoimidazole riboside (AIr), CAIR, carboxyaminoimidazole riboside (CAIr) ו-N 10-formyl-tetrahydrofolate (N 10 -formyl) מתואר [11, 14]. פוספטאז אלקליין במעי עגל (CIP) ומאגר NEB3 נרכשו מ-New England Biolabs (NEB, Ipswich, MA, ארה"ב), והמדיום החיוני המינימלי של Dulbecco (DMEM), תערובת תזונתי F12 וסרום בקר עוברי (FBS) התקבלו מ-Life טכנולוגיות, ThermoFisher Scientific (MA, ארה"ב). Minimum Essential Medium (MEM) הושג מ-BioSera (Nuaille, צרפת). כל שאר הכימיקלים נרכשו מסיגמא-אלדריץ' (סנט לואיס, ארה"ב).

הכנה וטיהור מצעים

תוצרי ביניים GAR, FGAR ו-FGAMR סונתזו ביוכימית באמצעות אנזימים רקומביננטיים חיידקיים. FAICAR הוכן על ידי סינתזה אנאורגנית. לא ניסינו לסנתז PRA, מכיוון שהוא ידוע כלא יציב in vivo [15, 16].

הריכוז הראשוני של כל התרכובות נע בין 57 מיקרומטר בדגימות של FGAMR/r ל-124 מיקרומטר בדגימות של GAR/r (ראה טבלה S1).

האנזימים הרקומביננטיים החיידקיים phosphoribosylglycinamide synthetase (GARS) ו-phosphoribosylglycinamide formyltransferase (GARTF) באו לידי ביטוי וטיהרו כחלבון מאוחד מלטוזה קושר חלבון MBP-GARS ו-MBP-GARTF באמצעות pMAL TM Protein Fusion and Purification System (New England Biolabs Inc., New England Biolabs) , כפי שתואר קודם [17].

כדי לייצר סינתטאז phosphoribosylformylglycinamide חיידקי רקומביננטי שהתמזג עם תג פוליהיסטידין מסוף C (6H-PurL), הגן הוכנס לוקטור p6H, המתבטא ב אי קולי, וטיהרו על עמודת כרומטוגרפיה כרומטוגרפית זיקה מתכת משותקת Co 2+ (GE Healthcare) לפי הנוהל הסטנדרטי.

הכנת GAR/r.

תערובת התגובה המכילה 5.7 מ"מ ריבוז-5-פוספט, 0.7 מ"מ ATP, 10 מ"מ גליצין, 10 מ"מ אמוניום הידרוקסיד, 12.7 מ"מ מגנזיום כלוריד, 20 מ"מ חיץ פוספט pH 7.4 ו-0.4 מיקרוגרם/מיקרוליטר ב-MBP-3 3 מטוהרים ב-MBP-3. מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. התגובה נותחה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (HPLC-MS). צורת הריבוזיד הוכנה על ידי דה-פוספורילציה עם 1 U של CIP מ-NEB ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות.

הכנת FGAR/r.

תערובת התגובה המכילה 5.7 mM ribose-5-phosphate, 0.7 mM ATP, 10 mM גליצין, 10 mM אמוניום הידרוקסיד, 12.7 mM מגנזיום כלוריד, 0.1 mM N 10 -formyl-THF, 20 mM phosphate ph0. MBP-GARS, ו-0.4 מיקרוגרם/μL MBP-GARTF הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. ההליך שלאחר מכן היה זהה להכנת GAR/r.

הכנת FGAMR/r.

סך של 200 μL מתערובת התגובה מהסינתזה של FGAR הודגרה עם 2 מ"מ גלוטמין, 2 מ"מ ATP ו-0.25 מיקרוגרם/מיקרוליטר של 6H-PurL מטוהר ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות. ההליך שלאחר מכן היה זהה להכנת GAR/r.

הכנת FAICAR/r.

FAICar הוכן על פי Lukens et al. [18]. FAICAR הוכן על ידי התאמת ההליך המשמש לסינתזה של FAICar. בקצרה, הדגמנו 10 מ"ג של AICAR עם 11 מ"ג של NaOH, 136 μL של חומצה פורמית ו-250 μL של אנהידריד אצטית למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס. תוצר התגובה נותח על ידי HPLC-MS.

גידול תאים וקציר

השתמשנו בתאי HeLa ערוכים בגנום CRISPR-Cas9 CR-GART, CR-PFAS, CR-PAICS, CR-ADSL ו-CR-ATIC שהוכנו על ידי Baresova וחב'. בשנת 2016 [11]. תאי CR-HGPRT (חסרי hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) הוכנו באופן אנלוגי [19]. תאי HeLa תורבו באווירה לחה והודגרו עם 5% CO2 ב-37 מעלות צלזיוס. כל התאים (נוקאאוט ובקרה) נשמרו במדיום תערובת תזונתי DMEM/F12 בתוספת 10% FBS (Gibco, Invitrogen) ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. המדיום של תאי הנוקאאוט הועשר ב-3x10 -5 M של אדנין. 24 שעות לפני הניסוי, כל סוגי התאים טופחו ב-DMEM מדולדל בפורין בתוספת דיאליזה של 10% FBS [11] ו-1% פניצילין/סטרפטומיצין. שעתיים לפני קצירת התאים, התאים נשטפו עם PBS והונחו לתוך 5 מ"ל של MEM ללא גליצין עם 500 מיקרומטר של גליצין מסומן איזוטופי (U-13 C2, 15 נ) נוסף. כל שורת תאים חסרת תורבת ב-hexaplicate בצלוחיות של 75 ס"מ 2 (כ-5 מיליון תאים).

תאים נקצרו באמצעות שיטת ההמרה המתוקנת שתוארה על ידי Wojtowicz et al. [20]. בתחילה, המדיום הועבר לצינור פלסטיק של 15 מ"ל להכנה אנליטית לאחר מכן. חילוף החומרים התאי נכבה על ידי ריסוס של 40 מ"ל של 60% מתנול קר מימי (v/v, -50°C) באמצעות מזרק פלסטיק עם מחט. צלוחיות התרבית נשמרו על קרח וחולצו עם 1 מ"ל של 80% מתנול (v/v, -50°C), והתאים נותקו מכנית באמצעות מגרד תאים. פסולת התא נוקזה החוצה עם פיפטה. עבור מיצוי נוסף, נוספו עוד 2 מ"ל של מתנול קר. תמציות המתנול שולבו, עברו צלילים (30 שניות) וצנטריפוגה (1800 ז5 דקות, 4 מעלות צלזיוס), והסופרנטנטים יובשו בהקפאה.

הכנת lysates תאים

סך של 500 μL של מתנול קר 80% נוספו לכל lyophilizate וערבבו היטב. הדגימות עברו צנטריפוגה ב-15,000 ז במשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והסופרנטנטים נלקחו לניתוח.

הכנת מדיה סלולרית

המדיה היו מעורבים באמצעות מערבולת ואז, 100 μL מכל דגימה נלקחו ונוספו 300 μL של 80% מתנול. הדגימות הושארו ב-80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. התמציות עברו צנטריפוגה ב-15,000 ז במשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, והסופרנטנטים נותחו.

ניתוח פרגמנטציה של תוצרי ביניים PDNS והאנלוגים הדה-פוספורילטים שלהם (HPLC-HRMS n)

הפרדה כרומטוגרפית הושגה עם כרומטוגרפיה של נוזל אינטראקציה הידרופילי באמצעות Ultimate 3000 RS (ThermoFisher Scientific, MA, ארה"ב). עמודת האמינופרופיל (Luna NH2 3 מיקרומטר 100 Å, 100 x 2 מ"מ, Phenomenex, Torrance, ארה"ב) נשמר ב-35°C. השלב הנייד כלל 20 מ"מ אמוניום אצטט במים ב-pH 9.75 (פאזה ניידת A) ואצטוניטריל (שלב נייד B). שחרור הגרדיאנט בוצע באופן הבא: t = 0.0, 95% B t = 7.0-13.0, 10% B t = 14.0-17.0, 95% B. קצב הזרימה נקבע ל-0.3 מ"ל/דקה, ונפח ההזרקה היה 2 μL.

ניתוח פיצול רב-שלבי בוצע על Orbitrap Elite (ThermoFisher Scientific, MA, ארה"ב) הפועל במצב חיובי באמצעות יינון אלקטרוספריי (טמפרטורה נימית 350°C, טמפרטורת מחמם מקור 300°C, גז נדן 10 arb. יחידות, גז עזר 35 arb. יחידות, גז לטאטא 0 יחידות ארב). מתח האלקטרוספריי נקבע ל-+3.0 קילוואט. פיצול עבור השברים הנפוצים ביותר עם עוצמות גבוהות מ-1E4 בוצע באמצעות ניתוח תלוי נתונים (DDA) או TreeRobot (HighChem, SK) אחרת, בחירת השברים בוצעה באופן ידני. עד חמישה מהאותות האינטנסיביים ביותר ב-MS 2 בודדו ופוצלו עוד יותר. לאחר מכן, אחד עד שישה מהאותות האינטנסיביים ביותר מכל ספקטרום MS 3 עברו פיצול ל-MS 4. השלבים הבאים של MS n היו תלויים גם בעוצמות של השברים המתעוררים, בדרך כלל לייצר ספקטרום של אחד או שניים המקטעים האינטנסיביים ביותר מ-MS 4 /MS 5. ספקטרום הפרגמנטציה הופקו באמצעות ניתוק המושרה בהתנגשות (CID) תוך שימוש ב-30 יחידות של אנרגיית התנגשות מנורמלת, רוחב הבידוד היה 2 Da, וזמן ההזרקה היה 200 אלפיות השנייה. כל ספקטרום הפרגמנטציה נמדדו ברזולוציה של 120,000 ברוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM) ועם שגיאת מסה מתחת ל-3 ppm. ספקטרום הפרגמנטציה הרב-שלבי של כל תרכובת אורגנו בעצים ספקטרליים מסתיים. בכל ספקטרום, המבנים של הפרגמנטים השייכים לתרכובת/פרגמנט המקדים (מטרה) זוהו באמצעות תוכנת הפרגמנטציה החזויה MassFrontier 7.0.5.09 SP3 (HighChem, SK).

ניתוח של lysates תאים ומדיה

התנאים הכרומטוגרפיים היו זהים לניתוח HPLC-HRMS n שהוזכר לעיל. הזיהוי בוצע על Orbitrap Elite הפועל במצב יינון חיובי באותה הגדרה כמו לעיל. שיטת הזיהוי חולקה לארבעה מקטעי זמן. ניתוח סריקה מלא בטווח המסה מ/ז 70-1000 בוצעו בקטע הראשון (0.0-3.0 דקות) והרביעי (12.0-17.0 דקות). שיטת ניטור היונים שנבחרה (SIM) יושמה במקטע השני (3.0-7.0 דקות) לניתוח של ריבוזידים (מ/ז 177–417) ובמקטע השלישי (7.0–12.0 דקות) לניתוח ריבוטידים (מ/ז 257–497) כדי להגביר את הרגישות כלפי מטבוליטים אלה (למעט מדידת SAdo ו-SAMP, אשר היו שונים מ/ז טווחים: 379–389 ו-459–469, בהתאמה). הרזולוציה נקבעה ל-60,000 FWHM. שגיאת המסה הייתה מתחת ל-3 עמודים לדקה. כל שורות התאים נמדדו ב-hexaplicate, וערכי העוצמה מוצגים כממוצעים. הזהויות של התרכובות המצטברות הן ב-lysates של התא והן במדיה אושרו על ידי ניתוח פיצול MS 2. ספקטרום פיצול הופקו באמצעות CID כאשר אנרגיית הפיצול מוגדרת ל-30 יחידות של אנרגיית התנגשות מנורמלת.


פורינים מסונתזים ביולוגית כנוקלאוטידים ובפרט כריבוטידים, כלומר בסיסים המחוברים לריבוז 5-פוספט. גם אדנין וגם גואנין מופקים מהנוקלאוטיד אינוזין מונופוספט (IMP), שהוא התרכובת הראשונה במסלול שיש לה מערכת טבעת פורין שנוצרה לחלוטין.

עריכת IMP

אינוזין מונופוספט מסונתז על ריבוז-פוספט קיים מראש דרך מסלול מורכב (כמתואר באיור מימין). מקור אטומי הפחמן והחנקן של טבעת הפורין, 5 ו-4 בהתאמה, מגיעים ממקורות רבים. חומצת האמינו גליצין תורמת את כל אטומי הפחמן (2) והחנקן (1) שלה, עם אטומי חנקן נוספים מגלוטמין (2) וחומצה אספרטית (1), ואטומי פחמן נוספים מקבוצות פורמיל (2), המועברים מה- קואנזים טטרה-הידרופולאט כ-10-formyltetrahydrofolate, ואטום פחמן מביקרבונט (1). קבוצות פורמיל בונות פחמן-2 ופחמן-8 במערכת הטבעת הפורין, שהם אלו הפועלים כגשרים בין שני אטומי חנקן.

שלב רגולטורי מרכזי הוא ייצור של 5-פוספו-α-ד-ribosyl 1-pyrophosphate (PRPP) על ידי ריבוז פוספט pyrophosphokinase, המופעל על ידי פוספט אנאורגני ומושבת על ידי ריבונוקלאוטידים פורין. זה לא הצעד המחויב לסינתזת פורין מכיוון ש-PRPP משמש גם בסינתזה של פירמידין ומסלולי הצלה.

הצעד המתחייב הראשון הוא התגובה של PRPP, גלוטמין ומים ל-5'-פוספוריבוסילאמין (PRA), גלוטמט ופירופוספט - מזורז על ידי amidophosphoribosyltransferase, המופעל על ידי PRPP ומעוכב על ידי AMP, GMP ו-IMP.

PRPP + L-Glutamine + H2O → PRA + L-Glutamate + PPi

בשלב השני הגיבו ל-PRA, גליצין ו-ATP ליצירת GAR, ADP ו-pyrophosphate - מזורז על ידי phosphoribosylamine-גליצין ליגאז (GAR synthetase). בשל הרגישות הכימית של PRA, שיש לו זמן מחצית חיים של 38 שניות ב-PH 7.5 ו-37 מעלות צלזיוס, חוקרים הציעו שהתרכובת עוברת מ-amidophosphoribosyltransferase לסינתטאז GAR in vivo. [1]

PRA + גליצין + ATP → GAR + ADP + Pi

fGAR + L-Glutamine + ATP → fGAM + L-Glutamate + ADP + Pi

fGAM + ATP → AIR + ADP + Pi + H2או

השמונה מזורזת על ידי ליאז אדנילוסוצ'ינט.

המוצרים AICAR ו- fumarate עוברים לשני מסלולים שונים. AICAR משמש כמגיב לשלב התשיעי, בעוד שפומראט מועבר למחזור חומצת לימון אשר יכול לדלג על שלבי התפתחות הפחמן הדו חמצני לייצור מאלאט. ההמרה של פומארט למאלאט מזורזת על ידי fumarase. בדרך זו, פומאראט מחבר את סינתזת הפורין למחזור חומצת הלימון. [2]

באאוקריוטים השלב השני, השלישי והחמישי מזורזים על ידי חלבון ביו-סינטטי פורין תלת-פונקציונלי אדנוזין-3, המקודד על ידי הגן GART.

הן השלב התשיעי והן העשירי מבוצעים על ידי חלבון יחיד בשם Bifunctional purine biosynthesis protein PURH, המקודד על ידי הגן ATIC.

עריכת GMP

עריכת AMP

פורינים עוברים חילוף חומרים על ידי מספר אנזימים:

עריכת גואנין

  • נוקלאז משחרר את הנוקלאוטיד
  • נוקלאוטידאז יוצר גואנוזין הופך גואנוזין לגואנין הופך גואנין לקסנטין (צורה של קסנטין אוקסידורדוקטאז) מזרז את החמצון של קסנטין לחומצת שתן

אדנין עריכה

  • נוקלאז משחרר את הנוקלאוטיד
    • נוקלאוטידאז יוצר אדנוזין, ואז אדנוזין דמינאז יוצר אינוזין
    • לחלופין, AMP deaminase יוצר חומצה אינוזין, ואז נוקלאוטידאז יוצר אינוזין

    תקנות של ביו-סינתזה של נוקלאוטיד פורין עריכה

    היווצרות 5'-פוספוריבוסיאמין מגלוטמין ו-PRPP המזרז על ידי PRPP אמינו טרנספראז היא נקודת הוויסות לסינתזה של פורין. האנזים הוא אנזים אלוסטרי, ולכן ניתן להמיר אותו מ-IMP, GMP ו-AMP בריכוז גבוה קושר את האנזים למפעיל עיכוב בעוד ש-PRPP בכמות גדולה נקשר לאנזים הגורם להפעלה. אז IMP, GMP ו-AMP הם מעכבים בעוד PRPP הוא מפעיל. בין היווצרות 5'-פוספוריבוסיל, aminoimidazole ו-IMP, אין שלב ויסות ידוע.

    ניתן גם להציל פורינים מהתחלופה של חומצות גרעין תאיות (או ממזון) ולעשות שימוש חוזר בנוקלאוטידים חדשים.

    • The enzyme adenine phosphoribosyltransferase (APRT) salvages adenine.
    • The enzyme hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) salvages guanine and hypoxanthine. [3] (Genetic deficiency of HGPRT causes Lesch–Nyhan syndrome.)

    When a defective gene causes gaps to appear in the metabolic recycling process for purines and pyrimidines, these chemicals are not metabolised properly, and adults or children can suffer from any one of twenty-eight hereditary disorders, possibly some more as yet unknown. Symptoms can include gout, anaemia, epilepsy, delayed development, deafness, compulsive self-biting, kidney failure or stones, or loss of immunity.

    Purine metabolism can have imbalances that can arise from harmful nucleotide triphosphates incorporating into DNA and RNA which further lead to genetic disturbances and mutations, and as a result, give rise to several types of diseases. Some of the diseases are:

    1. Severe immunodeficiency by loss of adenosine deaminase.
    2. Hyperuricemia and Lesch–Nyhan syndrome by the loss of hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase.
    3. Different types of cancer by an increase in the activities of enzymes like IMP dehydrogenase. [4]

    Modulation of purine metabolism has pharmacotherapeutic value.

    Purine synthesis inhibitors inhibit the proliferation of cells, especially leukocytes. These inhibitors include azathioprine, an immunosuppressant used in organ transplantation, autoimmune disease such as rheumatoid arthritis or inflammatory bowel disease such as Crohn's disease and ulcerative colitis.

    Mycophenolate mofetil is an immunosuppressant drug used to prevent rejection in organ transplantation it inhibits purine synthesis by blocking inositol monophosphate dehydrogenase. Also Methotrexate indirectly inhibits purine synthesis by blocking the metabolism of folic acid (it is an inhibitor of the dihydrofolate reductase).

    Allopurinol is a drug that inhibits the enzyme xanthine oxidoreductase and, thus, lowers the level of uric acid in the body. This may be useful in the treatment of gout, which is a disease caused by excess uric acid, forming crystals in joints.

    In order to understand how life arose, knowledge is required of the chemical pathways that permit formation of the key building blocks of life under plausible prebiotic conditions. Nam et al. [5] demonstrated the direct condensation of purine and pyrimidine nucleobases with ribose to give ribonucleosides in aqueous microdroplets, a key step leading to RNA formation. Also, a plausible prebiotic process for synthesizing purine ribonucleosides was presented by Becker et al. [6]


    צפו בסרטון: De Novo Purine Synthesis. USMLE Step 1 Biochemistry Mnemonic (נוֹבֶמבֶּר 2022).