מֵידָע

שכפול DNA: כריכה

שכפול DNA: כריכה


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

לגבי אקטיבטור, האם קומפלקס ה-C amp cap נקשר לגדיל הקידוד, לגדיל התבנית או לשניהם?


שניהם. עליך לשים לב שהפעלה במקרה זה כרוכה בגיוס של RNA פולימראז להנעת שעתוק, וכי תהליך זה אינו רלוונטי לשכפול ה-DNA. B באיור מציג מגעים של חומצות אמינו (מ-CAP) עם נוקלאוטידים ספציפיים בדופלקס ה-DNA.

קישור DNA על ידי CAP: מבנה קומפלקס CAP-DNA.

(א) מבנה של CAP במתחם עם אתר ה-DNA הקונצנזוס שלו (PDB 1RUN) [14], מראה אתרים ראשוניים ומשניים. CAP הוא בצבע ציאן; DNA ו-cAMP הקשורים ל-CAP הם באדום. קטע ה-DNA התגבשות הכיל פער של פוספט בודד בין עמדות 9 ו-10 של כל חצי אתר של DNA (איור 1b).

(ב) סיכום של אינטראקציות CAP-DNA. תיבות מוצללות מציינות עמדות בהן CAP מציג העדפות רצף חזקות [11,15,16,17]. העיגול השחור, המלבנים השחורים והיהלומים השחורים מציינים, בהתאמה, את שני צירי הסימטריה של קיפול, אתרי הקיפול הראשוניים; ואתרי הקיק המשניים. הקווים האנכיים השחורים מציינים את מיקומם של פערי פוספט בודדים הנמצאים בשבר ה-DNA ההתגבשות. אליפסות הציאן והעיגולים הציאן מציינים, בהתאמה, מגעים של חומצות אמינו-בסיס ומגעי חומצה אמינו-פוספט.

דמות מתוך: Catherine L. Lawson, et al. 2004. חלבון מפעיל קטבוליטי (CAP): קישור DNA והפעלת שעתוק. Curr. דעה. מבנה. ביול. 14:10.


העתקת הוראות

הדרך היחידה ליצור תאים חדשים היא על ידי חלוקה של תאים קיימים. אורגניזמים חד-תאיים עוברים חלוקה כדי לייצר יותר תאים כמוהם, בעוד שאורגניזמים רב-תאיים נוצרים באמצעות חלוקה של תא בודד, בדרך כלל הביצית המופרית. בכל פעם שתא מתחלק, יש להעתיק את כל ה-DNA שלו בנאמנות כדי שניתן יהיה להעביר עותק של מידע זה לתא הבת. תהליך זה נקרא שכפול DNA. זהו האמצעי שבאמצעותו ניתן להעביר מידע גנטי לאורך דורות של תאים, והוא מבטיח שלכל תא חדש יהיה עותק שלם של הגנום. בחלק הבא נבחן את התהליך שבו ה-DNA של תא מועתק בצורה מלאה ומדויקת.

איור 7.8 - מבנה ה-DNA של Watson & Crick & rsquos - ויקיפדיה

מבנה ה-DNA שבירר ווטסון וקריק ב-1953 הציע מיד מנגנון שבאמצעותו ניתן להעתיק DNA דו-גדילי כדי לתת שני עותקים זהים של ה-DNA. הם הציעו ששני הגדילים של מולקולת ה-DNA, המוחזקים יחד על ידי קשרי מימן בין הנוקלאוטידים המזוהים עם הבסיסים, ייפרדו וכל אחד מהם ישמש כתבנית שעליה ניתן להרכיב גדיל משלים (איור 7.8). כללי זיווג הבסיסים יבטיחו שתהליך זה יביא לייצור של שתי מולקולות DNA זהות. הפשטות היפה של תכנית זו הוכחה כנכונה בניסויים שלאחר מכן על ידי Meselson ו-Stahl, שהוכיחו ששכפול ה-DNA היה שמרני למחצה, כלומר, שלאחר השכפול, כל אחת משתי מולקולות ה-DNA שהתקבלו הייתה מורכבת מגדיל ישן אחד גדיל אחד חדש שהורכב מולו (איור 7.9).

איור 7.9 - שכפול חצי שמרני - תמונה מאת מרתה בייקר


ניתוק שכפול DNA

ה-DNA הוא מולקולה ארוכה - יותר פי 1,000 בערך מהתא שבו הוא שוכן - כך שלא ניתן להכניס אותה באופן אקראי. במקום זאת, הוא חייב להיות מאורגן בצורה מסודרת כך שחלבונים המעורבים בתהליכים קריטיים יוכלו לגשת למידע הכלול בבסיסי הנוקלאוטידים שלו. תחשוב על הסליל הכפול כמו זוג שרוכי נעליים מעוותים יחד, מתפתלים על עצמם שוב ושוב כדי להפוך את המולקולה לקומפקטית עוד יותר.

עם זאת, כשמגיע הזמן לחלוקת תאים, הטבע המפותל הזה מקשה על חלבונים המעורבים בשכפול ה-DNA לגשת לגדילים, להפריד אותם ולהעתיק אותם כך שמולקולת DNA אחת יכולה להפוך לשניים.

שכפול מתחיל באזורים ספציפיים של הכרומוזום שבהם חלבונים מיוחדים מפרידים בין שני הגדילים, ומפרקים את הסליל הכפול כמו שני שרוכי הנעליים. עם זאת, ההפרדה המקומית הזו למעשה מסבכת את שאר המולקולה עוד יותר, וללא התערבות יוצרת הצטברות של מתח, ומעכבת את השכפול. הכנס את האנזימים הידועים בשם טופואיזומראזים, הנוסעים לפני הגדילים כשהם מתקלפים, חותכים אותם, מתפתלים אותם ואז מחברים אותם מחדש כדי להפיג את המתח הנובע מסלילת-על.

בדרך כלל חושבים שהטופואיזומראזות האלה מספיקות כדי לאפשר לשכפול להתקדם. עם זאת, צוות חוקרים מ-MIT ומבית הספר לרפואה של אוניברסיטת דיוק מציע שהאנזימים עשויים לדרוש הדרכה מחלבונים נוספים, המזהים את הצורה האופיינית ל-DNA מעוות יתר על המידה.

"ידענו זמן רב שטופואיזומראזים נחוצים לשכפול, אבל מעולם לא היה ברור אם הם מספיקים בפני עצמם", אומר מייקל לאוב, פרופסור לביולוגיה ב-MIT, חוקר המכון הרפואי הווארד יוז ומחבר בכיר של הספר. המחקר. "זהו המאמר הראשון לזהות חלבון בחיידקים, או איקריוטים, שנדרש כדי לאתר טופואיזומראזים לפני מזלגות שכפול ולעזור להם לעשות את מה שהם צריכים לעשות שם."

פוסט-דוקטורט מוניקה גואו '07 והסטודנטית לתואר שני דיאן האקונסן PhD '16 הן מחברות ראשונות של המחקר, שהופיע באינטרנט בכתב העת תָא ב-13 בספטמבר.

הכרחי אבל לא מספיק

למרות שזה ידוע היטב כי טופואיזומראזים חיוניים לשכפול ה-DNA, כעת התברר שאנו יודעים מעט יחסית על המנגנונים המווסתים את פעילותם, כולל היכן ומתי הם פועלים להקלה על סליל העל.

אנזימים אלה מתחלקים לשתי קבוצות, סוג I וסוג II, תלוי בכמה גדילי DNA הם חותכים. החוקרים התמקדו בטופואיזומראזים מסוג II שנמצאו במין נפוץ של חיידקי מים מתוקים, סמול Caulobacter. טופואיזומראזות מסוג II בחיידקים מעניינים במיוחד מכיוון שמספר אנטיביוטיקה מכוונת אליהם על מנת למנוע שכפול DNA, מטפלת במגוון רחב של זיהומים מיקרוביאליים, כולל שחפת. ללא טופואיזומראזות, החיידקים לא יכולים לגדול. מכיוון שהאנזימים החיידקיים הללו הם ייחודיים, רעלים המכוונים אליהם לא יפגעו בטופואיזומראזים אנושיים.

במשך זמן רב, טופואיזומראזים מסוג II נחשבו בדרך כלל מתאימים בעצמם כדי לנהל את סלילי העל המעוותים המתעוררים במהלך השכפול. למרות שחוקרים עובדים ב אי - קולי ושאר אורגניזמים גבוהים יותר זיהו חלבונים נוספים שיכולים להפעיל או לדכא את האנזימים הללו, אף אחד מהחלבונים הללו לא נדרש לשכפול.

ממצאים כאלה רמזו שאולי יש אינטראקציות דומות המתרחשות באורגניזמים אחרים. על מנת להבין את גורמי החלבון המעורבים בדחיסה Caulobacter ה-DNA - המסדיר את פעילות הטופואיזומראז באופן ספציפי - החוקרים בדקו את החיידקים שלהם לאיתור חלבונים שנקשרו בחוזקה ל-DNA מפותל. משם, הם חידדו חלבון אחד, GapR, שהם ראו שהוא חיוני לשכפול ה-DNA. בחיידקים חסרי GapR, ה-DNA התעוות יתר על המידה, השכפול הואטה, ובסופו של דבר החיידקים מתו.

באופן מפתיע, החוקרים מצאו ש-GapR זיהה את המבנה של DNA מעוות יתר על המידה ולא רצפי נוקלאוטידים ספציפיים.

"הרוב המכריע של החלבונים הקושרים ל-DNA מתמקם למיקומים ספציפיים של הגנום על ידי זיהוי קבוצה מסוימת של בסיסים", אומר לאוב. "אבל GapR בעצם לא שם לב לרצף הבסיסי בפועל - רק הצורה של DNA מעוות יתר על המידה, שמתעוררת באופן ייחודי מול מזלגות שכפול ומכונות שעתוק."

המבנה הגבישי של החלבון הקשור ל-DNA, שנפתר על ידי מריה שומאכר של הדוכס, חשף ש-GapR מזהה את עמוד השדרה של ה-DNA (ולא את הבסיסים), ויוצר מהדק צמוד שמקיף את ה-DNA המעוות יתר על המידה. עם זאת, כאשר ה-DNA רגוע בצורתו הסטנדרטית, הוא כבר לא מתאים בתוך המהדק. זה עשוי להצביע על כך ש-GapR יושב על DNA רק בעמדות בהן יש צורך בטופואיזומראז.

ציון דרך מרגש

למרות שנראה ש-GapR נדרש לשכפול ה-DNA, עדיין לא ברור כיצד חלבון זה מקדם את תפקוד הטופואיזומראז כדי להקל על סליל-על.

"בהיעדר חלבונים אחרים, GapR מסוגל לעזור לטופואיזומראזים מסוג II להסיר סלילי-על חיוביים מהר יותר, אבל אנחנו עדיין לא ממש יודעים איך", אומר גואו. "רעיון אחד הוא ש-GapR מקיים אינטראקציה עם טופואיזומראזות, מזהה את ה-DNA המעוות יתר על המידה ומגייס את הטופואיזומראזות. אפשרות נוספת היא ש-GapR בעצם תופס את ה-DNA ומגביל את התנועה של סלילי העל החיוביים, כך שטופואיזומראזים יכולים לכוון ולחסל אותם מהר יותר".

אנתוני מקסוול, פרופסור לכימיה ביולוגית במרכז ג'ון אינס שלא היה מעורב במחקר, אומר שהצטברות של סלילי-על של DNA היא בעיה מרכזית הן בשכפול והן בשעתוק החיידקים.

"זיהוי GapR ותפקידו הפוטנציאלי בשליטה ב- supercoiling in vivo הוא אבן דרך מרגשת בהבנת השליטה בטופולוגיית ה-DNA בחיידקים", הוא אומר. "תידרש עבודה נוספת כדי להראות כיצד בדיוק החלבונים הללו משתפים פעולה כדי לשמור על שלמות גנומית חיידקית."

לדברי גואו, המחקר מספק תובנה לגבי תהליך בסיסי - שכפול DNA - והדרכים שבהן מווסתות הטופואיזומראזות, שיכולות להתרחב גם לאאוקריוטים.

"זו הייתה ההדגמה הראשונה שדרוש מפעיל טופואיזומראז לשכפול DNA", היא אומרת. "למרות שאין הומלוג GapR באורגניזמים גבוהים יותר, יכולים להיות חלבונים דומים המזהים את צורת ה-DNA ומסייעים או ממקמים טופואיזומראזים."

זה יכול לפתוח תחום חדש של מחקר תרופות, היא אומרת, המתמקד במפעילים כמו GapR כדי להגביר את היעילות של רעלי טופואיזומראז קיימים לטיפול במצבים כמו דלקות בדרכי הנשימה ודרכי השתן. אחרי הכל, מעכבי טופואיזומראז רבים הפכו פחות יעילים בגלל עמידות לאנטיביוטיקה. אבל רק הזמן יגיד שיש עוד הרבה מה ללמוד כדי להתיר את התהליך המורכב של שכפול ה-DNA, יחד עם פיתוליו הרבים.

המחקר מומן על ידי מענקי NIH, מלגת הקדם-דוקטורט הבינלאומית של HHMI ומילגת הזיכרון של ג'יין Coffin Childs.


תיקון DNA

הימאשה מ פררה , . Michael A. Trakselis, ב"האנזימים", 2019

2.4 חיידקים

הטעינה של ההליקאז המשכפל החיידקי (DnaB) מזורזת הן על ידי חלבון יוזם השכפול (DnaA) והן מטען ההליקאזות (DnaC) (טבלה 1 ואיור 1 A) [20-22] במקור השכפול (oriC) [23] . DnaA הוא חלבון שמור מאוד בקרב חיידקים, הקושר אזורים נפרדים של oriC דרך מוטיב סליל-סיבוב-סליל בתוך ה-CTD ליצירת אוליגומרים [24] . אוליגומרים פעילים של DnaA מווסתים את התחלת שכפול ה-DNA של חיידקים בעיקר באמצעות קישור ATP, שינוי הקונפורמציה של האוליגומר לפתיחת בועת ssDNA DUE. DnaC הוא חלבון מונומרי הקושר כל תת-יחידה של מכלול החלבון DnaB ביחס של 1:1 כדי להתאים את הטבעת לצורת מכונת שטיפה פתוחה לפני העמסתה על ה-DUE הפתוח [25-27]. שני קומפלקסים DnaB-DnaC מגוייסים ונטענים ברצף על גדילים מנוגדים, כך שכל סליל מקיף גדיל אחד ומוציא את השני [28] . לאחר הטעינה, ה-DnaC נעקר על ידי הפרימאז (DnaG), אשר מייצב את צווארון ה-DnaB מסוף N וממריץ את פעילות ההליקאזות [29,30]. ברגע שה-DnaB הפעיל משתחרר על ידי DnaC, הוא מתחיל להעביר את ה-CTD תחילה לכיוון 5'-3' על מה שיהפוך לגדיל המשכי בקצב של כ-35 זוגות בסיסים בשנייה [31] . לאחר שנחשף אזור מתאים של ssDNA, DnaG מסנתז פריימר RNA דה נובו, גיוס קומפלקס הפולימראז המשכפל כולל ההולואנזים Pol III (HE), ושכפול ה-DNA מתחיל ברצינות.

איור 1 . התחלת שכפול DNA של קונצנזוס ושלבי טעינת הליקאזות הקסאמריות בחיידקים ובאיקריוטים. ה יָזוּם מצב מגדיר את המקור באמצעות קישור של חלבוני התחלה. ה עמוס מצב כולל חלבונים נלווים המשמשים לטעינת הליקאזות הקסאמריות על ssDNA חשוף (חיידקים) או dsDNA (אאוקריוטים). ה מוּפעָל המדינה מגייסת חלבונים המקיימים אינטראקציה המשפרים את היכולת האנזימטית להתנתקות ה-DNA. סוף - סוף, ה מְבוּסָס רפליזום מתאם דנ"א להתפרקות עם סינתזה.


סיכום מדור

שכפול בפרוקריוטים מתחיל מרצף שנמצא בכרומוזום שנקרא מקור השכפול - הנקודה שבה הדנ"א נפתח. הליקייס פותח את הסליל הכפול של ה- DNA, וכתוצאה מכך נוצר מזלג השכפול. חלבונים מחייבים חד גדילים נקשרים ל- DNA החד גדילי ליד מזלג השכפול כדי לשמור על המזלג פתוח. Primase מסנתז פריימר RNA כדי להתחיל סינתזה על ידי DNA פולימראז, שיכול להוסיף נוקלאוטידים רק בכיוון 5′ עד 3′. גדיל אחד מסונתז ברציפות בכיוון מזלג השכפול זה נקרא גדיל מוביל. הגדיל השני מסונתז בכיוון הרחק ממזלג השכפול, בקטעים קצרים של DNA המכונה שברי אוקזאקי. גדיל זה ידוע בתור הגדיל המשכי. לאחר השלמת השכפול, תחל ה- RNA מוחלף בנוקלאוטידים של ה- DNA וה- DNA נאטם עם ליגאז DNA, היוצר קשרים פוספודיאסטר בין 3 ′-OH של קצה אחד לבין הפוספט 5 ′ של הגדיל השני.


חומרים ושיטות

טיהור של DnaA מתויג בהקסה-היסטידין, הכנת DNA גנומי גזוז, חידוד הקטלוג של אזורי מחייב DnaA ופיתוח של PSSM תיבת DnaA מתוארים בטקסט S1.

DnaA-שלו

ב. subtilis DnaA עם חומצות האמינו AAALEHHHHHH שנוספו לקצה C של DnaA טוהר מ ה. coli (טקסט S1). DnaA סופי - ההכנות שלו היו בדרך כלל טהורות ב-98%. DnaA מתויג באופן דומה (עם 12 במקום שישה היסטידינים) מתפקד in vivo [9].

טיהור זיקה של DNA:DnaA-קומפלקסים

תגובות קישור (ב-250 מיקרומטר) נעשו עם DnaA-his (בריכוזים של 0, 55 ננומטר, 140 ננומטר, 550 ננומטר, 1.4 מיקרומטר ו-4.1 מיקרומטר) ו-DNA גנומי גזור (0.2 מ"ג/מ"ל) ב-40 מ"מ HEPES KOH, pH 7.6, 150 מ"מ אשלגן גלוטמט, 2.5 מ"מ ATP או ADP, 10 מ"מ מגנזיום אצטט, 0.2 מ"מ DTT, 50 מיקרוגרם/מ"ל BSA, 0.1 מ"מ EDTA, 20% גליצרול ו-4% סוכרוז בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. DNA גנומי טוהר מא dnaBts מוטציה [29, 43, 44]. DnaA-his נקשר עם נוקלאוטיד על ידי דגירה מוקדמת במאגר אחסון עם 2.5 מ"מ ATP או ADP על קרח במשך שעתיים מיד לפני השימוש בתגובות מחייבות, כפי שתואר קודם [23].

כל תגובה עורבבה עם 100 μl Talon Co + שרף (קלונטק) מאוזן מראש עם חיץ שיווי משקל/שטיפה (40 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.6, 150 מ"מ אשלגן גלוטמט, 2.5 מ"מ ATP או ADP, 10 מ"מ מגנזיום אצטט, 50 מיקרוגרם. /ml BSA, 20% גליצרול) וסובב במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. כל תערובת הועברה לעמודת Poly-Prep (Bio-Rad, Hercules, CA), ונשטפה שלוש פעמים עם חיץ איזון/שטיפה של 1 מ"ל, תוך הקפדה על כך שכל השטיפות יתבצעו בתנאים כמעט זהים. קומפלקסים של DnaA-his הקשור ל-DNA נפלטו על ידי הוספת 0.5 מ"ל חיץ צ'יפ elution (50 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 10 מ"מ EDTA, 1% SDS), מכסה את החלק התחתון ומכסה היטב את החלק העליון של העמודות בנייר כסף, ודגירה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. ה-eluate נאסף, והשרף נשטף פעמיים עם 200 μl חיץ eluation ChIP כדי לשחזר את כל ה-DNA שנפלט. ה-DNA המשוחזר טוהר באמצעות ערכת טיהור QiaQuick PCR (Qiagen).

רצף DNA

הכנת דגימה, כולל שילוב של ברקוד 3', בחירה של שברי 200-400 bp (לאחר הוספת מתאמים והגברה), ורצף קריאה בודדת (40 nt) על Illumina HiSeq בוצעו על ידי MIT BioMicro Center.

עיבוד נתונים Seq ואלגוריתם שיחות שיא

יישור קטעי DNA הקשורים ב-DnaA-his לגנום של AG1839 (a.k.a., KPL69 GenBank מספר כניסה CP008698) [29] בוצע באמצעות Bowtie [45], עם התאמות כדי לפצות על העובדה שהכרומוזום הוא עגול. קריאת שיא על 1.4 מיקרומטר ו-4.1 מיקרומטר ATP-DnaA-הנתונים שלו נעשתה באמצעות cisGenome v. 2.0 [46], ובמקרים מסוימים PeakSplitter [47], והוצגה בדפדפן הגנום MochiView [48] לחידוד ידני (ראה S1 טקסט לפרטים). מיקום הגנום של פסגת כל פסגה נקבע באמצעות נתונים מתגובת הקישור של 4.1 מיקרומטר ATP-DnaA-his, מכיוון שהפסגות (במיוחד החלשות יותר) הוגדרו טוב יותר בריכוז DnaA זה. נתוני Seq זמינים ב-NCBI תחת ההצטרפות SRX648534.

כמות הכריכה וקביעת קבועי הכריכה לכאורה

כדי לקבוע את כמות ה-DNA הקשור ל-DnaA-his עבור כל אזור כרומוזומלי, קבענו את מספר קריאות הרצף על פני אותו אזור. כל רצף שנקרא (מופה לכרומוזום באמצעות Bowtie) הורחב מבחינה חישובית על ידי אורך הפרגמנט הממוצע המשוער של 250 זוגות בסיסים (מוצג באופן סכמטי באיור S3A ו-S3B). הכיסוי היחסי בכל bp לאורך הכרומוזום הושג על ידי סיכום מספר השברים על הגדילים החיוביים והשליליים שנקבעו שהם משתרעים על מיקום זה (איור S3C). נעשה שימוש בסקריפט R מותאמים אישית עבור שלבים אלה. מפת הכיסוי שהתקבלה אפשרה להשוות אזורים שונים לאורך הכרומוזום עבור כל מדגם נתון.

כדי להשוות לוקוסים בודדים במגוון תנאי קשירה (למשל, ATP נגד ADP, או בריכוזים שונים של DnaA), נרמלנו את מספר קריאות הרצף (משרעות של מפת כיסוי) לכמות הכוללת של DNA ששוחזר בכל תגובה (S1 טקסט, איור S3D–S3G). כמות ה-DNA שהתאוששה בכל דגימה עלתה בכמויות הולכות וגדלות של DnaA (S3F Fig), עקב 1) עלייה בקשירה לרקע, 2) עלייה בקשירה באזורים שעדיין לא הגיעו לרוויה, ו-3) קשירה במצב חלש יותר. אזורים מחייבים. מדידות של הקישור המקסימלי בעקבות נורמליזציה לעומת ריכוז DNA נתנו נתונים שיכולים להתאים לעקומת קישור (איור S3H).

לכאורה קדאלה נקבעו באמצעות Prism5 (תוכנת GraphPad). הנתונים התאימו למשוואה y = (Bמקסימום)(x n )/(Kד n + x n ), כאשר Bמקסימום הוא הקישור המקסימלי, x הוא ה-DnaA-ריכוז שלו, y היה כמות הקישור שנצפה, ו-n הוא קבוע ה-Hill. עבור כל אזור מקשר, מיקום השיא נקבע במערך הנתונים של 4.1 מיקרומטר DnaA, וגובה השיא באותו מיקום נקבע עבור ריכוזי ה-DnaA הנמוכים יותר והשתמש בו ככמות הקישור. עבור אזורים מחייבים שהתקרבו לרוויה, Bמקסימום הותאמה מהנתונים המחייבים. עבור מספר אזורים מחייבים, במקסימום ניתן לקבוע ל-ATP- אך לא ADP-DnaA-his. במקרים אלה, ה-Bמקסימום שנקבע עבור ATP-DnaA-his שימש כדי להתאים את נתוני ADP-DnaA-his. בכל שאר המקרים, במקסימום של 0.8 שימש לקביעת K לכאורהד.

ביאור של תיבות DnaA

קופסאות DnaA ב ב. subtilis הגנום סומנו באמצעות ה-PSSM שנוצר כחלק ממחקר זה (S1 Text). PSSM זה שימש לחיפוש רצף הגנום של גנום AG1839 באמצעות RSAT [49] עם חיתוך ערך p של ≤ 0.0015. כאשר זוהו תיבות DnaA חופפות, זו עם ערך ה-p הגבוה יותר נמחקה. אוסף זה של קופסאות DnaA שימש בכל הדמויות והטבלאות. ציון "DnaA Box Score" עבור אזורי הקישור חושב על ידי סיכום הלוג השלילי של ערך P מה-PSSM עבור כל אזור מחייב.

In vivo השתמשו ב-DnaA Chip-PCRs וזנים

DnaA נקשר לאזורים כרומוזומליים ספציפיים in vivo נקבע על ידי ChIP ואחריו PCR כמותי (ChIP-PCR). סוג פראי (גנוטיפ AG174: trp, phe) ו rok מוטציה null trp, phe, rok::pDG641rok (mls)> תאים גודלו ב-37 מעלות צלזיוס במדיום LB. (ה rok מוטציית null היא שילוב של פלסמיד pDG641rok לתוך rok על ידי מוצלב יחיד, משבש את rok מסגרת קריאה פתוחה.) תאים באמצע השלב האקספוננציאלי טופלו ב-1% פורמלדהיד למשך 20 דקות כדי להצליב חלבון ו-DNA. קישור צולב הופסק על ידי הוספת גליצין (0.22 M). הכנת lysates ומשקעים אימונו נעשו בעיקרו כפי שתואר קודם [50]. ה-DnaA הוחלט על ידי אנטי-סרום פוליקלונאלי של ארנבת וה-DNA שוחזר באמצעות ערכת טיהור QiaQuick PCR (Qiagen). PCR כמותי בוצע על Roche LightCycler 480, עם טמפרטורות חישול מופחתות (48°C), הארכה (68°C) ורכישה (63°C) כדי לפצות על טמפרטורות ההיתוך הנמוכות של רבים מהלוקוסים הנבדקים. העשרה של קיפול חושבו כמתואר ב- [51], באמצעות ניק, אזור ב-ICEBs1 [52] שאינו קושר DnaA, לנורמליזציה. זוגות הפריימרים בשימוש מופיעים בטבלה S5.


סוגי תחומים מחייבי DNA

סליל-סיבוב-סליל

התגלה במקור בחיידקים, מוטיב הסליל-סיבוב-סליל נמצא בדרך כלל בחלבונים מדכאים ואורכו כ-20 חומצות אמינו. באאוקריוטים, ההומיאודומיין מורכב מ-2 סלילים, שאחד מהם מזהה את ה-DNA (המכונה גם סליל זיהוי). הם נפוצים בחלבונים המווסתים תהליכי התפתחות (PROSITE HTH).

אצבע אבץ

תחום אצבע האבץ הוא בדרך כלל באורך של בין 23 ל-28 חומצות אמינו והוא מיוצב על ידי תיאום יוני אבץ עם שאריות מתואמות אבץ במרווחים קבועים (היסטידינים או ציסטינים). המעמד הנפוץ ביותר של אצבע אבץ (Cys2His2) מתאם יון אבץ בודד ומורכב מסליל זיהוי וגיליון בטא דו-גדילי. [3] בגורמי שעתוק תחומים אלו נמצאים לרוב במערכים (בדרך כלל מופרדים על ידי רצפי קישור קצרים) ואצבעות סמוכות מרווחות ב-3 מרווחים של זוג בסיסים כשהן קשורות ל-DNA.

רוכסן לאוצין

התחום הבסיסי של רוכסן לאוצין (bZIP) מכיל סליל אלפא עם לאוצין כל חומצת אמינו 7. אם שני סלילים כאלה מוצאים זה את זה, הלאוצינים יכולים לקיים אינטראקציה כמו השיניים ברוכסן, מה שמאפשר דימריזציה של שני חלבונים. בעת קשירה ל-DNA, שאריות חומצות אמינו בסיסיות נקשרות לעמוד השדרה של סוכר-פוספט בעוד שהסלילים יושבים בחריצים העיקריים. זה מווסת את ביטוי הגנים.

סליל מכונף

המורכב מכ-110 חומצות אמינו, לתחום הסליל הכנף (WH) יש ארבעה סלילים וגיליון בטא דו-גדילי.

סליל מכונף סיבוב סליל

ה winged חאליקס טמֵיחָם חתחום elix (wHTH) SCOP 46785 הוא בדרך כלל באורך 85-90 חומצות אמינו. הוא נוצר על ידי צרור 3 סליל וגיליון בטא 4 גדילים (כנף).

הליקס-לולאה-הליקס

תחום Helix-loop-helix נמצא בחלק מגורמי שעתוק ומאופיין בשני סלילי α המחוברים בלולאה. סליל אחד הוא בדרך כלל קטן יותר ובשל הגמישות של הלולאה, מאפשר דימריזציה על ידי קיפול ואריזה כנגד סליל אחר. הסליל הגדול יותר מכיל בדרך כלל את האזורים הקושרים ל-DNA.

HMG-box

תחומי HMG-box נמצאים בחלבונים מקבוצת ניידות גבוהה המעורבים במגוון תהליכים תלויי DNA כמו שכפול ותעתוק. התחום מורכב משלושה סלילי אלפא המופרדים על ידי לולאות.

דומיין Wor3

תחומי Wor3, הנקראים על שם הרגולטור הלבן-אטום 3 (Wor3) בקנדידה אלביקנס הופיעו לאחרונה בזמן אבולוציוני מרוב התחומים קושרי ה-DNA שתוארו בעבר והם מוגבלים למספר קטן של פטריות [4]


הפניות

Wevrick, R. & Willard, H. F. ארגון ארוך טווח של מערכי טנדם של DNA לווייני אלפא בצנטרומרים של כרומוזומים אנושיים: פולימורפיזם של מערך באורך תדר גבוה ויציבות מיוטי. פרוק. Natl Acad. Sci. ארה"ב 86, 9394–9398 (1989).

Cleveland, D.W., Mao, Y. & Sullivan, K.F. Centromeres and kinetochores: מאפיגנטיקה לאיתות נקודת ביקורת מיטוטי. תָא 112, 407–421 (2003).

Willard, H. F. ארגון ספציפי לכרומוזומים של DNA לווייני אלפא אנושי. אמ. ג'יי המום. ג'נט. 37, 524–532 (1985).

Manuelidis, L. & Wu, J. C. הומולוגיה בין דנ"א חוזר ונשנה של אדם ופיים. טֶבַע 276, 92–94 (1978).

Earnshaw, W. C. & Rothfield, N. זיהוי של משפחה של חלבוני צנטרומרים אנושיים באמצעות סרה אוטואימונית מחולים עם סקלרודרמה. כרומוזומה 91, 313–321 (1985).

Palmer, D. K., O'Day, K., Wener, M. H., Andrews, B. S. & Margolis, R. L. חלבון צנטרומר 17-kD (CENP-A) מטהר יחד עם חלקיקי ליבת נוקלאוזומים ועם היסטונים. J. Cell Biol. 104, 805–815 (1987).

Bodor, D. L. et al. הארכיטקטורה הכמותית של כרומטין צנטרומרי. eLife 3, e02137 (2014).

נחמיה-ארבלי, י' ואח'. כרומטין צנטרומר CENP-A אנושי הוא נוקלאוזום הומוטיפי אוקטמרי בכל נקודות מחזור התא. J. Cell Biol. 216, 607–621 (2017).

Sullivan, B. A. & Karpen, G. H. Centromeric chromatin מציג דפוס שינוי היסטון הנבדל הן מאאוכרומטין והן מהטרוכרומטין. נאט. מבנה. מול. ביול. 11, 1076–1083 (2004).

Stimpson, K.M. & Sullivan, B.A. אפיגנומיקה של הרכבה ותפקוד הצנטרומרים. Curr. דעה. תא ביול. 22, 772–780 (2010).

Marshall, O.J., Chueh, A.C., Wong, L.H. & Choo, K.H. Neocentromeres: תובנות חדשות לגבי מבנה הצנטרומר, התפתחות מחלות והתפתחות קריוטיפ. אמ. ג'יי המום. ג'נט. 82, 261–282 (2008).

Fachinetti, D. et al. מנגנון דו-שלבי למפרט אפיגנטי של זהות ותפקוד הצנטרומרים. נאט. תא ביול. 15, 1056–1066 (2013).

Foltz, D. R. et al. קומפלקס CENP-A centromeric נוקלאוזום אנושי. נאט. תא ביול. 8, 458–469 (2006).

Okada, M. et al. קומפלקס CENP-H-I נדרש לשילוב יעיל של CENP-A חדש שסונתז בצנטרומרים. נאט. תא ביול. 8, 446–457 (2006).

הורי, ת' ועוד. CCAN יוצר מגעים מרובים עם DNA צנטרומרי כדי לספק מסלולים ברורים לקינטוכור החיצוני. תָא 135, 1039–1052 (2008).

Hori, T., Shang, W. H., Takeuchi, K. & Fukagawa, T. ה-CCAN מגייס את CENP-A לצנטרומר ומהווה את הליבה המבנית להרכבת קינטוכור. J. Cell Biol. 200, 45–60 (2013).

Padeganeh, A. et al. נוקלאוזומי CENP-A אוקטמריים נמצאים בצנטרומרים אנושיים לאורך כל מחזור התא. Curr. ביול. 23, 764–769 (2013).

Jansen, L. E., Black, B. E., Foltz, D. R. & Cleveland, D. W. ריבוי של כרומטין צנטרומרי דורש יציאה ממיטוזה. J. Cell Biol. 176, 795–805 (2007).

Nechemia-Arbely, Y., Fachinetti, D. & Cleveland, D. W. שכפול כרומטין צנטרומר: שליטה מרחבית וזמנית של מכלול CENP-A. Exp. Res Res. 318, 1353–1360 (2012).

Foltz, D. R. et al. הרכבה ספציפית לצנטרומר של נוקלאוזומים CENP-a מתווכת על ידי HJURP. תָא 137, 472–484 (2009).

Dunleavy, E.M. et al. HJURP הוא גורם תחזוקה ותלויי מחזור התא של CENP-A בצנטרומרים. תָא 137, 485–497 (2009).

Silva, M. C. et al. פעילות Cdk משלבת בין תורשה צנטרומרית אפיגנטית להתקדמות מחזור התא. Dev. תָא 22, 52–63 (2012).

Lacoste, N. et al. מיקום שגוי של וריאנט ההיסטון הצנטרומרי CenH3/CENP-A בתאים אנושיים תלוי במלווה DAXX. מול. תָא 53, 631–644 (2014).

Van Hooser, A. A. et al. מפרט של כרומטין יוצר קינטוכור על ידי וריאנט ההיסטון H3 CENP-A. J. Cell Sci. 114, 3529–3542 (2001).

Shrestha, R. L. וחב'. מיקום שגוי של וריאנט היסטון H3 centromeric CENP-A תורם לאי יציבות כרומוזומלית (CIN) בתאים אנושיים. Oncotarget 8, 46781–46800 (2017).

Filipescu, D. et al. תפקיד חיוני לגורמים צנטרומריים בעקבות אובדן p53 ושינוי אונקוגני. Genes Dev. 31, 463–480 (2017).

Mata, J. F., Lopes, T., Gardner, R. & Jansen, L. E. אסטרטגיה מהירה מבוססת FACS לבודד שיבוטים של נוק-אין ונוקאאוט של גנים אנושיים. PLoS ONE 7, e32646 (2012).

Landry, J. J. et al. הנוף הגנומי והטרנסקריפטומי של שורת תאים HeLa. G3 3, 1213–1224 (2013).

היידן, K.E. et al. רצפים הקשורים לכשירות הצנטרומר בגנום האנושי. מול. תָא. ביול. 33, 763–772 (2013).

Conde e Silva, N. et al. נוקלאוזומים המכילים CENP-A: פירוק קל יותר לעומת לוקליזציה צנטרומרית בלעדית. י.מול. ביול. 370, 555–573 (2007).

מיגה, ק"ח ואח'. מודלים ייחוס Centromere עבור כרומוזומים אנושיים X ו-Y מערכי לוויין. הגנום Res. 24, 697–707 (2014).

שניידר, V. A. et al. הערכה של מכלולי הגנום הפלואידיים GRCh38 ו-de novo מדגימה את האיכות המתמשכת של מכלול הייחוס. הגנום Res. 27, 849–864 (2017).

לוי, ש' ואח'. רצף הגנום הדיפלואידי של אדם בודד. PLoS Biol. 5, e254 (2007).

Zhang, Y. et al. ניתוח מבוסס מודל של ChIP-Seq (MACS). הגנום ביול. 9, R137 (2008).

Zang, C. et al. גישת אשכולות לזיהוי תחומים מועשרים מנתוני ChIP-Seq של שינוי היסטון. ביואינפורמטיקה 25, 1952–1958 (2009).

Maloney, K.A. וחב'. אפיאללים פונקציונליים בצנטרומר אנושי אנדוגני. פרוק. Natl Acad. Sci. ארה"ב 109, 13704–13709 (2012).

Ly, P. et al. אי-אקטיבציה סלקטיבית של צנטרומר Y מפעילה התנפצות כרומוזומים במיקרו-גרעינים ותיקון על ידי חיבור קצה לא הומולוגי. נאט. תא ביול. 19, 68–75 (2017).

Amor, D.J. & Choo, K.H. Neocentromeres: תפקיד במחלות אנושיות, אבולוציה וחקר הצנטרומרים. אמ. ג'יי המום. ג'נט. 71, 695–714 (2002).

חסון, ד' ואח'. האוקטמר הוא הצורה העיקרית של נוקלאוזומי CENP-A בצנטרומרים אנושיים. נאט. מבנה. מול. ביול. 20, 687–695 (2013).

אמור, D.J. וחב'. מיקומו מחדש של הצנטרומר האנושי "בעיצומו". פרוק. Natl Acad. Sci. ארה"ב 101, 6542–6547 (2004).

אלונסו, א' ועוד. לוקליזציה משותפת של CENP-C ו-CENP-H לתחומים לא רציפים של כרומטין CENP-A בניאוצנטרומרים אנושיים. הגנום ביול. 8, R148 (2007).

Li, H. et al. ביאור פונקציונלי של אזורי HOT בגנום האנושי: השלכות על מחלות אנושיות וסרטן. Sci. נציג. 5, 11633 (2015).

Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J. & van Oudenaarden, A. לוקוסים בעלי ביטוי גבוה פגיעים ללוקליזציה מטעה של ChIP של חלבונים מרובים שאינם קשורים. פרוק. Natl Acad. Sci. ארה"ב 110, 18602–18607 (2013).

Thakur, J. & Henikoff, S. וריאציות קונפורמציות בלתי צפויות של קומפלקס הכרומטין הצנטרומרי האנושי. Genes Dev. 32, 20–25 (2018).

Henikoff, J. G., Thakur, J., Kasinathan, S. & Henikoff, S. קומפלקס כרומטין ייחודי תופס מערכי אלפא-לוויין צעירים של צנטרומרים אנושיים. Sci. עו"ד 1, e1400234 (2015).

Hansen, R. S. et al. רצף DNA משוכפל חדש חושף פלסטיות נרחבת בתזמון השכפול האנושי. פרוק. Natl Acad. Sci. ארה"ב 107, 139–144 (2010).

בואי, מ' ועוד. מעברים מבניים תלויי מחזור תאים בנוקלאוזום CENP-A האנושי in vivo. תָא 150, 317–326 (2012).

Erliandri, I. et al. שכפול של מערכי DNA אלפא-לוויין באזורים צנטרומריים אנושיים אנדוגניים ובכרומוזום מלאכותי אנושי. Nucl. Acids Res. 42, 11502–11516 (2014).

Guse, A., Carroll, C. W., Moree, B., Fuller, C. J. & Straight, A. F. הרכבה של צנטרומרים ו-kinetochore במבחנה על תבניות כרומטין מוגדרות. טֶבַע 477, 354–358 (2011).

Carroll, C. W., Milks, K. J. & Straight, A. F. נדרשת הכרה כפולה של נוקלאוזומי CENP-A להרכבת צנטרומר. J. Cell Biol. 189, 1143–1155 (2010).

פטרוביץ', א' ואח'. מבנה המתחם MIS12 והבסיס המולקולרי של האינטראקציה שלו עם CENP-C בקינטוכורים אנושיים. תָא 167, 1028–1040 (2016).

Rago, F., Gascoigne, K. E. & Cheeseman, I. M. ארגון ורגולציה מובהקים של רשת הקינטוכור החיצונית KMN במורד הזרם של CENP-C ו-CENP-T. Curr. ביול. 25, 671–677 (2015).

Klare, K. et al. CENP-C הוא מתווה להרכבת רשתות הקשורות לצנטרומר בתוך קינטוכורים אנושיים. J. Cell Biol. 210, 11–22 (2015).

Weir, J.R. et al. תובנות מבנייה מחדש ביוכימית לתוך הארכיטקטורה של קינטוכורים אנושיים. טֶבַע 537, 249–253 (2016).

הופמן, ש' ואח'. CENP-A ניתנת לביצוע עבור תפקוד צנטרומר מיטוטי לאחר הרכבה ראשונית של צנטרומר/קינטוכור. נציג תא 17, 2394–2404 (2016).

Smith, S. & Stillman, B. הרכבה צעדית של כרומטין במהלך שכפול DNA במבחנה. EMBO J. 10, 971–980 (1991).

Verreault, A., Kaufman, P. D., Kobayashi, R. & Stillman, B. הרכבה של נוקלאוזום על ידי קומפלקס של CAF-1 והיסטונים אצטילטים H3/H4. תָא 87, 95–104 (1996).

חיישי, ת' ואח'. Mis16 ו-Mis18 נדרשים עבור טעינת CENP-A ודיאצטילציה של היסטון בצנטרומרים. תָא 118, 715–729 (2004).

Kaufman, P. D., Kobayashi, R., Kessler, N. & Stillman, B. יחידות המשנה p150 ו-p60 של גורם הרכבה כרומטין I: קשר מולקולרי בין היסטונים שסונתזו לאחרונה ושכפול DNA. תָא 81, 1105–1114 (1995).

Huang, H. et al. מצב כריכה ייחודי מאפשר ל-MCM2 לצ'פר היסטונים H3-H4 במזלגות שכפול. נאט. מבנה. מול. ביול. 22, 618–626 (2015).

Zhang, W. et al. ביטוי שגוי של גן Centromere ו-kinetochore מנבא הישרדות חולי סרטן ותגובה לטיפול בהקרנות וכימותרפיה. נאט. Commun. 7, 12619 (2016).

Sun, X. et al. ביטוי מוגבר של הגן המקודד חלבון centromere-A (CENP-A) כסמן ביולוגי פרוגנוסטי ומנבא בסרטן אנושי. Int. ג'י סרטן 139, 899–907 (2016).

Gascoigne, K. E. et al. הרכבת קינטוכור חוץ-רחמית מושרה עוקפת את הדרישה לנוקלאוזומי CENP-A. תָא 145, 410–422 (2011).

Zasadzinska, E. et al. תורשה של נוקלאוזומים CENP-A במהלך שכפול DNA מחייבת HJURP. Dev. תָא 47, 348–362 ה7 (2018).

Zhang, J., Kobert, K., Flouri, T. & Stamatakis, A. PEAR: מיזוג קריאה מהיר ומדויק של Illumina Paired-EndR. ביואינפורמטיקה 30, 614–620 (2014).

Li, H. & Durbin, R. יישור מהיר ומדויק לקריאה ארוכה עם טרנספורמציה של Burrows-Wheeler. ביואינפורמטיקה 26, 589–595 (2010).

Li, H. & Durbin, R. יישור קריאה קצר ומדויק עם שינוי Burrows-Wheeler. ביואינפורמטיקה 25, 1754–1760 (2009).

Quinlan, A. R. & Hall, I. M. BED Tools: חבילה גמישה של כלי עזר להשוואת תכונות גנומיות. ביואינפורמטיקה 26, 841–842 (2010).

Karolchik, D. et al. כלי אחזור הנתונים של דפדפן השולחן UCSC. Nucl. Acids Res. 32, D493–D496 (2004).

Wang, Z., Wu, C., Aslanian, A., Yates, J. R.III. & האנטר, T. RNA פולימראז III פגום מווסת לרעה על ידי מסלול SUMO-Ubiquitin-Cdc48. eLife 7, e35447 (2018).


חומרים ושיטות

תאים ופלסמידים

pBR322, p186, pאוס8, ועמ'אוס12 פלסמידים התפשטו ב אי קולי HB101, כפי שתואר קודם לכן (Frappier and Zannis-Hadjopoulos, 1987 Landry and Zannis-Hadjopoulos, 1991). אורס8 (מספר הצטרפות של GenBank M26221) פלסמיד תואר בעבר (Kaufmann et al., 1985 Zannis-Hadjopulos et al. 1985 ראו et al., 1990). p186 מורכב מה- Ndeאני-RsaI fragment (186 bp) של ors8 מוכנס לתוך נרואתר I של pBR322 (Todd et al., 1995). פלסמידים A3/4/pBR322 ו-pBR322 לינאאריים הושגו על ידי עיכול עם NruIאֶנזִים.

הכנת שברי DNA, אוליגונוקלאוטידים וסימון קצה

כדי להשיג את קטע 186-bp עבור ניסויים להזנת פס, עמ'אוספלסמיד 8 שימש כתבנית בתגובות PCR להגברה של אוס8 להכניס, אשר לאחר מכן עוכל עם Ndeאני ו Rsaאני, כפי שתואר קודם (Ruizet al., 1995). מקטע מתחרה לא ספציפי, pBRfg (206 bp), הוכן על ידי הגברה של PCR של pBR322 DNA, כפי שתואר קודם לכן (Ruiz et al., 1995). אוליגונוקלאוטידים המכילים את רצף A3/4 (36 נוקלאוטידים באורך 5'-CCTCAAATGGTCTCCAATTTTCCTTTGGCAAAATTCC-3') ומתחרה לא ספציפי שמקורו ב-pBR322 (16 נוקלאוטידים באורך 5'-TTCCAAATGGTCTCCAATTTTCCTTTGCAAAATTCC-3') ומתחרה לא ספציפי שמקורו ב-pBR322 (16 נוקלאוטידים באורך 5'-TTCCAAATGGTCTCCAATTTTCCTTTGGCAAAATTCC-3') ומתחרה לא ספציפי שמקורו ב-pBR322 (16 נוקלאוטידים באורך 5'-TTCCGAATACCGCAG, מרכז טכנולוגיות ביו-Synthetechnologized, McGill, מונטריאול, קנדה), טוהר עוד יותר על ידי דנטורציה של PAGE, וחלה כמתואר ב-Wall et al. (1988). 5′ end-labeling of the 186-bp fragment and A3/4 double-stranded oligonucleotide were performed as described previously (Ruiz et al., 1995).

Fractionation of HeLa Cell Extracts

HeLa S3 nuclei and cytosol (Cellex Biosciences, Minneapolis, MN) were used to prepare nuclear and cytosolic extracts as described previously (Pearson et al., 1991). Nuclear and cytosolic extracts were mixed (total cell extracts) and dialyzed against buffer A (26 mM HEPES, pH 7.8, 82 mM potassium acetate, 5.0 mM MgCl2, 2.5 mM EDTA, 1.0 mM DTT, 1.0 mM PMSF, 1.0 μM pepstatin A, 1.0 μM leupeptin, 10% glycerol). The chromatographic steps for the purification of OBA were performed essentially as described before (Ruiz et al., 1995), except that a Sephacryl S-300 (Pharmacia AB Laboratory Separation Division, Uppsala, Sweden) step replaced the 10–40% glycerol gradient and an affinity-purification step was added at the end. Briefly, total cell extracts were applied to a DEAE Sephadex A-50 column previously equilibrated in buffer A. The flowthrough (FT) was collected, and the bound protein was eluted with a linear salt gradient of potassium acetate (0.082–1.0 M) in buffer A. The fractions collected from the elution gradient were pooled into four different pools (A, B, C, and D) on the basis of their salt concentration. Pool B was then dialyzed against buffer B (0.01 M KHPO4, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 2.5 mM EDTA, 1.0 mM DTT, 1.0 mM PMSF, 1.0 μM pepstatin A, 1.0 μM leupeptin, 10% glycerol) and loaded onto an Affi-Gel Heparin column (Bio-Rad, Hercules, CA). The FT was collected, and the proteins bound to the matrix were eluted with a linear salt gradient of NaCl (0.15–1.0 M) in buffer B. The fractions were monitored for OBA activity by band-shift analyses, and those that were positive (300 mM NaCl) were concentrated, dialyzed, and labeled as pool E. Pool E was subsequently loaded onto a Sephacryl S-300 column in buffer B, and fractions were collected and monitored for OBA activity as above. The OBA-positive fractions were pooled (pool F), concentrated, and loaded onto an A3/4 DNA affinity column (see below), equilibrated with buffer B. The FT was recovered, and the protein bound to the matrix was eluted with a linear salt gradient of NaCl (0.15–1 M) in buffer B. OBA-positive fractions were pooled (apOBA), concentrated, dialyzed against buffer B, and frozen in aliquots at −70°C.

DNA Affinity Column

Oligonucleotides complementary (antisense) to the A3/4 sequence oligonucleotide (sense see above) were synthesized, and 5′ directional overhangs (5′-GATC) were added, yielding a 40-mer oligonucleotide (Sheldon Biotechnology Center, McGill University). The oligonucleotides were further purified by denaturing PAGE. Equal amounts (220 μg) of antisense and sense oligonucleotides were mixed, annealed, phosphorylated, and ligated, as described previously (Kadonaga and Tjian, 1986). The multimers were then coupled to 10 ml of Sepharose CL-2B (Pharmacia Biotech) freshly activated by cyanogen bromide (Kadonaga and Tjian, 1986).

Gel Mobility-Shift Assays and Competition Experiments

Gel mobility-shift (band-shift) assays were typically performed as described previously (Ruiz et al., 1995) in 20 μl volume, by incubating 0.1 ng (0.81 fmol) of end-labeled 186-bp fragment or 0.5 ng (21 fmol), or other indicated amount, of double-stranded, end-labeled oligonucleotide containing the A3/4 sequence, with 200 ng of protein from pool F (Sephacryl S-300). Reactions were performed in binding buffer (10 mM Tris-HCL, pH 7.5, 80 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.1% Triton X-100, 4% glycerol) in the presence of 1 μg of double-stranded (ds) poly (dI-dC) (Amersham Pharmacia, Baie d’Urfé, Québec, Canada), used as nonspecific competitor. After incubation on ice for 30 min, the reaction mixture was analyzed by 4% PAGE the gel was then dried and exposed for autoradiography. For band-shift competition experiments, a constant amount (0.1 ng) of radioactively labeled 186-bp fragment was mixed with increasing molar excess amounts of either the 186-bp fragment or various subfragments (75, 69, 59, and 42 bp, respectively) generated from it, as well as the A3/4 oligonucleotide, used as cold competitors. pBRfg (see above) was also used as nonspecific competitor. A constant amount of protein (200 ng) from pool F (Sephacryl S-300) was then added to the mixture, and the reaction was left to proceed as described above. The shifted complexes were quantitated by densitometry performed using a Phosphoimager (Fuji BAS 2000 Fuji Medical Systems, Stamford, CT), and the results were expressed as percentage reduction in complex formation with increasing amounts of competitor. In competition reactions using the A3/4 oligonucleotide as probe, increasing molar amounts of either the double- or single-stranded A3/4 oligonucleotides were used as cold competitors. Competition reactions were also performed using either supercoiled or linearized plasmid containing the A3/4 sequence (A3/4/pBR322), or the vector (pBR322) alone 260 ng of affinity-purified OBA (apOBA) were incubated for 1 h with 50 and 500× molar excess amounts of either the supercoiled or the linearized plasmid, relative to the radioactive A3/4 sequence (0.25 ng 10.5 fmol), which was added last, and the reaction was left to proceed as described above.

When the mobility-shift assays were followed by Western blotting analyses, the reactions were performed using 0.25 ng/reaction of the probe and increasing amounts of apOBA (100, 250, and 350 ng, respectively), using the conditions described above. Half of the reactions were performed using radioactively labeled DNA, and the other half were performed using cold A3/4 as probe. A control reaction was also carried out in the absence of DNA. The reactions were analyzed using the mini-protean II slab cell electrophoresis system (Bio-Rad, Richmond, CA). After electrophoresis (free probe was run out of the gel), and the radioactive part of the gel was dried and exposed for autoradiography, whereas the equivalent “cold” part of the gel was prepared for Western blotting as described below.

In Vitro DNA Replication

In vitro replication reactions were performed as described previously (Pearson et al., 1991), with modifications according to Matheos et al. (1998). In the experiments involving the addition of the A3/4 oligonucleotide competitor, increasing molar excess amounts (relative to the input 200 ng p186 or pors12 template DNA) of either the A3/4 or the nonspecific oligonucleotide (see above) were preincubated with the HeLa cell extracts on ice for 20 min.

Experiments involving the addition of the anti-Ku antibodies were performed in a similar manner as described previously (Lin et al., 1997). Anti-Ku70 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA sc-1486) and anti-Ku86 (Santa Cruz sc-1484) antibodies, 3.5, 7.0, and 14.0 μg of a 1.5 mg/ml antibody stock, concentrated using Microcon-10 microconcentrators (Amicon, Beverly, MA), were preincubated, respectively, with the HeLa cell extracts, on ice for 20 min. A goat IgG antibody (Sigma, St. Louis, MO) was used as a control.

The antibodies were neutralized as recommended by the manufacturer by reacting 14.0 μg of either the anti-Ku70 or anti-Ku86 antibody with a sevenfold (by weight) excess of the Ku70 (Santa Cruz sc-1486P) or the Ku86 (Santa Cruz sc-1484P) blocking peptides or with a mixture of GATA-1 (Santa Cruz sc-1233P), GATA-2 (Santa Cruz sc-1235P), and DNA-PK (Santa Cruz sc-1552P) blocking peptides, the latter three serving as nonspecific blocking peptides. The incubations were carried out overnight at 4°C. Subsequently, the neutralized antibodies were preincubated with the extracts and finally added to the in vitro replication reaction, performed as described above.

The in vitro replication products were divided into three aliquots: one-third was digested with 1 U of DpnI (New England Biolabs, Beverly, MA) for 60 min at 37°C, as described previously (Matheos et al., 1998). ה DpnI-digested and one-third of the undigested products were subjected to electrophoresis on 1% agarose gel in 1× Tris-acetate (0.04 M Tris-acetate, 0.001 M EDTA) buffer (16–20 h, 50–55 V). The gels were dried and exposed to Kodak X-Omat Blue XB-1 autoradiographic film (Eastman Kodak, Rochester, NY). Quantification was performed by densitometric measurements of theDpnI-digested products, as described previously (Diaz-Perezet al., 1996 Matheos et al., 1998), using a phosphoimager analyzer (Fuji BAS 2000). The amount of radioactive precursor incorporated into the DNA was expressed as a percentage of the control p186 reaction (100%).

Band-Shift Elution of OBA–A3/4 Complexes Followed by Southwestern Analysis

Ten band-shift reactions were performed with radioactively labeled A3/4 DNA (10 ng/reaction) and 3.75 μg/reaction of protein from pool F (from the Sephacryl-S300 column see MATERIALS AND METHODS), using the conditions described above. As a control, similar reactions were performed in the absence of DNA. The band-shifts were analyzed by electrophoresis in a native 4% polyacrylamide gel, and the wet gel was exposed for 5 h at 4°C for autoradiography. The OBA–DNA complexes were then excised from the gel, and the proteins and the DNA were eluted from the gel by isotachophoresis (Ofverstedt et al., 1984) and then subjected to electrophoresis on 8% SDS-polyacrylamide gel under reducing conditions. The proteins were then transferred electrically to an Immobilon-P membrane (Millipore, Bedford, MA) and subjected to Southwestern analysis, following the protocol described in Philippe (1994), with some modifications. Briefly, the membrane was incubated overnight (14–16 h) in blocking solution (buffer S: 25 mM HEPES-KOH, pH 7.7, 25 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 1 mM DTT, containing 5% skim milk and 0.05% NP-40). The next day the membrane was subjected to a process of denaturation–renaturation, as follows: it was incubated for 10 min in a denaturing solution of 6 M guanidine hydrochloride in buffer S, followed by 10 min incubations in 3, 1.5, 0.75, 0.375, and 0.187 M guanidine hydrochloride, respectively, diluted in buffer S it was then washed twice for 10 min with buffer S, and incubated for 2 h in blocking buffer, followed by 1 h incubation in buffer S + 1% skim milk. The membrane was then incubated overnight in hybridization solution (20 mM HEPES, pH 7.7, 75 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 2.5 mM MgCl2, 1% skim milk, 0.05% NP-40) containing radioactively labeled A3/4 oligonucleotide (5.2 ng/ml, 2.6 × 10 6 cpm/ml) in the presence of poly (dI-dC) (50 μg/ml) and pBRfg DNA (454 ng/ml) as nonspecific competitors. Finally, the membrane was washed three times with hybridization solution and subsequently exposed for autoradiography. The entire procedure was carried out at 4°C, and the incubations were performed on a rocking platform.

Western Blotting Experiments and SDS-PAGE

Denaturing PAGE was performed as described previously (Laemmli, 1970) using the mini-protean II slab cell electrophoresis system (Bio-Rad). Western blot analysis was performed essentially as previously described (Burnette, 1981), using the ECL detection kit (Amersham, Arlington Heights, IL). All of the antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology. For immunodetection of Ku autoantigen subunits (Ku86 and Ku70), 10 and 20 μg of total cell extracts (NC) and 1 and 3 μg of affinity-purified OBA were subjected to electrophoresis on 8% SDS-PAGE and electrically transferred to Immobilon-P (Millipore). The membrane was first probed with anti-Ku86 (C-20) antibody (1 μg/ml) it was then stripped and reprobed with anti-Ku70 (C-19) antibody (2 μg/ml) using the ECL detection kit protocol. For DNA-PK catalytic subunit (DNA-PKcs) detection, 20 and 40 μg of total cell extracts (NC), and 3 and 6 μg of affinity-purified OBA were run on a 6% SDS-PAGE and transferred onto Immobilon-P membrane (Millipore), as described above. The membrane was then probed with anti–DNA-PKcs (C-19) antibody (4 μg/ml). An anti-goat IgG–horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (1:2000) was used in the immunoblots. A similar procedure was used for the Western analysis performed on the membranes that had been previously used for Southwestern or band-shift analyses. Visualization of the proteins in the gels was performed using the Rapid Silver Staining Kit (Sigma).

Microsequencing Analysis of OBA

Protein concentration was determined by the method of Bradford (Bradford, 1976) and the Nucleic Acid Soft-Pack module from a DU-65 Spectrophotometer (Beckman, Mississauga, Ontario, Canada). Twenty-nine micrograms of affinity-purified OBA fraction were subjected to electrophoresis on an 8% SDS-PAGE under reducing conditions. Proteins were blotted onto a Problott membrane (Applied Biosystems, Foster City, CA) and visualized by staining with Ponceau S (Sigma) (0.2% wt/vol in 1% vol/vol acetic acid). The excess of dye was washed off with 1% acetic acid, and a protein band estimated to be ∼92 kDa was subsequently excised from the membrane and sent for internal sequencing analysis (Harvard Microchemistry Facility, Cambridge, MA).


When a eukaryotic cell divides it must replicate its DNA, and the process of replication starts at hundreds or thousands of separate sites called origins of replication. The first step in replication, which is known as origin licensing, involves the recruitment of a ring-shaped helicase enzyme called MCM2-7 such that it encircles each origin of replication. The fact that this enzyme and three other proteins required for origin licensing – the origin recognition complex, CDC6 and CDT1 – are conserved throughout eukaryotic evolution confirms the central importance of origin licensing (Makarova and Koonin, 2013).

It is thought that the origin recognition complex, which consists of six proteins called ORC1-ORC6, performs two roles during origin licensing (O'Donnell et al., 2013). First, by binding to DNA and histone proteins, it selects the sites where origin licensing takes place. Second, in conjunction with CDC6, it recruits the MCM2-7 helicase (which is bound to a CDT1 protein) to each origin of replication. Structural studies indicate that CDC6 binds to the origin recognition complex to form a six-subunit protein ring (made up of CDC6 and ORC1-ORC5) around the DNA at the origin of replication (Figure 1A Bleichert et al., 2015 Sun et al., 2013). This ring then binds to the MCM2-7 helicase such that the latter encircles the DNA adjacent to the origin of replication (Sun et al., 2013). Subsequent events activate MCM2-7, allowing it to separate the DNA strands so that they can be copied (Bell and Labib, 2016).

Models showing the roles of the origin recognition complex (ORC) during origin licensing.

(א) In eukaryotic cells under normal conditions origin licensing starts with the ORC1-ORC5 subunits of ORC partially encircling the origin of replication. CDC6 (dark gray) then binds to ORC1 (red) and ORC2 (green) to complete a protein ring around the DNA. The ORC-CDC6 complex interacts with a ring-shaped MCM2-7 helicase (light gray) such that the helicase (which is bound to the CDT1 protein black) encircles the adjacent DNA. (ב) A model for origin licensing by an origin recognition complex that lacks ORC1 or ORC2. This partial ORC still binds to DNA, and CDC6 binds to either ORC1 or ORC2 to form a five-subunit partial ring around the DNA. This new complex retains the ability to recruit MCM2-7 and CDT1. (ג) A model for how origin licensing could occur in the absence of the origin recognition complex. CDC6 either directly (left) or indirectly (by binding a different DNA-bound protein right) binds to DNA and recruits MCM2-7 and CDT1 to the origin of replication.

Given the importance of origin licensing it is not surprising that deleting any of the ORC genes is lethal to yeast cells and fruit flies, and depletion of ORC prevents DNA replication in frog egg extracts (Li and Stillman, 2012). Now, in eLife, Anindya Dutta and colleagues at the University of Virginia School of Medicine – including Etsuko Shibata as first author – report that human cells with loss-of-function mutations in the genes for ORC1 or ORC2 are viable (Shibata et al., 2016). This is a surprising observation given the importance of these genes in other organisms.

Although the cells with a mutant form of the ORC1 or ORC2 gene have phenotypes that are consistent with replication defects, the impact on cell division is limited. Regardless of which gene was mutated, the resulting cells maintained a proliferation rate of half that seen in normal cells and no difference was seen in the time they spent replicating the DNA. Mapping the origins of replication showed that the mutant cells had approximately half as many of these sites as normal cells. Consistent with the previously defined roles of the origin recognition complex, the amount of DNA-associated MCM2-7 was reduced in both mutant cell lines, and the origins of replication only partially overlapped.

How can cells live when they lack a subunit of the origin recognition complex? One possibility is that the mutant alleles do not completely eliminate the subunit targeted by the mutation. Although no residual ORC1 or ORC2 proteins were detected, Shibata et al. estimate that up to 1% of the proteins could still have been present in the cells. If residual ORC1 or ORC2 explains the viability of the mutant cells, each remaining origin recognition complex would have to load more than 35 helicases over 3.5 million DNA base pairs. Furthermore, although a lower abundance is consistent with the reduced number of origins of replication observed in the mutant cells, it does not explain why 60% of these sites are at new locations.

Alternatively, a partial origin recognition complex could be sufficient for origin licensing. In this regard, it is noteworthy that ORC1 and ORC2 are at either end of the five ORC subunits that form a ring around the DNA and each has a binding site for CDC6 (Figure 1A Sun et al., 2013). The loss of either of these subunits would leave a complex containing just four subunits but, crucially, each of these partial complexes would retain the ability to bind to CDC6. Therefore, it is possible that an origin recognition complex that lacks ORC1 or ORC2 could still form a ring (from four ORC subunits and CDC6) that retains the ability to bind strongly to DNA, CDC6 and MCM2-7 (Figure 1B).

Several observations are consistent with the possibility that such a partial complex can perform origin licensing. Mutations that reduced the production of ORC5 or CDC6 decreased DNA synthesis in ORC1 or ORC2 mutants, which indicates that both ORC5 and CDC6 are still involved in DNA replication in the absence of ORC1 or ORC2. In contrast to ORC1 and ORC2, Shibata et al. were unable to obtain viable mutations that prevented the production of the ORC4 or ORC5 proteins. These mutations would break the ring into multiple segments and the inability to obtain these mutants suggests that smaller ORC sub-complexes are non-functional. Finally, a partial origin recognition complex would be expected to have similar but not identical DNA binding properties to the full complex, and so is consistent with the partial overlap in the locations of the origins of replication seen between mutant and non-mutant cells.

It is also possible that the entire origin recognition complex is dispensable. If so, then another origin licensing mechanism must occur that still involves CDC6. For example, one or more CDC6 proteins could directly or indirectly bind to DNA to recruit MCM2-7 (Figure 1C). Although there is no evidence that CDC6 intrinsically binds to DNA, there is evidence that tethering CDC6 to DNA is sufficient to cause the adjacent DNA to be replicated (Takeda et al., 2005), raising the possibility that other proteins could recruit CDC6. In addition, mutant cells that lacked ORC1 adapted to grow more rapidly over time, possibly reflecting the emergence of mutations that promote an alternative mechanism of origin licensing.

Future studies will be required to distinguish between these possibilities. For example, it will be important to determine if it is possible to simultaneously mutate ORC1 and ORC2 in viable cells. If so, this finding would support an ORC-independent model for CDC6 recruitment and origin licensing as the remaining ORC subunits would lack CDC6 binding sites. If not, then a model in which a partial origin recognition complex can perform origin licensing would be more likely. Regardless of the eventual mechanism, these studies reveal a resilience of the human DNA replication machinery to mutation that could facilitate growth as cells mutate during cancerous transformation.


צפו בסרטון: DNA Replication - Leading Strand vs Lagging Strand u0026 Okazaki Fragments (נוֹבֶמבֶּר 2022).