מֵידָע

מדוע להשתמש ב-DNA פולימראז בייצור cDNA?

מדוע להשתמש ב-DNA פולימראז בייצור cDNA?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

RT מסוגל לסנתז גדיל DNA משלים (כמו במחזור החיים של HIV.) אז מדוע נעשה שימוש ב-DNA pol כאשר יש לסנתז cDNA (מסינתזה של הגדיל השני שלו) מ-mRNA (למשל כדי לבנות ספריית cDNA)?


תעתיק הפוך, כפי שהשם מרמז, משתמש בתבנית RNA כדי ליצור תמליל DNA (כלומר, משלים). לאחר יצירת משלים ה-DNA, נעשה שימוש ב-DNA פולימראז מכיוון שהוא משתמש בתבנית DNA כדי לייצר גדיל DNA משלים.

בדוגמה הספציפית שלך, HIV מכיל גנום RNA בעל גדילים חיוביים. ה-HIV RT יכול להשתמש בתבניות RNA או DNA כדי לייצר משלים של DNA, וכך מתעתיק גנום ה-RNA החד-גדילי ל-DNA דו-גדילי, לפני האינטגרציה.

למיטב ידיעתי, אנזימי ה-RT הנמכרים באופן מסחרי (עבור יישומים כמו RT-PCR) הם בדרך כלל תערובת של אנזים RT ופולימראז של DNA, המבודדים מרטרו-וירוסים אחרים, כגון וירוס לוקמיה של עכברים. שיקול חשוב ליישום במעבדה הוא ייצור cDNA המייצג באמת את תבנית ה-RNA המעניינות. מאחר ואנזימי RT בדרך כלל חסרים פעילות אקסונוקלאז 3'->5', הם אינם מסוגלים "לקרוא" את גדיל המשלים בזמן שהוא מיוצר. לעומת זאת, ישנם פולימראז DNA להגהה יעילה מאוד, וזו הסיבה ש-DNA פולימראז (עם יכולת קריאת הגהה גבוהה) משמש לאחר סינתזת גדיל ראשון על ידי RT.


CDNA - (10/04/2008)

כאשר נבנה cDNA ב-RNA הוא uracel, האם uracel זה גם מתחבר ל- "A" או לא,
לאורצל יש יכולת ליצור קשר כפול עם נוקלאוטיד A או לא.
RNAse H זה יבקע את ה-RNA בעל הגדילים הבודדים בגלל זיהוי ה-uracel שלו

למה גרעיני ה-DNA הזה פשוט בקע את לולאת סיכת השיער.

אני לא יודע אם זה עוזר 'כי הפוסט שלך קצת בלבל אותי.

cDNA הוא גדילי יחיד, בדיוק כמו RNA. אתה צריך להשתמש ב-DNA פולימראז כדי להפוך אותו כפול גדיל אז אני לא מבין מהי בעיית הזיווג.

האם תוכל לפרט את הבעיה שלך?

אני לא כל כך מבין מה השאלה שלך.

בעת יצירת cDNA, למרות שאנו תמיד משתמשים ב- 'A', 'T', 'C', 'G', ולכן לא אמורים להיות 'U' ב-cDNA.

כן אם RNA יוצר גדיל כפול ומתחבר יחד, 'U' הוא זוג עם 'A', זוג U-A נוצר על ידי קשר מימן (כן 2 מהם).

כפי שהבנתי, אף RNase לא יכול לגעת ב-RNA כפול גדיל (התאמה מושלמת ללא כדור או לולאה).
לכן, כאשר נוצרת סיכת שיער במבנה משני של RNA, רק לולאת גדיל בודד ייאכל על ידי RNase אך לא גזע כפול.

זה מה שאני זוכר, ומקווה שזה יעזור

כאשר אתה משיג cDNA הוא כפול גדילי, לא חד גדילי (ה- "c" מייצג משלים). אתה משתמש ב-mRNA כדי לקבל cDNA. in vivo קשרי אורציל עם אדנין (RNA אינו משתמש בתימין). אם אני לא טועה אתה משתמש בערכת cDNA שמספקת RNAse H, הרעיון להשתמש בו הוא להיפטר מכל רנ"א לאחר שסינתזת את ה-cDNA, לא להרוס את ה-RNA התבנית שלך.

כלומר כאשר ה-cDNA שלך מוכן והוא מוכן מראש מה-RNA התבנית,
cDNA הוא בגדיל הראשון וכעת הוא מחובר עם RNA התבנית, RNA תבנית זה מושפל על ידי RNAse H בגלל זהות האוראצל שלו.
כעת עליך ליצור גדיל שני של ה-cDNA.
קצה ה-cDNA יוצר מבנה לולאת סיכת שיער בגלל פרימה עצמית ואתה יכול להשתמש ב-DNA פולימראז כדי ליצור את ה-DNA השני,
לאחר יצירת הגדיל השני הזה אתה יכול להרוס את לולאת הגבעול בקצה של גדילים כפולים על ידי DNAse, האם אני צודק

ב-RNA יהיה uracel וניתן לזהות אותו על ידי ה-RNAse H וכך הוא יבקע את תבנית ה-RNA ואני חושב ש-Hair Pin lool מושפל על ידי נוקלאז DNA גדיל אחד

כלומר כאשר ה-cDNA שלך מוכן והוא מוכן מראש מה-RNA התבנית,
cDNA הוא בגדיל הראשון וכעת הוא מחובר עם RNA התבנית, RNA תבנית זה מושפל על ידי RNAse H בגלל זהות האוראצל שלו.
כעת עליך ליצור גדיל שני של ה-cDNA.
קצה ה-cDNA ליצור מבנה של לולאת סיכת שיער בגלל פרימה עצמית ואתה יכול להשתמש ב-DNA פולימראז כדי ליצור את ה-DNA השני,
לאחר יצירת הגדיל השני הזה אתה יכול להרוס את לולאת הגבעול בקצה של גדילים כפולים על ידי DNAse, האם אני צודק

לא הבהרתי את עצמי בפעם הקודמת. כשאמרתי ש-cDNA הוא גדילי יחיד התכוונתי שאתה מסנתז cDNA של גדיל ראשון. אם אתה רוצה לעשות cDNA של גדיל שני, עליך להסיר את תבנית ה-RNA באמצעות RNase, ליצור מולקולת cDNA גדילית אחת, ולאחר מכן לייצר את הגדיל השני באמצעות פולימראז של DNA. האם הבהרתי את עצמי עכשיו?


א בניית cDNA

mRNA הוא רק כמה אחוזים מתא אוקריוטי רובו הוא rRNA. אבל כמות קטנה זו של mRNA ניתנת להפרדה מ-RNA תאיים אחרים בזכות 3&rsquo poly(A) זנבותיהם. כל שעליך לעשות הוא להעביר תמצית RNA כוללת על פני עמודה oligo-d(T). (מתואר להלן).

מיתרי התימידין (T) יכולים להיקשר H עם זנבות הפולי(A) של mRNA, ולקשור אותם לעמוד. כל RNAs ללא זנב 3&rsquo poly(A) יזרמו דרך העמודה כפסולת. חוצץ שני מועבר על העמוד כדי לערער את היציבות של קשרי A-T H כדי לאפשר פליטה של שבריר mRNA. כאשר ה-free&rsquo oligo d(T) מתווסף ל-mRNA הנפלט, הוא יוצר קשרי H עם זנבות ה-poly(A) של ה-mRNAs, המשמשים כפריימר לסינתזה של עותקי cDNA של ה-poly(A) mRNA במקור תאים. לבסוף, ארבעה מבשרי DNA של deoxynucleotide ו טרנסקריפטאז הפוך (מבודד במקור מתאי רטרו-וירוס עוף) מתווספים כדי להתחיל שעתוק הפוך. הסינתזה של גדיל cDNA משלים ל-mRNA מוצגת להלן.

לאחר חימום כדי להפריד את ה-cDNA מה-mRNA, ה-cDNA משוכפל לייצור דו-גדילי, או (ds)cDNA, כפי שמוצג להלן.

סינתזה של גדיל cDNA השני מזורזת גם על ידי תעתיק הפוך! האנזים מזהה DNA כמו גם תבניות RNA, ויש לו את אותה פעילות פילמור DNA של 5&rsquo-to-3&rsquo כמו פולימראזות DNA. לאחר סינתזת גדיל cDNA 2, נוקלאז S1אנדונוקלאז חד-גדילי מבודד במקור מפטרייה במזרח אסיה!) מתווסף כדי לפתוח את הלולאה של מבנה ה-cDNA (ds) ולחתוך את שאר ה-DNA החד-גדילי. מה שנשאר זה (ds) cDNA.


מהו cDNA

ה-cDNA (DNA משלים) מתייחס ל-DNA החד-גדילי המופק מתעתיק הפוך של תבניות RNA שליח. שעתוק הפוך מזורז על ידי האנזים, תעתיק הפוך. cDNA מיוצר גם ברטרו-וירוסים במהלך ההמרה של גנום ה-RNA ל-DNA. cDNA משמש בעיקר בשיבוט גנים אוקריוטיים בפרוקריוטים. גנים אוקריוטיים מכילים אינטרונים בין האקסונים, המקודדים לחלבונים. במהלך שעתוק, גם אינטרונים וגם אקסונים מקודדים ל-RNA שליח (mRNA). אבל, האינטרונים מוסרים מ-mRNA כדי לייצר mRNA בוגר על ידי שחבור האקסונים יחד. ה-mRNA הכולל של אורגניזם נקרא תעתיק. ניתן להשתמש ב-mRNA זה לייצור cDNA, המכיל רק את אזורי קידוד החלבון של הגנום.

איור 2: שעתוק הפוך ו-PCR

הסינתזה של cDNA מ-DNA מפחיתה את מספר זוגות הבסיסים שיש לטפל בהם במהלך ניסוי. לאחר מכן משובטים cDNA זה לוקטורים, שיכולים לשאת DNA זר לאורגניזמים פרוקריוטיים או אוקריוטיים אחרים. חיידקים, כמו גם הפטריות החד-תאיות, עוברים טרנספורמציה עם גנים אוקריוטיים. תעתיק הפוך יחד עם PCR מוצג ב איור 2.


פונקציית DNA פולימראז

ל-DNA פולימראז תפקידים משתנים במנגנוני סינתזה, תיקון ושכפול של DNA. DNA פולימראז מסווג לשבע משפחות שונות באאוקריוטים, וירוסים, שמרים וחיידקים. שבע המשפחות הללו הן A, B, C, D, X, Y, ותעתיק הפוך (RT). מחקר עתידי עשוי לגלות קבוצות נוספות.

כל אחת מהמשפחות הללו מכילה תת-קבוצה של פולימראזות DNA שיש להן מגוון פונקציות משלהן. לדוגמה, DNA פולימראז I הוא חבר במשפחת A DNA פולימראז IV או DinB הוא חבר במשפחת X. לא תצטרך לשנן כל שם, אבל התפקוד הבסיסי לכל קבוצה גם יעזור לך להבין טוב יותר את סינתזת החלבון, מוטציה בגנים ושינוי גנים.

המבנה של DNA פולימראז דומה ליד ימין עם כף יד, אצבעות ואגודל. אתה יכול לדמיין גדיל של DNA נע דרך מולקולת DNA פולימראז כמו הסרט דרך מכונת כתיבה. במילים פשוטות מאוד, האצבעות עוזרות למקם בזהירות את גדיל ה-DNA שנפתח על ידי זיהוי הנוקלאוטידים, כף היד היא האתר הפעיל שבו מתרחשת זרחון (הוספת עמוד השדרה של הפוספט), והאגודל קושר את ה-DNA לצורת סליל כפול כשהוא יוצא מולקולת ה-DNA פולימראז. אבל לא לכל משפחות ה-DNA פולימראז יש את אותם מרכיבים מבניים. בואו נסתכל על המשפחות השונות בפירוט קטן יותר.

משפחת פולימראז א

משפחה A היא קבוצה של אנזימי שכפול DNA או תיקון DNA. בשכפול DNA, הם מתאימים בסיס נוקלאוטיד לבן הזוג הנכון. זה נחוץ בכל פעם שתא מתכונן להתחלק, והכרומוזום החד-גדילי משוכפל כך שלשני התאים, האם והבת, יש סט מלא של DNA.

Pol y הוא פולימראז ה-DNA היחיד שיכול לשכפל DNA מיטוכונדריאלי (ורק פולימראזות DNA ממשפחת X מבצעות תיקון mtDNA).

פול תטה (DNA פולימראז תטא) מתקן שברי גדילים כפולים בתוך ה-DNA על ידי חיבור מחדש של הקצוות השבורים. נזק לגן המקודד לייצור פול תטא (θ) פירושו שהפסקות מתחילות להיערם מבלי להתוקן, אולם, חיבור קצה בתיווך תטא (TMEJ) מגדיל את הסיכון למוטציה בהשוואה למנגנוני תיקון DNA אחרים. בגלל זה, גנים פגומים של Pol θ נקשרו לצורות רבות של סרטן.

בגלל מחקרים כאלה על מחלות ו-DNA, פולימראזות DNA של משפחה A עזרו לנו להבין ולטפל בצורות שונות של סרטן. דוגמה נוספת של משפחת A היא Pol nu שעוזר לשחרר קישורים צולבים בין גדילים (ICL). מהו קישור צולב בין גדילים? שמעת פעם על גז חרדל, ששימש במלחמת העולם השנייה? נשימה של גז זה בכמויות גדולות עלולה להרוג, אבל אלפי חיילים שרדו חשיפה. ככל שחלף הזמן, הרופאים גילו שלגברים האמיצים הללו יש סיכוי גבוה יותר למות מסרטן מערכת הנשימה מאשר אנשים שמעולם לא נחשפו לגז חרדל. הגז חדר לריאות והגיב ישירות עם ה-DNA של תאי הריאה, קושר יחד גדיל נוקלאוטיד אחד לנוקלאוטידים מנוגדים שהיו לֹא השותפים שלהם (אלכסונים או צולבים). הקשרים הנוספים הללו הקשו על פתיחת ה-DNA לפני השכפול, וכאשר שכפול אכן התרחש, נעשו טעויות בהעתקת הקוד. טעויות אלו התרבו עם הזמן, וגרמו לתקלות DNA רבות שהועתקו וגרמו למוטציות בגנים. מוטציות אלו הובילו לייצור תאים פגומים או סרטן. במקרה של גז חרדל, זה היה סרטן ריאות.

Pol nu (POLν) מיוצר במיוחד כדי לנסות לפתור את החיבורים הבין-גדילים המזיקים מאוד. זה לא מיוצר בכמויות גדולות ונראה שהוא יותר אנזים גיבוי, אבל יכול להיות שיש בו יותר מזה. למרות שהתגלו רק בשנת 2003, פולימראזות DNA פחות מוכרות כמו Pol nu זוכות לתשומת לב רבה. אחת הסיבות היא שכ-50% מתאי סרטן השד מראים אזורים שנמחקו במיקום ציטוגני (מיקום) 4p16.2 – שזה כרומוזום 4, זרוע קצרה (p), אזור 16, פס 2). בתמונה למטה, זה המיקום הכי משמאל. חשוב גם לציין שזה בדיוק המקום שבו נמצא הגן לסינתזה של פול נו.

פונקציית משפחת פולימראז B

אנזימים ממשפחת DNA פולימראז B חשובים במהלך תהליך חלוקת התא. הם בודקים DNA משוכפל ומסונתז לאחרונה. המשפחה כוללת גם פולימראזות פרוקריוטות וגם אוקריוטיות.

פול אלפא (אות יוונית, כלומר פולימראז אוקריוטי) מפעיל את תהליך שכפול ה-DNA ומתקשר אזורי נזק לפולימראזות DNA אחרות ממשפחת B כגון Pol delta ו-Pol epsilon. מכיוון שתקלות אלו מתוקנות מיד, יש סיכוי גבוה יותר שהן יצליחו והסיכון לתיקון חוסר התאמה (התאמת הנוקלאוטיד הלא נכון לגדיל DNA פגום) נמוך.

דוגמה לתיקון חוסר התאמה היא החלפה של זוג גואנין ותימין שנקשרו בעבר כדי לייצר זוג גואנין וציטוזין ב-DNA, שבו תימין מוחלף בטעות בציטוזין. פולימראזות DNA של חיידקים ואוקריוטים הם מרכזיים הן לזיהוי נזקים והן למנגנוני תיקון הנזק.

Polymerase Family C פונקציה

בעוד שתפקודי DNA פולימראז C נמצאים רק בחיידקים, לעולם אל לנו לשכוח שמספר החיידקים עולה על מספר התאים האנושיים בעשרה לאחד בגוף הממוצע ובתוכו. רובם חיוניים לבריאותנו, מסייעים למערכת העיכול ומייצרים כימיקלים המשפרים את תפקוד המערכת והאיברים. לעתים רחוקות יותר, חיידקים פתוגניים מתנחלים כדי לייצר תסמינים של מחלות ומחלות. משפחה C - המכונה לעתים קרובות PolC – היא קבוצת הפולימראז של שכפול DNA של חיידקים החשובה ביותר. משפחה C אינה פולימראז תיקון.

עם עלייה של חיידקים עמידים לתרופות, חומרים אנטיבקטריאליים חדשים הופכים נחוצים יותר ויותר. תחומי מחקר חדשים כוללים פיתוח אנטיביוטיקה המיועדת ישירות ל-PolC. תרופה חדשה ופוטנציאלית רחבה זו יכולה למנוע שכפול בכל סוגי החיידקים, בריאים ופתוגניים, אך חשוב מכך, תרופות אלו – שנמצאות עדיין בשלבי הפיתוח המוקדמים ביותר – נמנעות מהמנגנונים המובילים לאנטיביוטיקה חיידקית הִתנַגְדוּת.

פונקציית משפחת D של פולימראז

Euryarchaeota מתאר קבוצה של חיידקים גרם חיוביים וגרם שליליים שלעתים קרובות אומרים שהם מעדיפים סביבות קיצוניות (אקסטרמופילים). עם זאת, חיידקים אלה חיים ומתרבים בכל מיני סביבות, החל מסחף ימי עמוק ועד למערכות העיכול שלנו. הם משתמשים בפולימראזות DNA ממשפחת D (PolD) לשכפול DNA. שיעורי המוטציות בקבוצה זו גבוהים מאוד בהשוואה לאלו של פולימרזות DNA של PolB. ובניגוד לפולימראזות אחרות, למשפחה D אין מבנה דמוי יד, כנראה בגלל שהתאים האלה הם, מבחינה אבולוציונית, סוגי תאים מוקדמים מאוד.

Polymerase Family X Function

משפחת ה-X של DNA פולימראז מוגבלת לתאים אוקריוטים וממלאת תפקידים רפליקטיביים ותיקון. חלקם פועלים לתיקון ה-DNA המיטוכונדריאלי שבו סביבות חמצון גבוהות מעודדות נזק ל-DNA. אחרים מתקנים אחד עד (בערך) עשרה נוקלאוטידים רצופים ב-DNA של גרעין התא. שיטת התיקון (תיקון כריתת בסיס) במיטוכונדריון ובגרעין דומה. תיקון כריתת בסיס (BER) הוא תהליך המשתמש בסוגים שונים של אנזימים, כולל DNA גליקוזילאז ואנדונוקלאזים. זהו פולימראז DNA ממשפחת X (Pol beta ו-Pol lambda) שיוצר את האתר הפעיל לתיקון זה ומחדיר את הנוקלאוטיד הנכון. אם הגן לפולימראזות DNA ממשפחת X ניזוק, תהליכי BER מושפעים לרעה וזה קשור לסוגים מסוימים של סרטן. כמה טיפולים ממוקדים חדשים שפותחו לסוגי סרטן אלה מעכבים מנגנוני תיקון כריתת בסיס פגומים.

פונקציית משפחת Y של פולימראז

משפחת ה-DNA פולימראז Y היא אנזים שכפול ותיקון המצוי בתאים איקריוטים ופרוקריוטיים. כל הפולימראזות הללו מועדות מאוד לשגיאות ביחס לתפקידן בשכפול ובתיקון מיידי או עקיפת רצפי DNA פגומים. אך יחד עם זאת, רמות נמוכות מדי של משפחה זו של פולימראזות יכולות להגביר את הרגישות לגידולים ממאירים. זו הסיבה שמשפחת Y משולה לפעמים לחרב פיפיות.

קבוצת משפחת Y מופעלת כאשר פולימראזות DNA אחרות אינן מסוגלות להשפיע. זה אמור להיות מנגנון גיבוי זה עשוי להסביר מדוע מוטציות בעקבות תיקון מסוג זה נפוצות יותר.

פונקציית Transcriptase הפוכה

וירוסים, רטרו-וירוסים ותאי אוקריוט מכילים אנזימים של RNA-Reverse transcriptase. אנזימים אלה – חלק מקבוצת DNA פולימראז – הם מה שהופכים את הנגיפים למסוכנים. מכיוון שווירוס מכיל רק RNA, הוא חייב להערים על מיקרואורגניזם או תא לשכפל אותו. אם התאים שלנו רק היו מעתיקים את ה-RNA, הם עשויים לייצר חלבון אחד או שניים יוצאי דופן בריבוזום, אבל אלה לא יעזרו לנגיף להתרבות. במקום זאת, ה-RNA הנגיפי חייב איכשהו להפוך את עצמו לחלק מתבנית ה-DNA כך שהתא יעבור שינויים קבועים. זה עושה זאת על ידי שימוש באנזימי טרנסקריפטאז הפוך.

אנזימים אלו מייצרים DNA דו-גדילי מתבנית RNA חד-גדילית בתהליך המכונה שעתוק הפוך. מוטציות שכיחות. התמונה למטה מראה כיצד נגיף הכשל החיסוני האנושי משתכפל בלימפוציט T. שעתוק הפוך מתחיל את הצמיחה של הנגיף על ידי הטעיית התא לייצר רכיבים שמתאספים ליצירת וירוסים נוספים מ-DNA ערוך.

רוב תהליכי השעתוק ההפוך הם תוצאה של זיהומים ויראליים מזיקים, כאשר ה-RNA הנגיפי החד-גדילי מועתק ליצירת גדיל DNA כפול שימשיך לייצר חלבונים ויראליים. זה נעשה על ידי transcriptase הפוכה (הפוך מכיוון שהשיטה המקובלת היא להשתמש ב-DNA דו-גדילי כדי לייצר גדיל בודד של RNA).

בדיקה במהלך COVID-19 (SARS-CoV-2) בשנת 2020 - כמו בכל בדיקות זיהום נגיפי - דורשת מיצוי RNA ויראלי. מעבדות משתמשות בתהליך הנקרא תגובת שרשרת טרנסקריפטאז-פולימראז הפוכה (rt-PCR). Rt-PCR אינו מסובך להבנה כפי שהוא עשוי להישמע. בדיקה זו מייצרת DNA משלים (cDNA) או DNA המועתק מכמויות קטנות של RNA ויראלי. מכיוון שהליך זה מייצר רק כמויות קטנות מאוד של cDNA, יש להגביר את התוצאות על ידי שכפול שלה. לאחר מייצור בכמות מספקת, ניתן לזהות את הגנום הנגיפי.


שלב 1. הכן מדגם

RNA משמש כתבנית בסינתזת cDNA. RNA כולל משמש באופן שגרתי בסינתזת cDNA עבור יישומים במורד הזרם כגון RT-(q)PCR, בעוד שסוגים ספציפיים של RNA (למשל, RNA שליח (mRNA) ו-RNA קטנים כגון miRNA) עשויים להיות מועשרים עבור יישומים מסוימים כמו בניית ספריית cDNA ופרופילי miRNA.

שמירה על שלמות ה-RNA היא קריטית ודורשת אמצעי זהירות מיוחדים במהלך מיצוי, עיבוד, אחסון ושימוש ניסיוני. שיטות עבודה מומלצות למניעת השפלה של RNA כוללות לבישת כפפות, פיפטציה עם קצות מחסום אירוסול, שימוש בכלי מעבדה וריאגנטים נטולי נוקלאז, וטיהור אזורי עבודה.

כדי לבודד ולטהר RNA, מגוון אסטרטגיות זמינות בהתאם לסוג חומרי המקור (למשל דם, רקמות, תאים, צמחים) ומטרות הניסויים. המטרות העיקריות של זרימות עבודה של בידוד הן לייצב מולקולות RNA, לעכב RNases ולמקסם את התשואה עם שיטות אחסון וחילוץ מתאימות. שיטות טיהור אופטימליות מסירות תרכובות אנדוגניות, כמו פוליסכרידים מורכבים וחומצה הומית מרקמות צמחיות המפריעות לפעילות האנזים ומעכבים נפוצים של תעתיקים הפוכים, כגון מלחים, יוני מתכת, אתנול ופנול. לאחר הטיהור, יש לאחסן RNA ב-80 מעלות צלזיוס עם מחזורי הקפאה-הפשרה מינימליים.

דגשים במוצר

עצות לפתרון בעיות

  1. צמצם את מספר מחזורי הקפאה-הפשרה של דגימות RNA כדי למנוע השפלה.
  2. אחסן RNA בתמיסה מבוקרת EDTA כדי למזער חישוף לא ספציפי על ידי נוקלאזות שיש להם גורמים משותפים של יוני מתכת.
  3. השתמש במים שאושרו נטולי נוקלאז או מטופלים ב-DEPC (דיאתילפירוקרבונט) כדי להבטיח היעדר RNase.
  4. הערכת שלמות ה-RNA על ידי אלקטרופורזה של ג'ל או מיקרופלואידיקה.

סינתזת RT-PCR & cDNA

סינתזת ה- DNA מתבנית RNA, באמצעות שעתוק הפוך, מייצרת DNA משלים (cDNA). תעתיקים הפוכים (RTs) משתמשים בתבנית RNA ובפריימר משלימים לקצה ה-3&prime של ה-RNA כדי לכוון את הסינתזה של cDNA הגדיל הראשון, שיכול לשמש ישירות כתבנית לתגובת שרשרת הפולימראז (PCR). שילוב זה של שעתוק הפוך ו- PCR (RT-PCR) מאפשר זיהוי RNAs בשפע נמוך במדגם, וייצור ה- cDNA המקביל, ובכך מקל על שיבוט גנים עותקים נמוכים. לחלופין, ניתן להפוך את ה- cDNA של הגדיל הראשון לגדילה כפולה באמצעות DNA Polymerase I ו- DNA Ligase. ניתן להשתמש בתוצרי תגובה אלו לשיבוט ישיר ללא הגברה. במקרה זה, נדרשת פעילות RNase H, מה- RT או המסופקת אקסוגנית.

RTs רבים זמינים מספקים מסחריים. Avian Myeloblastosis Virus (AMV) Reverse Transcriptase ו-Molony Murine Leukemia Virus (M-MuLV, MMLV) Reverse Transcriptase הם RTs שנמצאים בשימוש נפוץ בתהליכי עבודה בביולוגיה מולקולרית. ProtoScript ® II Reverse Transcriptase הוא תעתיק הפוך של M-MuLV רקומביננטי עם פעילות RNase H מופחתת ויציבות תרמוסית מוגברת. ניתן להשתמש בו כדי לסנתז cDNA גדיל ראשון בטמפרטורות גבוהות יותר מ- M-MuLV מסוג wild. האנזים פעיל עד 50°C, מספק ספציפיות גבוהה יותר, תשואה גבוהה יותר של cDNA ומוצר cDNA באורך מלא יותר, באורך של עד 12 kb.

השימוש ב-RTs מהונדסים משפר את היעילות של יצירת מוצר באורך מלא, מבטיח שההעתקה של קצה 5&prime של תמליל ה-mRNA הושלמה, ומאפשרת ריבוי ואפיון של עותק DNA נאמן של רצף RNA. השימוש ב-RTs היציבים יותר, שבהם תגובות מבוצעות בטמפרטורות גבוהות יותר, עשוי להיות מועיל עבור שעתוק הפוך של RNA המכיל מבנה משני.

לקבלת עזרה בהשוואה בין ריאגנטים של RTs ו-cDNA Synthesis הזמינים, צפה בטבלת בחירת סינתזת RT/cDNA שלנו.

בחר סוג:

מוצר זה מכוסה על ידי פטנט, סימני מסחר ו/או זכויות יוצרים אחד או יותר שבבעלות או בשליטת New England Biolabs, Inc (NEB).

בעוד NEB מפתחת ומאמתת את מוצריה עבור יישומים שונים, השימוש במוצר זה עשוי לחייב את הקונה לקבל זכויות קניין רוחני נוספות של צד שלישי עבור יישומים מסוימים.

למידע נוסף על זכויות מסחריות, אנא צור קשר עם צוות הפיתוח העסקי הגלובלי של NEB בכתובת [email protected]

מוצר זה מיועד למטרות מחקר בלבד. מוצר זה אינו מיועד לשימוש למטרות טיפוליות או אבחנתיות בבני אדם או בבעלי חיים.


תגלית חדשה מראה שתאים אנושיים יכולים לכתוב רצפי RNA לתוך DNA - מאתגר את העיקרון המרכזי בביולוגיה

תאים מכילים מכונות שמשכפלות DNA לקבוצה חדשה שנכנסת לתא שנוצר לאחרונה. אותה מחלקה של מכונות, הנקראות פולימראזות, גם בונות מסרי RNA, שהם כמו הערות שהועתקו ממאגר ה-DNA המרכזי של מתכונים, כך שניתן לקרוא אותם ביעילות רבה יותר לחלבונים. אבל פולימראזות נחשבו לעבוד רק בכיוון אחד DNA לתוך DNA או RNA. זה מונע מהודעות RNA להיכתב בחזרה לתוך ספר המתכונים הראשי של DNA גנומי. כעת, חוקרי אוניברסיטת תומס ג'פרסון מספקים את הראיות הראשונות לכך שניתן לכתוב חזרה מקטעי RNA לתוך ה-DNA, מה שעלול לאתגר את הדוגמה המרכזית בביולוגיה ויכול להיות שיש לו השלכות רחבות המשפיעות על תחומי ביולוגיה רבים.

“עבודה זו פותחת דלת למחקרים רבים אחרים שיעזרו לנו להבין את המשמעות של קיום מנגנון להמרת מסרי RNA ל-DNA בתאים שלנו,” אומר ריצ'רד פומרנץ, דוקטור, פרופסור חבר לביוכימיה וביולוגיה מולקולרית ב- אוניברסיטת תומס ג'פרסון. “המציאות שפולימראז אנושי יכול לעשות זאת ביעילות גבוהה, מעלה שאלות רבות.” לדוגמה, ממצא זה מצביע על כך שמסרי RNA יכולים לשמש כתבניות לתיקון או כתיבה מחדש של DNA גנומי.

העבודה פורסמה ב-11 ביוני 2021 בכתב העת התקדמות המדע.

יחד עם המחבר הראשון Gurushankar Chandramouly ומשתפי פעולה אחרים, הצוות של ד"ר פומרנץ התחיל בחקירת פולימראז אחד מאוד יוצא דופן, הנקרא פולימראז תטא. מתוך 14 פולימראזות DNA בתאי יונקים, רק שלושה עושים את עיקר העבודה של שכפול הגנום כולו כדי להתכונן לחלוקת התא. 11 הנותרים מעורבים בעיקר בזיהוי וביצוע תיקונים כאשר יש שבר או שגיאה בגדילי ה-DNA. פולימראז תטא מתקן את ה-DNA, אבל הוא מאוד מועד לשגיאות ועושה שגיאות או מוטציות רבות. לפיכך הבחינו החוקרים שחלק מהאיכויות "הרעות" של פולימראז תטא היו כאלה שחלקו עם מכונה סלולרית אחרת, אם כי אחת שכיחה יותר בווירוסים - ה-Reverse Transcriptase. כמו Pol theta, HIV הפוך טרנסקריפטאז פועל כפולימראז DNA, אך יכול גם לקשור RNA ולקרוא RNA בחזרה לגדיל DNA.

בסדרה של ניסויים אלגנטיים, החוקרים בדקו את פולימראז תטא כנגד ה-Reverse transcriptase מ-HIV, שהוא אחד הנחקרים הטובים מסוגו. הם הראו שפולימראז תטא מסוגל להמיר מסרי RNA ל-DNA, מה שהוא עשה כמו גם תעתיק הפוך של HIV, ושהוא למעשה עשה עבודה טובה יותר מאשר בעת שכפול DNA ל-DNA. פולימראז תטא היה יעיל יותר והציג פחות שגיאות בעת שימוש בתבנית RNA לכתיבת הודעות DNA חדשות, מאשר בעת שכפול DNA ל-DNA, מה שמצביע על כך שפונקציה זו יכולה להיות המטרה העיקרית שלה בתא.

הקבוצה שיתפה פעולה עם המעבדה של ד"ר Xiaojiang S. Chen ב-USC והשתמשה בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן כדי להגדיר את המבנה וגילתה שמולקולה זו הצליחה לשנות צורה כדי להכיל את מולקולת ה-RNA המסורבלת יותר - הישג ייחודי בין הפולימראזות .

“המחקר שלנו מצביע על כך שתפקידו העיקרי של פולימראז תטא הוא לפעול כתעתיק הפוך, אומר ד"ר פומרנץ. “בתאים בריאים, מטרת המולקולה הזו עשויה להיות לתיקון DNA בתיווך RNA. בתאים לא בריאים, כמו תאים סרטניים, פולימראז תטא מתבטא מאוד ומעודד צמיחת תאים סרטניים ועמידות לתרופות. יהיה מרגש להמשיך ולהבין כיצד פעילותו של פולימראז תטא על RNA תורמת לתיקון DNA ולהתרבות תאי סרטן.”

התייחסות: “Polθ מתמלל RNA לאחור ומקדם תיקון DNA בתבנית RNA” מאת Gurushankar Chandramouly, Jiemin Zhao, שיין McDevitt, Timur Rusanov, Trung Hoang, Nikita Borisonnik, Taylor Treddinick, Felicia Wednesday Lopezcolorado, Tatiana A Kent. , Joseph Mallon, Jacklyn Huhn, Zainab Shoda, Ekaterina Kashkina, Alessandra Brambati, Jeremy M. Stark, Xiaojiang S. Chen and Richard T. Pomerantz, 11 ביוני 2021, התקדמות המדע.
DOI: 10.1126/sciadv.abf1771

מחקר זה נתמך על ידי מענקי NIH 1R01GM130889-01 ו-1R01GM137124-01, ו-R01CA197506 ו-R01CA240392. מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענק קרן לחקר הסרטן במגדל. המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.


עמידות תרמוסית של DNA פולימראז

DNA היא מולקולה דינמית בעלת מבנה מיוצב על ידי מספר רב של אינטראקציות חלשות. היציבות של הסליל הכפול של DNA תלויה במגוון גורמים, כולל רצף DNA, pH, חוזק יוני, ממיסים וטמפרטורה. בפרט, ככל שהטמפרטורה מוגברת, האינטראקציות החלשות מופרעות ברצף, וכתוצאה מכך תחילה דנטורציה מקומית של הטרמינל והרצפים הפנימיים הנבחרים, ולבסוף מביאה להפרדה מלאה של גדילי DNA. המידה שבה רצוי או נסבל חוסר יציבות זה תלוי ביישום.

לדוגמה, הליכי שיבוט, כגון ליטוש קצה, ממקסמים כאשר הטרמיני מתייצבים, דבר המצביע על שימוש בפולימראז שמקורו באורגניזם מזופילי. סינתזת cDNA של גדיל שני ותרגום ניק הם יישומים אחרים המשתמשים באופן מסורתי באנזימים מזופילים. אנזימים כאלה פעילים באופן מקסימלי בטמפרטורות של 25&ndash40°C ושומרים על פעילות משמעותית גם בטמפרטורות נמוכות יותר. בדרך כלל, הם יכולים להיות מושבתים בחום ולעבוד באותם מאגרים המשמשים אנדונוקלאזות מגבלות וליגאזות, מה שמונע את הצורך בטיהור DNA ביניים.

מגוון יישומי ביולוגיה מולקולרית אחרים, כגון PCR, דורשים טמפרטורות גבוהות כדי לדנטורציה של ה-DNA לפני חישול פריימר או במהלך פילמור כדי להפחית את המבנה המשני, ובכך להפחית את הפסקת הפולימראז. פולימראזות DNA ארכאיות, כגון Vent® (NEB #M0254) ו-9°NM&trade (NEB #M0260) מופקים מהיפרתרמופילים והם עמידים ביותר בפני אי-אקטיבציה בחום, אפילו ב-100°C, ומציגים פעילות פולימראז מקסימלית ב-75&ndash85°C. תרמופילים חיידקיים הניבו אנזימים כגון טאק DNA פולימראז, שפעיל בטמפרטורות דומות, אך אינו יציב בדיוק ב-95&°C, כמו חלק מעמיתיו הארכאיים.

Vent® הוא סימן מסחרי רשום של New England Biolabs, Inc.
9&°NM&trade הוא סימן מסחרי של New England Biolabs, inc.


CDNA (DNA משלים)

התנאי cDNA מתייחס ל DNA משלים. ידוע כי cDNA מסונתז, או מיוצר מתבנית mRNA או שליח RNA. הוא מסונתז בתגובה שמתזרזת על ידי אנזימים טרנסקריפטאז הפוך ואנזימי DNA פולימראז. חשוב לציין כי cDNA משמש בדרך כלל לשבט גנים אוקריוטיים בפרוקריוטים.

מדענים משתמשים בדרך כלל ב-cDNA כאשר הם רוצים לבטא חלבון מסוים בתא שבדרך כלל אינו מבטא חלבון כזה. תהליך זה מכונה ביטוי הטרולוגי. הביטוי של חלבון כזה יעשה על ידי העברת ה-cDNA המקודד לאותו חלבון לתא המקבל. כמו כן, חשוב לציין ש-cDNA יכול להיות מיוצר גם על ידי רטרו-וירוסים כמו Simian Immunodeficiency Virus, HIV-1 ו-HIV-2 בין היתר. ברגע שה-cDNA נוצר מווירוסים כאלה, הוא משולב בגנום של המארח, שם הוא ממשיך ליצור פרו-וירוס.

מחקרים מראים שכאשר חלבון עובר סינתזה, ה-DNA של הגן מתעתק ל-mRNA, שמתורגם לאחר מכן לחלבון. גנים מחולקים בדרך כלל לגנים אוקריוטיים ופרוקריוטיים. ההבדל היחיד בין הגנים הללו הוא שהגנים האוקריוטיים מכילים אינטרונים במקום אקסטרונים הכלולים בגנים הפרוקריוטים.

אינטרונים אינם רצפים מקודדים, ואילו אקסטרונים הם מערכות קידוד DNA. במהלך שעתוק החלבונים, כל RNA האינטרונים נחתך מה-RNA הראשוני והחתיכה הנותרת נחתכת לאחור כדי להפוך ל-mRNA. במילים אחרות, ה-mRNA נוצר לאחר הסרת כל האינטרונים מה-RNA הראשוני. לאחר היווצרותו, ה-mRNA מתורגם לחומצת אמינו וכולל חלבון חדש שנוצר. מהאמור לעיל, יש לציין כי גנים פרוקריוטיים אינם מכילים אינטרונים כלשהם, ולכן ה-RNA שלהם אינם נתונים לחיתוך או שחבור.

במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך לגרום לתא פרוקריוטי לבטא את הגנים של תא איקריוטי. אחת הדרכים לאפשר זאת היא באמצעות הוספת DNA אוקריוטי ישירות לתא הפרוקריוטי, כדי לאפשר לו לייצר חלבון משלו. כפי שצוין, ל-DNA האוקריוטי יש אינטרונים, בעוד של-DNA הפרוקריוטי אין את המנגנון להסרת אינטרונים מה-RNA שהועתק. כתוצאה מכך, יש להסיר את כל רצפי האינטרונים מה-DNA האוקריוטי לפני שהוא מועבר לתא הפרוקריוטי. בדרך זו, התא לא יוטל בנטל של צורך להסיר אינטרונים. ה-DNA נטול האינטרונים שנוצר הוא כתוצאה מ-mRNA נטול אינטרונים, וזו הסיבה שהוא מכונה עותק משלים של ה-mRNA. מסיבה זו המכונה DNA משלים או cDNA.

למרות שישנם תהליכים רבים לסינתזה של cDNA, הדרך הטובה ביותר לעשות זאת היא באמצעות mRNA בוגר או שחבור מלא. זה נעשה בדרך כלל על ידי שימוש באנזים הפוך טרנסקריפטאז. אנזים זה משמש מכיוון שהוא פועל בעיקר כגדיל יחיד של mRNA. הוא מייצר את ה-cDNA שלו על ידי זיווג זוגות בסיסים של RNA למשלימי ה-DNA שלהם.


Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)

RT-PCR, או PCR טרנסקריפטאז הפוך, הוא וריאציה של טכניקת ה-PCR הסטנדרטית הכוללת הגברה של mRNA ספציפי המתקבל מדגימות קטנות מאוד. זה מבטל את הצורך בתהליך טיהור mRNA מייגע הנדרש עבור טכניקות שיבוט קונבנציונליות. עם RT-PCR, נעשה שימוש ב-Reverse Transcriptase ודגימת RNA בנוסף לראגנטים הסטנדרטיים של PCR. תערובת התגובה מחוממת ל-37 מעלות צלזיוס, מה שמאפשר ייצור של עותק cDNA משלים מדגימת ה-RNA על ידי תעתיק הפוך. cDNA זה מתכלה לאחד מהפריימרים המובילים לסינתזת גדיל ראשון. מכאן נובע מ-PCR סטנדרטי שבו נוצר בסופו של דבר dsDNA. RT-PCR משולב לעתים קרובות עם PCR בזמן אמת (qPCR), אשר נמצא בשימוש נרחב לכימות רמות התעתיק בתאים וברקמות.


צפו בסרטון: DNA libraries u0026 generating cDNA. Biomolecules. MCAT. Khan Academy (אוֹקְטוֹבֶּר 2022).