מֵידָע

B4. O-linked Glycoproteins - ביולוגיה

B4. O-linked Glycoproteins - ביולוגיה


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ה-CHO מחוברים בדרך כלל מ-Gal (b 1-3) GalNAc ל-Ser או Thr של חלבון.

איור: גליקופרוטאין מקושר O

אנטיגנים של קבוצת הדם (CHOs על תאים המחוברים לחלבונים או ליפידים) הם דוגמאות. הסוכרים המוצגים ככסאות באיור שלהלן הם אנטיגנים מקבוצת הדם (בניגוד למבנים המצויים בטקסטים רבים). הם מחוברים להטרוסכריד ליבה (מוצג כאליפסה אדומה למטה) המחובר לגליקופרוטאין ממברנה או לגליקוליפיד.

איור: אנטיגנים מקבוצת הדם


מה הם גליקופרוטאין ומה הם עושים

גליקופרוטאין הוא סוג של מולקולת חלבון שנקשרה אליה פחמימה. התהליך מתרחש במהלך תרגום חלבון או כשינוי לאחר תרגום בתהליך הנקרא גליקוזילציה.

הפחמימה היא שרשרת אוליגוסכריד (גליקן) הקשורה קוולנטית לשרשראות הצדדיות הפוליפפטידיות של החלבון. בגלל קבוצות הסוכר -OH, גליקופרוטאין הם הידרופיליים יותר מחלבונים פשוטים. המשמעות היא שגליקופרוטאינים נמשכים יותר למים מאשר חלבונים רגילים. האופי ההידרופילי של המולקולה מוביל גם לקיפול האופייני של המבנה השלישוני של החלבון.

הפחמימה היא מולקולה קצרה, לעתים קרובות מסועפת, ועשויה להיות מורכבת מ:

  • סוכרים פשוטים (למשל, גלוקוז, גלקטוז, מנוז, קסילוז)
  • סוכרים אמינו (סוכרים בעלי קבוצת אמינו, כגון N-acetylglucosamine או N-acetylgalactosamine)
  • סוכרים חומציים (סוכרים בעלי קבוצת קרבוקסיל, כגון חומצה סיאלית או חומצה N-אצטיל-נויראמינית)

גליקוזילציה מסוג O-linked mucin מסדירה את תוכנית התעתיק במורד EGFR

גליקוזילציה חריגה מסוג O-linked מסוג מוצין היא תופעה שכיחה בסרטן, כאשר לעתים קרובות רואים את וויסות העל של סיאלילטרנספראזות המוביל לסיום מוקדם של שרשראות O-glycan. גליקוזילציה מסוג O-linked של מוצין אינה מוגבלת למוצינים ומתרחשת בגליקופרוטאינים רבים משטח התא, כולל EGFR, שם ניתן להגביל את מספר האתרים. עם קשירת EGF, EGFR משרה מפל איתות ועשוי גם לעבור לגרעין שבו הוא מווסת ישירות את שעתוק הגנים, תהליך המווסת על ידי Galectin-3 ו-MUC1 בכמה סוגי סרטן. כאן, אנו מראים כי עם קשירת EGF, תאי סרטן השד הנושאים O-glycans שונים מגיבים על ידי שעתוק חתימות ביטוי גנים שונות. MMP10, הגן העיקרי שעבר ויסות מוגברת כאשר תאים הנושאים גליקנים מסיביים של ליבה 1 עברו גירוי באמצעות EGF, מווסת גם בקרצינומה חיובית של השד שדווח כי הוא מבטא רמות גבוהות של ST3Gal1 ומכאן בעיקר O-glycanים עם סיאלילציה של ליבה 1. לעומת זאת, תאים איזוגניים שהונדסו לשאת גליקנים ליבה 2 מגבירים את ה-CX3CL1 ו-FGFBP1 וגנים אלו מווסתים בקרצינומות שד שליליות ER, הידוע גם כמבטאות ליבה 2 O-glycans ארוכים יותר. שינויים ב-O-glycosylation לא שינו באופן משמעותי את העברת האותות במורד EGFR בתאים המבטאים O-glycan ליבה 1 או ליבה 2. עם זאת, נצפו שינויים בולטים ביצירת קומפלקס EGFR/galectin-3/MUC1/β-catenin על פני התא, הקיים בתאים הנושאים O-glycans קצרים על בסיס ליבה 1 אך נעדר בתאים נושאי ליבה 2.

מילות מפתח: EGFR Galectin-3 MUC1 O-linked glycosylation שעתוק.


תוכן

או-נ-אצטילגלקטוסאמין (או-GalNAc) ערוך

תוספת של נ-acetylgalactosamine (GalNAc) לסרין או ת'רונין מתרחשת במנגנון Golgi, לאחר שהחלבון היה מקופל. [1] [6] התהליך מבוצע על ידי אנזימים המכונים GalNAc transferases (GALNTs), מתוכם ישנם 20 סוגים שונים. [6] הראשונית אוניתן לשנות את מבנה GalNAc על ידי הוספת סוכרים אחרים, או תרכובות אחרות כגון קבוצות מתיל ואצטיל. [1] שינויים אלה מייצרים 8 מבני ליבה הידועים עד היום. [2] לתאים שונים יש אנזימים שונים שיכולים להוסיף סוכרים נוספים, המכונים גליקוזילטרנספראזות, ולכן מבנים משתנים מתא לתא. [6] סוכרים נפוצים שנוספו כוללים גלקטוז, נ-אצטיל גלוקוזאמין, פוקוז וחומצה סיאלית. ניתן לשנות סוכרים אלה גם על ידי הוספת סולפטים או קבוצות אצטיל.

עריכת ביוסינתזה

GalNAc מתווסף על גבי שארית סרין או תראונין ממולקולת קדם, באמצעות פעילותו של אנזים GalNAc טרנספראז. [1] מבשר זה נחוץ כדי שניתן יהיה להעביר את הסוכר למקום שבו הוא יתווסף לחלבון. השייר הספציפי שאליו יתחבר GalNAc אינו מוגדר, כי ישנם אנזימים רבים שיכולים להוסיף את הסוכר וכל אחד מהם יעדיף שיירים שונים. [7] עם זאת, לעתים קרובות יש שאריות פרולין (פרו) ליד התריונין או הסרין. [6]

לאחר הוספת סוכר ראשוני זה, גליקוזילטרנספראזות אחרות יכולות לזרז הוספת סוכרים נוספים. שניים מהמבנים הנפוצים ביותר שנוצרו הם Core 1 ו- Core 2. Core 1 נוצר על ידי הוספת סוכר גלקטוז על ה-GalNAc הראשוני. Core 2 מורכב ממבנה Core 1 עם מבנה נוסף נסוכר -acetylglucosamine (GlcNAc). [6] פולי-נמבנה אצטיללקטוסאמין יכול להיווצר על ידי הוספה לסירוגין של סוכרי GlcNAc וגלקטוז על סוכר GalNAc. [6]

סוכרים סופניים על O-glycans חשובים להכרה על ידי לקטינים וממלאים תפקיד מפתח במערכת החיסון. הוספה של סוכרי פוקוז על ידי פוקוסילטרנספראזות יוצרת אפיטופים של לואיס ואת הפיגום עבור גורמי קבוצת דם. תוספת של פוקוזה לבדה יוצרת את האנטיגן H, הקיים אצל אנשים עם סוג דם O. [6] על ידי הוספת גלקטוז למבנה זה, נוצר אנטיגן B של קבוצת דם B. לחלופין, הוספת סוכר GalNAc תיצור את האנטיגן A לקבוצת דם A.

פונקציות עריכה

או-סוכרי GalNAc חשובים במגוון תהליכים, כולל זרימת לויקוציטים במהלך תגובה חיסונית, הפריה והגנה מפני חיידקים פולשים. [1] [2]

או-סוכרי GalNAc נפוצים על גליקופרוטאין ממברנה, שם הם עוזרים להגביר את הקשיחות של האזור הקרוב לממברנה כך שהחלבון מתרחק מהמשטח. [6] לדוגמה, קולטן הליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) מוקרן משטח התא על ידי אזור שהתקשה על ידי O-glycans. [2]

על מנת שלוקוציטים של מערכת החיסון יעברו לתאים נגועים, עליהם לקיים אינטראקציה עם תאים אלו דרך קולטנים. לויקוציטים מבטאים ליגנדים על פני התא שלהם כדי לאפשר אינטראקציה זו להתרחש. [1] P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1) הוא ליגנד כזה, ומכיל הרבה O-glycans הנחוצים לתפקודו. O-glycans ליד הממברנה שומרים על המבנה המוארך ואפיטופ sLe x מסוף נחוץ לאינטראקציות עם הקולטן. [8]

Mucins הם קבוצה של חלבונים בעלי O-glycosylated בכבדות המצפים את דרכי העיכול ודרכי הנשימה כדי להגן על אזורים אלה מפני זיהום. [6] המוצינים הם בעלי מטען שלילי, מה שמאפשר להם ליצור אינטראקציה עם מים ולמנוע מהם להתאדות. זה חשוב בתפקוד ההגנה שלהם שכן הוא משמן את הצינורות כך שחיידקים לא יכולים להיקשר ולהדביק את הגוף. שינויים ב-mucins חשובים במחלות רבות, כולל סרטן ומחלות מעי דלקתיות. היעדר O-glycans על חלבוני mucin משנה את צורתם התלת-ממדית באופן דרמטי ולעתים קרובות מונע תפקוד נכון. [1] [9]

או-נ-אצטיל גלוקוזאמין (או-GlcNAc) ערוך

תוספת של נ-אצטיל גלוקוזאמין (O-GlcNAc) לשאריות סרין ותרונין מתרחשת בדרך כלל על חלבונים ציטופלסמיים וגרעיניים שנשארים בתא, בעוד או-שינויים ב-GalNAc מתרחשים בדרך כלל על חלבונים שיופרשו. [10] השינוי התגלה רק לאחרונה, אך מספר החלבונים איתו גדל במהירות. [7] זוהי הדוגמה הראשונה של גליקוזילציה שאינה מתרחשת על חלבונים מפרישים.

או-GlcNAcylation שונה מתהליכי O-glycosylation אחרים מכיוון שבדרך כלל לא מתווספים סוכרים על מבנה הליבה וכי ניתן לחבר או להסיר את הסוכר מחלבון מספר פעמים. [6] [7] הוספה והסרה זו מתרחשת במחזוריות ומבוצעת על ידי שני אנזימים מאוד ספציפיים. O-GlcNAc מתווסף על ידי O-GlcNAc transferase (OGT) ומוסר על ידי O-GlcNAcase (OGA). מכיוון שיש רק שני אנזימים שמשפיעים על השינוי הספציפי הזה, הם מוסדרים מאוד ותלויים בהרבה גורמים אחרים. [11]

מכיוון שניתן להוסיף ולהסיר O-GlcNAc, הוא ידוע כשינוי דינמי ויש לו הרבה קווי דמיון לזרחון. O-GlcNAcylation וזרחון יכולים להתרחש על אותם שאריות תראונין וסרין, מה שמצביע על קשר מורכב בין שינויים אלה שיכולים להשפיע על תפקודים רבים של התא. [6] [12] השינוי משפיע על תהליכים כמו תגובת התאים ללחץ תאי, מחזור התא, יציבות החלבון ומחזור החלבון. זה עשוי להיות מעורב במחלות ניווניות עצביות כמו פרקינסון ואלצהיימר מאוחרת [1] [12] ונמצא כממלא תפקיד בסוכרת. [13]

בנוסף, O-GlcNAcylation יכול לשפר את אפקט Warburg, המוגדר כשינוי המתרחש בחילוף החומרים של תאים סרטניים כדי להעדיף את צמיחתם. [6] [14] מכיוון שגם O-GlcNAcylation וגם זרחון יכולים להשפיע על שיירים ספציפיים ולכן לשניהם יש תפקידים חשובים בוויסות מסלולי איתות, שני התהליכים הללו מספקים יעדים מעניינים לחקר הסרטן.

או-מנוז (או-גבר) ערוך

O-mannosylation כולל העברה של מנוז מדוליצול-פ-מולקולת תורם מנוז על שיירי הסרין או התריונין של חלבון. [15] רוב תהליכי ה-O-glycosylation האחרים משתמשים בנוקלאוטיד סוכר כמולקולה תורמת. [7] הבדל נוסף מ-O-glycosylations אחרים הוא שהתהליך מתחיל ברטיקולום האנדופלזמי של התא, ולא במנגנון Golgi. [1] עם זאת, הוספה נוספת של סוכרים מתרחשת בגולגי. [15]

עד לאחרונה, האמינו שהתהליך מוגבל לפטריות, אולם הוא מתרחש בכל תחומי החיים אוקריוטים, (eu)חיידקים ו-archae(bacteri)a. [16] החלבון האנושי המאופיין בצורה הטובה ביותר עם O-mannosylated הוא α-dystroglycan. [15] סוכרי O-Man מפרידים בין שני תחומים של החלבון, הנדרשים לחיבור האזור החוץ-תאי והתוך-תאי כדי לעגן את התא במקומו. [17] ניתן להוסיף למבנה זה ריביטול, קסילוזה וחומצה גלוקורונית בשינוי מורכב היוצר שרשרת סוכר ארוכה. [8] זה נדרש כדי לייצב את האינטראקציה בין α-dystroglycan לבין קרום הבסיס החוץ-תאי. ללא שינויים אלה, הגליקופרוטאין אינו יכול לעגן את התא מה שמוביל לניוון שרירים מולדת (CMD), המאופיינת במומים חמורים במוח. [15]

או-גלקטוז (או-גל) ערוך

O-galactose נמצא בדרך כלל על שאריות ליזין בקולגן, שלעתים קרובות מתווספת להם קבוצת הידרוקסיל ליצירת הידרוקסיליזין. בגלל תוספת זו של חמצן, ניתן לשנות את הידרוקסיליזין על ידי O-glycosylation. הוספת גלקטוז לקבוצת ההידרוקסיל מתחילה ברטיקולום האנדופלזמי, אך מתרחשת בעיקר במנגנון הגולגי ורק על שיירי הידרוקסיליזין ברצף מסוים. [1] [18]

בעוד O-galactosylation זה הכרחי לתפקוד נכון בכל הקולגנים, הוא נפוץ במיוחד בסוגי קולגן IV ו-V. [19] במקרים מסוימים, ניתן להוסיף סוכר גלוקוז לגלקטוז הליבה. [7]

O-Fucose (O-Fuc) עריכה

הוספת סוכרי פוקוז לשאריות סרין ותרונין היא צורה יוצאת דופן של O-glycosylation המתרחשת ברטיקולום האנדופלזמי ומזרזת על ידי שני פוקוסילטרנספראזות. [20] אלה התגלו ב Plasmodium falciparum [21] ו Toxoplasma gondii. [22]

מספר אנזימים שונים מזרזים את התארכות הפוקוז הליבה, כלומר ניתן להוסיף סוכרים שונים לפוקוז הראשוני על החלבון. [20] יחד עם O-glucosylation, O-fucosylation נמצא בעיקר בתחומים של גורם גדילה אפידרמיס (EGF) הנמצאים בחלבונים. [7] O-fucosylation על תחומי EGF מתרחשת בין שיירי הציסטאין השני והשלישי ברצף החלבון. [1] לאחר הוספת הליבה O-fucose, הוא מתארך לעתים קרובות על ידי הוספת GlcNAc, גלקטוז וחומצה סיאלית.

Notch הוא חלבון חשוב בפיתוח, עם מספר תחומי EGF שהם O-fucosylated. [23] שינויים בפיתוח הפוקוז הליבה קובעים אילו אינטראקציות החלבון יכול ליצור, ולפיכך אילו גנים יועתקו במהלך הפיתוח. O-fucosylation עשוי גם לשחק תפקיד בפירוק חלבון בכבד. [1]

עריכת O-Glucose (O-Glc).

בדומה ל-O-fucosylation, O-glucosylation הוא שינוי יוצא דופן מקושר O כפי שהוא מתרחש ברטיקולום האנדופלזמי, מזורז על ידי O-glucosyltransferases, וגם דורש רצף מוגדר על מנת להתווסף לחלבון. O-גלוקוז נקשר לעתים קרובות לשאריות סרין בין שיירי הציסטאין המשומרים הראשונים והשניים של תחומי EGF, למשל בגורמי קרישה VII ו-IX. [7] נראה כי גם O-glucosylation נחוץ לקיפול תקין של תחומי EGF בחלבון Notch. [24]

פרוטאוגליקנים מורכבים מחלבון עם שרשרת צד אחת או יותר של סוכר, המכונה גליקוזאמינוגליקנים (GAGs), המחוברים לחמצן של שאריות סרין ותרונין. [25] GAGs מורכבים משרשראות ארוכות של יחידות סוכר חוזרות. פרוטאוגליקנים נמצאים בדרך כלל על פני התא ובמטריקס החוץ-תאי (ECM), והם חשובים לחוזק וגמישות הסחוס והגידים. היעדר פרוטאוגליקנים קשור לאי ספיקת לב ונשימה, ליקויים בהתפתחות השלד וגרורות מוגברת של הגידול. [25]

קיימים סוגים שונים של פרוטאוגליקנים, בהתאם לסוכר המקושר לאטום החמצן של השאריות בחלבון. לדוגמה, ה-GAG heparan sulphate מחובר לשארית חלבון סרין דרך סוכר קסילוז. [7] המבנה מורחב במספר ניחידות סוכר חוזרות על אצטיללקטוסאמין שנוספו על גבי הקסילוס. תהליך זה יוצא דופן ודורש קסילוסילטרנספראזות ספציפיות. [6] קרטן סולפט נצמד לשארית סרין או ת'רונין דרך GalNAc, והוא מורחב עם שני סוכרים גלקטוזים, ואחריהם יחידות חוזרות של חומצה גלוקורונית (GlcA) ו-GlcNAc. קרטן סולפט מסוג II שכיח במיוחד בסחוס. [25]

ניתן להצמיד סוכרי גלקטוז או גלוקוז לקבוצת הידרוקסיל של שומני סרמיד בצורה שונה של O-glycosylation, מכיוון שהיא אינה מתרחשת על חלבונים. [6] זה יוצר גליקוספינגוליפידים, שחשובים ללוקליזציה של קולטנים בממברנות. [8] פירוק שגוי של שומנים אלו מוביל לקבוצת מחלות הידועות כספינגוליפידוזות, המתאפיינות לעיתים קרובות בניוון עצבי ובלקויות התפתחותיות.

מכיוון שניתן להוסיף לליפיד הסרמיד גם סוכר וגם סוכר גלוקוז, יש לנו שתי קבוצות של גליקוספינגוליפידים. גלקטוספינגוליפידים הם בדרך כלל פשוטים מאוד במבנה וגלקטוז הליבה אינו משתנה בדרך כלל. עם זאת, גלוקוספינגוליפידים משתנים לעתים קרובות ויכולים להפוך להרבה יותר מורכבים.

ביוסינתזה של גלקטו וגלוקוספינגוליפידים מתרחשת בצורה שונה. [6] גלוקוז מתווסף לסרמיד מהמבשר שלו ברטיקולום האנדופלזמי, לפני שיתרחשו שינויים נוספים במנגנון הגולגי. [8] גלקטוז, לעומת זאת, מתווסף לסרמיד כבר במנגנון הגולגי, שם הגלקטוספינגוליפיד הנוצר לרוב סולפט על ידי הוספת קבוצות סולפט. [6]

אחת הדוגמאות הראשונות והיחידות של O-glycosylation על טירוזין, ולא על שיירי סרין או תראונין, היא הוספת גלוקוז לשארית טירוזין בגליקוגנין. [7] גליקוגנין הוא גליקוזילטרנספראז שמתחיל את ההמרה של גלוקוז לגליקוגן, הקיים בתאי השריר והכבד. [26]

כל הצורות של O-glycosylation נמצאות בשפע בכל הגוף וממלאות תפקידים חשובים בתפקודים תאיים רבים.

אפיטופים של לואיס חשובים בקביעת קבוצות דם, ומאפשרים יצירת תגובה חיסונית אם אנו מזהים איברים זרים. הבנתם חשובה בהשתלות איברים. [1]

אזורי ציר של אימונוגלובולינים מכילים אזורים בעלי סוכר גבוה ב-O בין תחומים בודדים כדי לשמור על המבנה שלהם, לאפשר אינטראקציות עם אנטיגנים זרים ולהגן על האזור מפני מחשוף פרוטאוליטי. [1] [8]

אלצהיימר עשוי להיות מושפע מ-O-glycosylation. טאו, החלבון המצטבר כדי לגרום לניוון עצבי באלצהיימר, מכיל שינויים O-GlcNAc אשר עשויים להיות מעורבים בהתקדמות המחלה. [1]

שינויים ב-O-glycosylation שכיחים ביותר בסרטן. מבני O-glycan, ובמיוחד האפיטופים של לואיס סופניים, חשובים לאפשר לתאי גידול לפלוש לרקמות חדשות במהלך גרורות. [6] הבנת השינויים הללו ב-O-glycosylation של תאים סרטניים יכולה להוביל לגישות אבחון חדשות ולהזדמנויות טיפוליות. [1]


חומרים ושיטות

אישור מחקר ואוכלוסיה

האיסוף והשימוש בכל הרוק למחקר במחקר זה אושרו על ידי הוועדה האתית של אוניברסיטת נורת'ווסט (Xi𠆚n, סין) ובית החולים השני של אוניברסיטת ג'נגג'ואו (ז'נגג'ואו, סין). התקבלה הסכמה מדעת בכתב מהמשתתפים. והמחקר הזה נערך על ידי ההנחיות האתיות של הצהרת הלסינקי. לאחר הליך אנדוסקופי סטנדרטי והערכה היסטופתולוגית, האנשים שאובחנו עם ESCC ראשוני (n 㴖) נרשמו למחקר זה. HVs התואמים גיל ומין (n = 25) גויסו ממרכז הביקורת באותו בית חולים שבו הם עברו בדיקה רפואית. לכל המשתתפים לא היו הבדלים משמעותיים בין שתי הקבוצות לגבי מאפיינים דמוגרפיים, סוציו-אקונומיים וסגנון חיים, ואלו שקיבלו קרינה טרום ניתוחית, כימותרפיה, כימותרפיה או טיפול אנטיביוטי לא נכללו במחקר זה. המאפיינים הקליניים של חולי HV ו-ESCC סוכמו בטבלה 1.

שולחן 1. מידע דמוגרפי וקליני של חולי ESCC ונבדקי HV במחקר זה.

איסוף והכנה של רוק שלם

פרוטוקול האיסוף תואר בספרות קודמת (Liu et al., 2018 Shu et al., 2018). הרוק השלם שנאסף עבר צנטריפוגה ב-10,000 g ב-4ଌ למשך 15  דקות כדי להסיר רכיבים בלתי מסיסים. והקוקטייל של מעכב פרוטאז (Sigma-Aldrich, ארצות הברית) התווסף לסופרנטנט שנאסף בהתאם להמלצות היצרן והוליך ליופיליזציה ב-�ଌ עד לשימוש.

מיקרו-מערכי לקטין וניתוח נתונים

מיקרו-מערכי הלקטין הופקו באמצעות 37 לקטינים עם העדפות מחייבות שונות המכסות גליקנים מקושרים ל-N ו-O (Shu et al., 2017 Yu et al., 2020b). הגליקופרוטאינים המסומנים Cy3 הודגרו על מיקרו-מערך הלקטין עם סיבוב עדין בחושך (37ଌ, 3 h). המיקרו-מערכים נשטפו עם PBST ו-PBS, בהתאמה, צנטריפוגה יבשה, ונסרק מיד באמצעות סורק קונפוקאלי Genepix 4000B (Axon Instruments, ארצות הברית). התמונות שנוצרו נותחו על ידי תוכנת Gene pix (גרסה 6.0, Axon Instruments Inc., Sunnyvale, CA). ניתוח אשכול היררכי ממוצע ללא פיקוח (HCA) וניתוח רכיבים עיקריים (PCA) בוצעו על ידי Expander 6.0 (http://acgt.cs.tau.ac.il/expander/) וחבילה סטטיסטית רב-משתנית (בריטניה), בהתאמה. וה ע' הערך נגזר מבדיקת Mann–Whitney הלא פרמטרית באמצעות תוכנת GraphPad Prism (גרסה 7.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA).

ניתוח סתימת לקטין

רמות הביטוי של מבני גליקן נותחו על ידי ספיגת לקטין כפי שתואר קודם לכן (Zhang et al., 2019 Yu et al., 2020b). חלבון הרוק המצטבר הופרד על ידי 10% SDS-PAGE והועבר על גבי ממברנת PVDF (0.22 mm Millipore, Bedford, MA, ארצות הברית). קרום ה-PVDF נחסם על ידי תמיסת החסימה ללא פחמימות (Vector Labs, Burlingame, קליפורניה) והודגר עם Cy5 המסומנים DSA, ECA, LCA, PSA ו- UEA-I, בהתאמה. הממברנה נסרקה על ידי ה-STORM FluorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA, ארצות הברית) ונמדדה באמצעות תוכנת ImageJ (NIH).

הכנה של DSA-Magnetic Particle Conjugates

החלקיקים המגנטיים המצופים באפוקסי (2 mg) נשטפו עם אתנול ומאגר צימוד (5 mM NaB4או7, 180 mM H3בו4, 150 mM Na +, pH 7.4), בהתאמה, והגיבו עם תמיסת DSA (DSA מתמוסס במאגר צימוד) לפי הפרוטוקול (Zhang et al., 2019 Yang et al., 2020b). לאחר מכן, מצומדים נשטפו עם חיץ צימוד כדי להסיר את הלקטינים הלא קשורים.

בידוד סלקטיבי של שברי גליקופרוטאין מרוק על ידי DSA-Magnetic Particle Conjugates

הגליקופרוטאינים המכילים GlcNAc ו-Gal㬡-4GlcNAc בודדו מחולי ESCC ו-HVs באמצעות צימודים של חלקיקים מגנטיים DSA כפי שתואר קודם לכן (Zhang et al., 2019 Yang et al., 2020b). בקצרה, חלבון הרוק שנאסף היה מדולל במאגר המקשר (100 Mm Tris-HCl 150 mM NaCl 1 mM CaCl2, MgCl2, ו-MnCl2 pH 7.4) והודגר עם מצומדי DSA (טמפרטורת החדר, 3 h). לאחר ניעור עדין של 3 h, המצומדים נשטפו באמצעות חיץ כביסה (0.1% Tween-20 במאגר מקשר, pH 7.2) להסרת חלבונים לא קשורים, והגליקופרוטאינים שנקשרו למצומדים נפלטו עם חיץ מוציא (8 M אוריאה). , 40 mM NH4HCO3).

בידוד וטיהור של גליקנים N-Linked

הבידוד והטיהור של N-glycans בוצעו על בסיס שיטות שתוארו בעבר (Qin et al., 2017 Yang et al., 2020b). הגליקופרוטאין רוכזו והומלחו על ידי יחידות אולטרה סינון של Amicon Ultra-0.5 3 KDa (Millipore, ארצות הברית) ולאחר מכן הופלו על ידי תוספת של 8 M אוריאה, 10 mM DTT, ו-10m . הגליקופרוטאין הדנטורטי הוחלפו ל-40 mM NH4HCO3 חוצץ והודגר עם טריפסין (37ଌ, בן לילה). הטריפסין בתערובת הושבת על ידי חימום (80ଌ, 5 min) ולאחר מכן הוסיפו PNGase F (New England Biolabs, Beverly, MA) כדי לשחרר את ה-N-glycans (37ଌ, בן לילה). לאחר מכן, העיכול הועבר למחסניות HyperSep Hypercarb SPE (25 mg, 1 mL Thermo Scientific) כדי להסיר פפטידים. ה-N-glycans המטוהרים נאספו והועברו ליופילציה.

אפיון של N-Glycans על ידי MALDI-TOF/TOF-MS

ה-N-glycans אופיינו ב-MALDI-TOF/TOF-MS, UltrafleXtreme, Bruker Daltonics Bremen, גרמניה, יינון זמן טיסה/זמן טיסה מסה (MALDI-TOF/TOF-MS, Bruker Daltonics Bremen, גרמניה) כפי שתואר קודם לכן (Qin et al. ., 2017 Zhang et al., 2019 Yang et al., 2020b). הגליקנים הושעו מחדש והוכחו על מטרת מדגם MTP AnchorChip. לאחר מכן, 2 μL של 10 mg/mL 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB) עם 1 mM NaCl בתמיסת מתנול של 50% (v/v) זוהו כדי לגבש מחדש את ה-N-glycans ולייבוש בוואקום. . תקני כיול פפטידים (250 נקודות כיול Bruker) שימשו ככיול המוני. בוצע מצב השתקפות יונים חיובית, ונותח טווח מסה של 1,000𠄴,000ꃚ. ספקטרום MS מייצג של פסגות מסה של N-glycan עם יחס אות לרעש מעל שלוש נוצרו והובאו באמצעות תוכנת FlexAnalysis ו-GlycoWorkbench.


מידע על הסופר

שותפים

המחלקה למיקרוביולוגיה, אוניברסיטת קורנל, איתקה, ניו יורק, ארה"ב

Aravind Natarajan, Marielisa Cabrera-Sánchez & Matthew P. DeLisa

בית הספר להנדסה כימית וביו-מולקולרית רוברט פ. סמית, אוניברסיטת קורנל, איתקה, ניו יורק, ארה"ב

Thapakorn Jaroentomeechai, Jody C. Mohammed, Olivia Young, Michael Vilkhovoy, Sandra Vadhin, Jeffrey D. Varner & Matthew P. DeLisa

מדעי ביו-רפואה וביולוגיים, מכללת אוניברסיטת קורנל לרפואה וטרינרית, איתקה, ניו יורק, ארה"ב

אמילי סי קוקס ומתיו פ. דליסה

המרכז לחקר פחמימות מורכבות, אוניברסיטת ג'ורג'יה, אתונה, ג'ורג'יה, ארה"ב

Asif Shajahan & Parastoo Azadi

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

אתה יכול גם לחפש מחבר זה ב-PubMed Google Scholar

תרומות

א.נ. עיצב וביצע את כל המחקר, ניתח את כל הנתונים וכתב את המאמר. T.J. עיצב וביצע מחקר הקשור לגליקוזילציה ללא תאים ונתונים. M.C.-S. ו-O.Y. ביצע מחקר הקשור לבנייה ובדיקה של מסלולים ביו-סינתטיים של גליקן. J.C.M. ביצע מחקר הקשור לבדיקת חלבונים שונים לגליקוזילציה. E.C.C. ביצע מחקר הקשור לאיתור מבוסס נוגדנים של גליקופורמים שונים של MUC1. A.S., M.V., S.V., J.D.V. ופ.א. ביצע ניתוח ספקטרומטריית מסה וסייע בפירוש נתונים. M.P.D. ביים מחקר, ניתח נתונים וכתב את כתב היד.

מחבר מקביל


ערכת Deglycosylation כימית של GlycoProfile™ IV

ערכת ה-GlycoProfile IV Chemical Deglycosylation האופטימלית מסירה גליקנים מגליקופרוטאין באמצעות חומצה טריפלואורומתאן-סולפונית (TFMS). לאחר מכן ניתן לשחזר את החלבון ה-deglycosylated באמצעות שיטת עיבוד מתאימה במורד הזרם כגון סינון ג'ל או דיאליזה. בניגוד לשיטות דה-glycosylation כימיות אחרות, הידרוליזה עם TFMS נטול מים יעילה מאוד בהסרת גליקנים מקושרים O ו-N (למעט ה-GlcNAc הפנימי ביותר הקשור ל-Asn של גליקנים מקושרים N) עם פירוק חלבון מינימלי. ניתן להעריך את מידת הדגליקוזילציה על ידי שינוי ניידות של החלבון הדה-גליקוזילאט לעומת הגליקופרוטאין השלם בג'לים SDS-PAGE (איור 5).

איור 5. ניתוח של דגליקוזילציה כימית של RNase B על 12% ג'ל SDS-PAGE הומוגנית. מסלול 1 הוא בקרת RNase B (מוצר מס' R1153), בעוד שמסלולים 2 עד 5 מייצגים שברים שנאספו מעמודת סינון הג'ל. מסלולים 2 ו-3 הם חלקי נפח טרום-ריקים ונתיבים 4 ו-5 מציגים פסים ב-13.5 kDa, המקבילים ל-RNAse B עם דגליקוזילציה.

  • כל תגובה מעבדת 1-2 מ"ג גליקופרוטאין - מספיק פלט לניתוח במורד הזרם
  • פירוק מינימלי של ליבת חלבון - לנתוני MS אמינים יותר
  • דה-גליקוזילציה מלאה תוך 30 דקות בלבד - לתפוקה מוגברת

אנו מודים לפרופ' מלקולם מקריי על הגהה, לד"ר דיוויד קלארק על תחזוקת ספקטרומטר המסה Fusion Lumos, ולאנג'לינה סונג על תמיכה טכנית. אנו מכירים בשירות מ-Johns Hopkins Mass Spectrometry ו-Proteomics Core. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (R21AI122382), המכון הלאומי לסרטן, רשת המחקר לגילוי מוקדם (EDRN, U01CA152813), הקונסורציום Clinical Proteomic Tumor Analysis (CPTAC, U24CA210985), המכון הלאומי לבריאות ודם, תוכניות מצוינות במדעי הגליקו (PEG, P01HL107153), ו-amfAR, הקרן לחקר איידס בנושא הבאת מהנדסים ביולוגיים לריפוי HIV (Grant amfAR 109551-61-RGRL). המגיב הבא הושג דרך תוכנית הריאגנטים של NIH AIDS, Division of AIDS, NIAID, NIH: תאי CEM CD4 + מד"ר J.P. Jacobs.

WY ו-HZ הגו קונספט וכתבו את כתב היד WY ערכו ניתוח ניסיוני WY, MA, ו-YH ביצעו תכנות, ניתוח נתונים וביואינפורמטיקה WY ו-YH פיתחו אסטרטגיה לזיהוי גליקופפטידים QKL אספה וערכה בדיקה פתולוגית לגידול ורקמות כליות תקינות.


שינויים לאחר תרגום המווסתים את פעילות האנזים

Fangxu Sun, Ronghu Wu, בשיטות באנזימולוגיה, 2019

תַקצִיר

גליקופרוטאינים על פני התא חיוניים לפעילויות סלולריות שונות, כולל תקשורת בין תאים ואינטראקציה בין תא למטריצה. שינויים בגליקוזילציה נמצאים בקורלציה עם מחלות רבות כמו סרטן ומחלות זיהומיות. עם זאת, זה מאוד מאתגר לנתח באופן שיטתי ובמיוחד אתרים של גליקופרוטאינים הממוקמים רק על פני התא בגלל ההטרוגניות של הגליקנים, השפע הנמוך של גליקופרוטאינים רבים על פני השטח והדרישה לשיטות יעילות להפרדת גליקופרוטאין פני השטח. בפרק זה, נסקור בקצרה שיטות קיימות המבוססות על ספקטרומטריית מסה (MS) לניתוח גלובלי של גליקופרוטאינים על פני השטח. לאחר מכן אנו דנים בשיטה יעילה המשלבת תיוג מטבולי, קליקים ותגובות אנזימטיות, ופרוטאומיקה מבוססת טרשת נפוצה כדי לחקור באופן מקיף וספציפי לאתרים N-גליקופרוטאינים משטח התא. פרוטוקול מפורט לשיטה זו כלול גם. בשילוב עם פרוטאומיקה כמותית, יישמנו שיטה זו כדי לכמת N-glycoproteins משטח התא ולחקור את הקשר בין פולשנות תאים ל-N-sialoglycoproteins על פני התא. בהתחשב בחשיבותם של גליקופרוטאין משטח, ניתן ליישם שיטה זו באופן נרחב כדי לקדם את מדעי הגליקו, מה שמוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים של מחלות אנושיות, ולגילוי של גליקופרוטאין משטח כסמנים ביולוגיים לגילוי מחלות.


11.3.7. אוליגוסכרידים יכולים להיות “ברצף”

בהתחשב במגוון הגדול של מבני אוליגוסכרידים ונקודות ההתקשרות הרבות האפשריות לרוב החלבונים, כיצד ניתן לקבוע את המבנה של גליקופרוטאין? רוב הגישות מבוססות על שימוש באנזימים המחלקים אוליגוסכרידים בסוגים ספציפיים של קישורים. לדוגמה, נאוליגוסכרידים מקושרים יכולים להשתחרר מחלבונים על ידי אנזים כגון פפטיד נ-glycosidase F, אשר מבקע את נ-קשרים גליקוזידיים המקשרים בין האוליגוסכריד לחלבון. לאחר מכן ניתן לבודד ולנתח את האוליגוסכרידים. באמצעות שימוש ב-MALDI-TOF או בטכניקות ספקטרומטריות אחרות (סעיף 4.1.7), ניתן לקבוע את המסה של שבר אוליגוסכריד. עם זאת, בהתחשב במספר הגדול של שילובים פוטנציאליים של חד-סוכרים, מבנים אפשריים של אוליגו-סוכר עולים בקנה אחד עם מסה נתונה. ניתן לקבל מידע מלא יותר על ידי חיתוך האוליגוסכריד עם אנזימים בעלי סגוליות שונות. לדוגמה, β-1,4-galactosidase מבקע קשרים β-glycosidic אך ורק בשאריות גלקטוז. ניתן לנתח את המוצרים שוב באמצעות ספקטרומטריית מסה (איור 11.27). החזרה על תהליך זה עם שימוש במערך של אנזימים בעלי סגוליות שונה תגלה בסופו של דבר את מבנה האוליגוסכריד.

איור 11.27

מסה ספקטרומטרית “רצף” של אוליגוסכרידים. נעשה שימוש באנזימים המנתקים פחמימות כדי לשחרר ולבקע באופן ספציפי את רכיב האוליגוסכריד של הגליקופרוטאין fetuin מסרום בקר. חלקים A ו-B מציגים את המסות שהושגו (עוד. )

ניתן לקבוע את נקודות ההתקשרות של אוליגוסכרידים באמצעות שימוש בפרוטאזות. חיתוך של חלבון על ידי יישום פרוטאזות ספציפיות מניב דפוס אופייני של שברי פפטידים שניתן לנתח באופן כרומטוגרפי (סעיף 4.2.1). התכונות הכרומטוגרפיות של פפטידים המחוברים לאוליגוסכרידים ישתנו בטיפול בגליקוזידאז. ניתוח המוני ספקטרומטרי או רצף פפטידים ישיר יכולים לחשוף את זהות הפפטיד המדובר, ובמאמץ נוסף, את האתר המדויק של התקשרות האוליגוסכריד.

שינויים לאחר תרגום כגון גליקוזילציה מגדילים מאוד את המורכבות של הפרוטאום. לחלבון נתון עם מספר אתרי הגלוקוזידציה פוטנציאליים יכולים להיות צורות מסוכררות שונות (לפעמים נקראות גליקופורמים), שכל אחד מהם עשוי להיווצר רק בסוג תא מסוים או בשלב התפתחותי. כעת, כאשר הרצף של הגנום האנושי הושלם למעשה, אפיון הפרוטאום המורכב הרבה יותר, כולל התפקידים הביולוגיים של חלבונים שעברו שינוי ספציפי, יכול להתחיל ברצינות.

בהסכם עם המוציא לאור, ספר זה נגיש באמצעות תכונת החיפוש, אך לא ניתן לעיין בו.


צפו בסרטון: N-linked Glycosylation and Quality Control (אוֹקְטוֹבֶּר 2022).