מֵידָע

מהירות שכפול SARS-COV-2

מהירות שכפול SARS-COV-2


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

מהי מהירות השכפול של SC2? כל מידע, כולל נתונים במבחנה יתקבל בברכה.

הייתי מעוניין לדעת את אורך תקופת הליקוי של SC2, תקופה סמויה ומשהו כמו גודל פרץ.

לחלופין, ערכי CT ליום של qtPCR של נבדקי COVID+ יועילו גם הם.


לדברי איימי רוזנפלד, זה בערך 8 שעות ליקוי ו-18-24 שעות עד שזה נגמר. לא בטוח אם זה אומר עד פרץ או עד שתסתיים התקופה הסמויה. זמנים אלו הם במבחנה ותלויים בקו תאים. In vivo עשוי להיות שונה. גודל התפרצות גם תלוי בתאים. מקור: https://youtu.be/NP56XjzyPfQ?t=1301

בסרטון הזה https://youtu.be/4S3DXXtRZZg?t=152, נאמר, שכל תא יכול לייצר עד 600 אלף חלקיקים ויראליים של SC2, אבל אני לא בטוח, מה בדיוק הכוונה במספר. בהמשך הסרטון ההוא: https://youtu.be/4S3DXXtRZZg?t=187 נאמר, שנראה שהנגיף לא הורג תאים במשך כ-5-6 ימים.


מחזור שכפול של SARS-CoV-2 בתלת מימד

בעוד מגיפת הקורונה העולמית נמשכת, מדענים לא רק מנסים למצוא חיסונים ותרופות כדי להילחם בה, אלא גם ללמוד ללא הרף יותר על הנגיף עצמו. "עד עכשיו אנחנו יכולים לצפות שהנגיף יהפוך לעונתי", מסביר ראלף ברטנשלאגר, פרופסור במחלקה למחלות זיהומיות, וירולוגיה מולקולרית, באוניברסיטת היידלברג. "לפיכך, יש צורך דחוף לפתח וליישם הן אסטרטגיות מניעתיות והן אסטרטגיות טיפוליות נגד הנגיף הזה". במחקר חדש, ברטנשלאגר, בסיוע צוות Schwab ב-EMBL היידלברג ובאמצעות מתקן ליבת מיקרוסקופיה אלקטרונית של EMBL, ביצע ניתוח הדמיה מפורט כדי לקבוע כיצד הנגיף מתכנת מחדש תאים נגועים.

תאים שנדבקים ב-SARS-CoV-2 מתים די מהר, תוך 24 עד 48 שעות בלבד. זה מצביע על כך שהנגיף פוגע בתא האנושי בצורה כזו שהוא מחווט מחדש ובעצם נאלץ לייצר צאצאים ויראליים. המטרה העיקרית של הפרויקט הייתה אפוא לזהות את השינויים המורפולוגיים בתוך תא הטבועים בתכנות מחדש זה. "לפתח תרופות המדכאות את השכפול הנגיפי ובכך את התוצאה של הזיהום, כמו גם את מוות התאים המושרה בנגיף, הוא המפתח להבנה טובה יותר של המנגנונים הביולוגיים המניעים את מחזור השכפול של הנגיף", מסביר ברטנשלאגר. הצוות השתמש במתקני ההדמיה ב-EMBL ובטכניקות הדמיה מתקדמות כדי לקבוע את ארכיטקטורת התלת-ממד של תאים נגועים ב-SARS-CoV-2, כמו גם שינויים בארכיטקטורה הסלולרית שנגרמה על ידי הנגיף.

הצוות הצליח ליצור שחזורים תלת מימדיים של תאים שלמים והתאים התת-תאיים שלהם. "אנו מספקים תובנות קריטיות לגבי שינויים מבניים הנגרמים על ידי וירוסים בתאים האנושיים שנחקרו", מסביר ראלף ברטנשלאגר. התמונות חשפו שינוי ברור ומסיבי במערכות האנדוממברנות של התאים הנגועים - מערכת המאפשרת לתא להגדיר תאים ואתרים שונים. הנגיף גורם לשינויים בקרום בצורה כזו שהוא יכול לייצר אברוני שכפול משלו. אלה הם תאי שכפול מיני שבהם הגנום הנגיפי מוגבר מאוד. לשם כך, הנגיף דורש משטחי ממברנה. אלה נוצרים על ידי ניצול מערכת ממברנות תאית ויצירת אברון, בעל מראה מאוד מובחן. המדענים מתארים זאת כהצטברות מסיבית של בועות: שתי שכבות קרום היוצרות בלון גדול. בתוך הבלונים האלה - שיוצרים תא מאוד מוגן - הגנומים הנגיפיים מוכפלים ומשתחררים כדי להשתלב בחלקיקי וירוס חדשים.

ניתן לראות את השינוי המדהים הזה בתאים רק כמה שעות לאחר ההדבקה. "ראינו איך ואיפה הנגיף משתכפל בתוך התא, ואיך הוא חוטף את המנגנון המארח שלו כדי להשתחרר לאחר הכפלה", אומר שוואב. עד כה, מעט היה ידוע על מקור והתפתחות ההשפעות שגורם SARS-CoV-2 בגוף האדם. זה כולל חוסר ידע לגבי המנגנון שבו הזיהום מוביל למוות של תאים נגועים. קבלת מידע זה כעת יטפח את הפיתוח של טיפולים המפחיתים את שכפול הנגיפים, ובכך, את חומרת המחלה.

הצוות דאג שכולם יוכלו להשתמש במידע שנאסף ובמיוחד במאגר חסר התקדים של מידע מבני תלת-ממדי על תתי-מבנים הנגרמות על ידי וירוסים. "אני מאמין שאנחנו יוצרים תקדים בעובדה שאנחנו חולקים את כל הנתונים שהפקנו עם הקהילה המדעית. זה מייצג משאב מרשים לקהילה", אומר יאניק שוואב. "בדרך זו נוכל לתמוך במאמץ העולמי לחקור כיצד SARS-CoV-2 מתקשר עם המארח שלו." הצוות מקווה שהמידע שנאסף יעזור בפיתוח תרופות אנטי-ויראליות.

הצוות הצליח להפיק את המחקר בזמן קצר להפליא, למרות הנסיבות המאתגרות. "חצי מהעולם - וכמובן גם היידלברג - היו בסגר מלא והיינו צריכים לאלתר כמעט על בסיס יומיומי כדי להסתגל למצב. בין אם ב-EMBL ובין אם מהבית, כולם היו מעורבים עמוקות ונתנו מזמנם בנדיבות וידע עמוק", אומר שוואב. "המהירות שבה עבדנו, וכמות הנתונים שהופקה, מדהימה".


ביולוגיה של SARS-CoV-2

סדרת אנימציה זו בת שלושה חלקים חוקרת את הביולוגיה של הנגיף SARS-CoV-2, שגרם למגיפה עולמית של המחלה COVID-19.

SARS-CoV-2 הוא חלק ממשפחה של וירוסים הנקראים וירוסים. האנימציה הראשונה, הַדבָּקָה, מתאר את המבנה של נגיפים כמו SARS-CoV-2 וכיצד הם מדביקים בני אדם ומשכפלים בתוך תאים. האנימציה השנייה, אבולוציה, מתאר כיצד וירוסים אלו מתפתחים ודן במוטציות חיוביות, שליליות ונייטרליות. האנימציה השלישית, איתור, מתאר את השיטות המשמשות לאיתור זיהומים פעילים וקודמים של SARS-CoV-2. אנימציות אלו זמינות גם ברשימת השמעה של YouTube.

"דפי העבודה של הסטודנטים" הנלווים משלבים מושגים ומידע מהאנימציות. גיליון העבודה "גרסה 1" מתאים לתלמידי ביולוגיה כלליים בתיכון, ודף העבודה "גרסה 2" מתאים לתלמידי ביולוגיה AP/IB ולתלמידי תואר ראשון.

הקישור "Resource Google Folder" מפנה אל תיקיית Google Drive של מסמכי משאב בפורמט Google Docs. לא כל המסמכים להורדה עבור המשאב עשויים להיות זמינים בפורמט זה. תיקיית Google Drive מוגדרת כ"צפייה בלבד "לשמירת עותק של מסמך בתיקייה זו ב- Google Drive שלך, פתח את המסמך ולאחר מכן בחר קובץ →" צור עותק ". ניתן להעתיק, לשנות ולהפיץ מסמכים אלה באופן מקוון בהתאם לתנאי השימוש המפורטים בסעיף "פרטים" להלן, כולל זיכוי BioInteractive.

גרסת תיאור שמע של האנימציה זמינה דרך נגן המדיה שלנו על ידי לחיצה על כפתור "AD" בפינה השמאלית התחתונה של נגן המדיה.

מטרות הלמידה של התלמידים
  • זיהוי רכיבים מבניים של SARS-CoV-2.
  • תאר את השלבים במחזור שכפול SARS-CoV-2.
  • הסבר כיצד נוצרות מוטציות בגנום ויראלי.
  • תאר כיצד וירוס יכול להשתנות לאורך זמן עקב מוטציות.
  • תאר דרכים שונות לאיתור זיהום ויראלי.
פרטים

נוגדן, אנטיגן, COVID-19, וירוס קורונה, מעטפת, מוטציה, שכפול, RT-PCR, SARS-CoV-2 (תסמונת נשימתית חריפה וירוס קורונה 2), חלבון ספייק

Cui, Jie, Fang Li, and Zheng-Li Shi. "המקור והאבולוציה של נגיפים פתוגניים של נגיף קורונה." Nature ביקורות מיקרוביולוגיה 17, 3 (2019): 181–192. https://doi.org/10.1038/s41579-018-0118-9.

פהר, אנתוני ר. וסטנלי פרלמן. "נגיפי קורונה: סקירה כללית של השכפול והפתוגנזה שלהם." ב נגיף קורונה: שיטות ופרוטוקולים, עורכים. הלנה ג'יי מאייר, אריקה ביקרטון ופול בירטון, 1–23. כרך יד. 1282 של שיטות בביולוגיה מולקולרית. ניו יורק: Humana Press, 2015. https://doi.org/10.1007/978-1-4939-2438-7_1.

חלאני, רוז'גר א', מוחמד ספדר ומחמט אוזסלאן. "אפיון גנומי של רומן SARS-CoV-2." ג'ין דוחות 19 (2020): 100682. https://doi.org/10.1016/j.genrep.2020.100682.

המשאב מורשה תחת רישיון Creative Commons ייחוס-לא מסחרי-שיתוף זהה 4.0 בינלאומי. לא מוענקות זכויות להשתמש בשמות או בלוגו של HHMI או BioInteractive ללא תלות במשאב זה או ביצירות נגזרות כלשהן.


מחזור שכפול של SARS-CoV-2 בתלת מימד

בעוד מגיפת הקורונה העולמית נמשכת, מדענים לא רק מנסים למצוא חיסונים ותרופות להילחם בה, אלא גם ללמוד ללא הרף יותר על הנגיף עצמו. "עד עכשיו אנחנו יכולים לצפות שהנגיף יהפוך לעונתי", מסביר ראלף ברטנשלאגר, פרופסור במחלקה למחלות זיהומיות, וירולוגיה מולקולרית, באוניברסיטת היידלברג. "לכן, יש צורך דחוף לפתח וליישם הן אסטרטגיות מניעתיות והן אסטרטגיות טיפוליות נגד הנגיף הזה". במחקר חדש, ברטנשלאגר, בסיוע צוות Schwab ב-EMBL היידלברג ובאמצעות מתקן ליבת מיקרוסקופיה אלקטרונית של EMBL, ביצע ניתוח הדמיה מפורט כדי לקבוע כיצד הנגיף מתכנת מחדש תאים נגועים.

תאים שנדבקים ב-SARS-CoV-2 מתים די מהר, תוך 24 עד 48 שעות בלבד. זה מצביע על כך שהנגיף פוגע בתא האנושי בצורה כזו שהוא מחווט מחדש ובעצם נאלץ לייצר צאצאים ויראליים. המטרה העיקרית של הפרויקט הייתה אפוא לזהות את השינויים המורפולוגיים בתוך תא הטבועים בתכנות מחדש זה. "לפתח תרופות המדכאות את השכפול הנגיפי ובכך את התוצאה של הזיהום, כמו גם את מוות התאים המושרה בנגיף, הוא המפתח להבנה טובה יותר של המנגנונים הביולוגיים המניעים את מחזור השכפול של הנגיף", מסביר ברטנשלאגר. הצוות השתמש במתקני ההדמיה ב-EMBL ובטכניקות הדמיה מתקדמות כדי לקבוע את ארכיטקטורת התלת-ממד של תאים נגועים ב-SARS-CoV-2, כמו גם שינויים בארכיטקטורה הסלולרית שנגרמה על ידי הנגיף.

הצוות הצליח ליצור שחזורים תלת מימדיים של תאים שלמים והתאים התת-תאיים שלהם. "אנו מספקים תובנות קריטיות לגבי שינויים מבניים הנגרמים על ידי וירוסים בתאים האנושיים שנחקרו", מסביר ראלף ברטנשלאגר. התמונות חשפו שינוי ברור ומסיבי במערכות האנדוממברנות של התאים הנגועים - מערכת המאפשרת לתא להגדיר תאים ואתרים שונים. הנגיף גורם לשינויים בקרום בצורה כזו שהוא יכול לייצר אברוני שכפול משלו. אלה הם תאי שכפול מיני שבהם הגנום הנגיפי מוגבר מאוד. לשם כך, הנגיף דורש משטחי ממברנה. אלה נוצרים על ידי ניצול מערכת ממברנות תאית ויצירת אברון, בעל מראה מאוד מובחן. המדענים מתארים זאת כהצטברות מסיבית של בועות: שתי שכבות קרום היוצרות בלון גדול. בתוך הבלונים הללו - היוצרים תא מאוד מוגן - הגנומים הנגיפיים מוכפלים ומשתחררים כדי להשתלב בחלקיקי וירוס חדשים.

את השינוי המדהים הזה ניתן לראות בתאים רק כמה שעות לאחר ההדבקה. "ראינו איך ואיפה הנגיף משתכפל בתוך התא, ואיך הוא חוטף את המנגנון המארח שלו כדי להשתחרר לאחר ההכפלה", אומר שוואב. עד כה, מעט היה ידוע על מקור והתפתחות ההשפעות שגורם SARS-CoV-2 בגוף האדם. זה כולל חוסר ידע לגבי המנגנון שבו הזיהום מוביל למוות של תאים נגועים. קבלת מידע זה כעת יטפח את הפיתוח של טיפולים המפחיתים את שכפול הנגיפים, ובכך, את חומרת המחלה.

הצוות דאג שכולם יוכלו להשתמש במידע שנאסף ובמיוחד במאגר חסר התקדים של מידע מבני תלת מימדי על תתי מבנים הנגרמות על ידי וירוסים. "אני מאמין שאנחנו יוצרים תקדים בעובדה שאנחנו חולקים את כל הנתונים שהפקנו עם הקהילה המדעית. זה מייצג משאב מרשים לקהילה", אומר יאניק שוואב. "בדרך זו נוכל לתמוך במאמץ העולמי לחקור כיצד SARS-CoV-2 מתקשר עם המארח שלו." הצוות מקווה שהמידע שנאסף יעזור בפיתוח תרופות אנטי-ויראליות.

הצוות הצליח להפיק את המחקר בזמן קצר להפליא, למרות הנסיבות המאתגרות. "חצי מהעולם - וכמובן גם היידלברג - היו בסגר מלא והיינו צריכים לאלתר כמעט על בסיס יומיומי כדי להתאים את עצמם למצב. בין אם ב-EMBL ובין אם מהבית, כולם היו מעורבים עמוקות ונתנו מזמנם ונדיבות. ידע", אומר שוואב. "המהירות שבה עבדנו, וכמות הנתונים שהופקה, מדהימה".

כתב ויתור: AAAS ו- EurekAlert! אינם אחראים לדיוק של מהדורות חדשות שפורסמו ל- EurekAlert! על ידי מוסדות תורמים או לשימוש בכל מידע דרך מערכת EurekAlert.


תוכן

במהלך ההתפרצות הראשונית בווהאן, סין, נעשה שימוש בשמות שונים עבור הנגיף, כמה שמות ששימשו מקורות שונים כללו את "קורונה וירוס" או "קורונה ווהאן". [25] [26] בינואר 2020, ארגון הבריאות העולמי המליץ ​​על "2019 נגיף קורונה חדש" (2019-nCov) [5] [27] כשם הזמני לנגיף. זה היה בהתאם להנחיית WHO משנת 2015 [28] נגד שימוש במקומות גיאוגרפיים, מיני בעלי חיים או קבוצות של אנשים בשמות מחלות ווירוסים. [29] [30]

ב-11 בפברואר 2020, הוועדה הבינלאומית לטקסונומיה של וירוסים אימצה את השם הרשמי "Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2" (SARS-CoV-2). [31] כדי למנוע בלבול עם המחלה SARS, ארגון הבריאות העולמי מתייחס לפעמים ל-SARS-CoV-2 כ"נגיף COVID-19" בתקשורת לבריאות הציבור [32] [33] והשם HCoV-19 נכלל בחלק מהמחקרים מאמרים. [8] [9] [10]

העברה מאדם לאדם של SARS-CoV-2 אושרה ב-20 בינואר 2020, במהלך מגיפת COVID-19. [15] [34] [35] [36] בתחילה ההנחה הייתה שההעברה מתרחשת בעיקר באמצעות טיפות נשימה משיעול והתעטשות בטווח של כ-1.8 מטרים (6 רגל). [37] [38] ניסויים בפיזור אור בלייזר מצביעים על כך שדיבור הוא אמצעי שידור נוסף [39] [40] ומרחיק לכת [41] ולא נחקר [42], בתוך הבית, עם זרימת אוויר מועטה. [43] [44] מחקרים אחרים העלו כי הנגיף עשוי להיות מוטס גם כן, כאשר אירוסולים עשויים להיות מסוגלים להעביר את הנגיף. [45] [46] [47] במהלך העברה מאדם לאדם, 1000 נגיפים מדבקים של SARS-CoV-2 בממוצע נחשבים ליזום זיהום חדש. [48] ​​[49]

מגע עקיף דרך משטחים מזוהמים הוא גורם אפשרי נוסף לזיהום. [50] מחקר ראשוני מצביע על כך שהנגיף עשוי להישאר בר-קיימא על פלסטיק (פוליפרופילן) ופלדת אל-חלד (AISI 304) עד שלושה ימים, אך אינו שורד על קרטון יותר מיום אחד או על נחושת במשך יותר מארבע שעות [50] 10] הנגיף מושבת על ידי סבון, אשר מערער את היציבות של דו-שכבת השומנים שלו. [51] [52] RNA ויראלי נמצא גם בדגימות צואה ובזרע של אנשים נגועים. [53] [54]

מידת ההדבקה של הנגיף במהלך תקופת הדגירה אינה ברורה, אך מחקרים הצביעו על כך שהלוע מגיע לשיא העומס הנגיפי כארבעה ימים לאחר ההדבקה [55] [56] או השבוע הראשון של הסימפטומים, ויורד לאחר מכן. [57] משך הנשירה של SARS-CoV-2 RNA הוא בדרך כלל בין 3 ל-46 ימים לאחר הופעת התסמינים. [58]

מחקר שנערך על ידי צוות חוקרים מאוניברסיטת צפון קרוליינה מצא כי חלל האף הוא לכאורה האתר הראשוני הדומיננטי לזיהום עם זריעת וירוס מתווך שאיפה לריאות בפתוגנזה של SARS-CoV-2. [59] הם מצאו שיש שיפוע זיהום מגבוה בפרוקסימלי לנמוך בתרביות אפיתל ריאתי דיסטלי, עם זיהום מוקד בתאים ריסים ופנואוציטים מסוג 2 בדרכי הנשימה ובאזורי המכתשית בהתאמה. [59]

ישנן עדויות מסוימות להעברה מאדם לחיה של SARS-CoV-2, כולל דוגמאות בחתולים. [60] [61] מוסדות מסוימים המליצו לאלו שנדבקו ב-SARS-CoV-2 להגביל מגע עם בעלי חיים. [62] [63]

העברה אסימפטומטית

ב-1 בפברואר 2020, ארגון הבריאות העולמי (WHO) ציין כי "העברה ממקרים א-סימפטומטיים אינה גורם מרכזי להעברה". [64] מטה-אנליזה אחת מצאה כי 17% מהזיהומים הם א-סימפטומטיים, ולאנשים א-סימפטומטיים היה סיכוי נמוך ב-42% להעביר את הנגיף. [65]

עם זאת, מודל אפידמיולוגי של תחילת ההתפרצות בסין העלה כי "נשירה טרום-סימפטומטית עשויה להיות אופיינית בין זיהומים מתועדים" וכי ייתכן שזיהומים תת-קליניים היו המקור לרוב הזיהומים. [66] זה עשוי להסביר כיצד מתוך 217 על סיפונה של אוניית שיוט שעגנה במונטווידאו, רק 24 מתוך 128 שנבדקו חיוביות ל-RNA ויראלי הראו תסמינים. [67] באופן דומה, מחקר שנערך בקרב תשעים וארבעה חולים שאושפזו בינואר ופברואר 2020 העריך כי חולים השילו את הכמות הגדולה ביותר של נגיף יומיים עד שלושה לפני הופעת התסמינים וכי "חלק ניכר מההעברה התרחש כנראה לפני התסמינים הראשונים במקרה המדד. ". [68]

זיהום מחדש

קיימת אי ודאות לגבי הדבקה חוזרת וחסינות ארוכת טווח. [69] לא ידוע עד כמה שכיח זיהום חוזר, אך דיווחים הצביעו על כך שהוא מתרחש בחומרה משתנה. [69]

המקרה הראשון שדווח על הדבקה מחדש היה גבר בן 33 מהונג קונג שנראה חיובי לראשונה ב-26 במרץ 2020, שוחרר ב-15 באפריל 2020 לאחר שתי בדיקות שליליות, ונראה חיובי שוב ב-15 באוגוסט 2020 (142 ימים לאחר מכן) , אשר אושר על ידי רצף גנום שלם המראה שהגנום הנגיפי בין הפרקים שייך לקלידים שונים. [70] לממצאים היו השלכות שחסינות עדר עלולה שלא לחסל את הנגיף אם הדבקה חוזרת אינה תופעה נדירה ושייתכן שחיסונים לא יוכלו לספק הגנה לכל החיים מפני הנגיף. [70]

מחקר מקרה אחר תיאר גבר בן 25 מנבאדה שנבדק חיובי ל-SARS-CoV-2 ב-18 באפריל 2020 וב-5 ביוני 2020 (מופרדים בשתי בדיקות שליליות). מאחר שניתוחים גנומיים הראו הבדלים גנטיים משמעותיים בין וריאנט ה-SARS-CoV-2 שנדגמו בשני התאריכים הללו, מחברי המקרה קבעו כי מדובר בזיהום מחדש. [71] הזיהום השני של הגבר היה חמור יותר מבחינה סימפטומטית מהזיהום הראשון, אך המנגנונים שיכולים להסביר זאת אינם ידועים. [71]

הזיהומים הידועים הראשונים מ-SARS-CoV-2 התגלו בווהאן, סין.[17] המקור המקורי של העברה ויראלית לבני אדם עדיין לא ברור, וכך גם האם הנגיף הפך לפתוגני לפני או אחרי אירוע הגלישה. [19] [72] [9] מכיוון שרבים מהנדבקים המוקדמים היו עובדים בשוק פירות הים של Huanan, [73] [74] הוצע כי ייתכן שהנגיף הגיע מהשוק. [9] [75] עם זאת, מחקרים אחרים מצביעים על כך שייתכן שמבקרים החדירו את הנגיף לשוק, מה שאז איפשר התרחבות מהירה של הזיהומים. [19] [76] דו"ח של ארגון הבריאות העולמי במרץ 2021 על מחקר משותף של ארגון הבריאות העולמי וסין קבע כי זליגה אנושית דרך מארח חיה ביניים היא ההסבר הסביר ביותר, כאשר זליגה ישירה מעטלפים היא ככל הנראה. הקדמה דרך שרשרת אספקת המזון ושוק פירות הים של Huanan נחשבה להסבר אפשרי נוסף, אך פחות סביר. [77]

שיעור המוטציות שהוערך ממקרים מוקדמים של SARS-CoV-2 היה של 6.54 × 10-4 לאתר בשנה. [77] האבולוציה הוויראלית שלו מואטת על ידי יכולת הגהת RNA של מכונות השכפול שלו. [78]

מחקר על המאגר הטבעי של הנגיף שגרם להתפרצות הסארס בשנים 2002–2004 הביא לגילוי של הרבה קורונווירוס עטלפים דמויי SARS, שמקורם ברובם רינולופוס סוג של עטלפי פרסה. ניתוח פילוגנטי מצביע על כך שדגימות שנלקחו מ Rhinolophus sinicus מראים דמיון של 80% ל-SARS-CoV-2. [79] [80] [81] ניתוח פילוגנטי מצביע גם על כך שוירוס מ Rhinolophus affinis, שנאסף במחוז יונאן וסומן RaTG13, יש דמיון של 96% ל-SARS-CoV-2. [17] [82] רצף הנגיפים RaTG13 הוא הרצף הידוע הקרוב ביותר ל-SARS-CoV-2. [77] רצפים אחרים הקשורים קרובים זוהו גם בדגימות מאוכלוסיות עטלפים מקומיות. [83]

עטלפים נחשבים למאגר הטבעי הסביר ביותר של SARS-CoV-2, [84] [85] אך הבדלים בין נגיף העטלפים ו-SARS-CoV-2 מצביעים על כך שבני אדם נדבקו באמצעות מארח ביניים [75] אם כי מקור ההקדמה לתוך בני אדם נותר לא ידוע. [86]

למרות שתפקידם של פנגולינים כמארח ביניים הונח בתחילה (מחקר שפורסם ביולי 2020 העלה כי פנגולינים הם מארח ביניים של נגיפים דמויי SARS-CoV-2 [87] [88] ), מחקרים שלאחר מכן לא הוכיחו את תרומתם לגלגול. [77] עדויות נגד השערה זו כוללות את העובדה שדגימות נגיף פנגולין רחוקות מדי מ-SARS-CoV-2: מבודדים שהתקבלו מפנגולינים שנתפסו בגואנגדונג היו זהים רק ב-92% ברצף לגנום ה-SARS-CoV-2. בנוסף, למרות קווי דמיון בכמה חומצות אמינו קריטיות, [89] דגימות נגיף פנגולין מפגינות קישור לקוי לקולטן ACE2 האנושי. [90]

SARS-CoV-2 שייך למשפחה הרחבה של נגיפים המכונה וירוסים. [26] זהו וירוס RNA חד-גדילי בעל חוש חיובי (+ssRNA), עם מקטע RNA ליניארי יחיד. נגיף קורונה מדביק בני אדם, יונקים אחרים ומינים של עופות, כולל בעלי חיים וחיות לוויה. [91] נגיף קורונוב אנושי מסוגל לגרום למחלות החל מהצטננות ועד למחלות קשות יותר כגון תסמונת הנשימה במזרח התיכון (MERS, שיעור תמותה

34%). SARS-CoV-2 הוא הנגיף השביעי הידוע שמדביק אנשים, אחרי 229E, NL63, OC43, HKU1, MERS-CoV וה-SARS-CoV המקורי. [92]

כמו נגיף הקורונה הקשור ל-SARS המעורב בהתפרצות ה-SARS בשנת 2003, SARS-CoV-2 הוא חבר בתת-הסוג סרבקוווירוס (שושלת ביתא-CoV B). [93] [94] נגיפים גם עוברים רקומבינציה תכופה. [95] רצף ה-RNA שלו הוא באורך של כ-30,000 בסיסים, [96] ארוך יחסית לנגיף הקורונה (אשר בתורו נושא את הגנום הגדול ביותר מבין כל משפחות ה-RNA) [97] הגנום שלו מורכב כמעט כולו מרצפים מקודדי חלבון, תכונה משותף עם נגיפים אחרים. [95]

מאפיין מבחין של SARS-CoV-2 הוא השילוב שלו של אתר רב-בסיסי שנבקע על ידי פורין, [89] שנראה כי הוא מרכיב חשוב המגביר את הארסיות שלו. [98] הפורין פרוטאז מזהה את רצף הפפטידים הקנוני RX[R/K]R↓X כאשר אתר הביקוע מסומן בחץ למטה ו-X הוא כל חומצת אמינו. [99] [100] ב-SARS-CoV-2 אתר הזיהוי נוצר על ידי רצף הנוקלאוטידים של 12 קודונים המשולב CCT CGG CGG GCA התואם לרצף חומצות האמינו PRRA. [101] רצף זה נמצא במעלה הזרם של ארגינין וסרין שיוצרים את אתר המחשוף S1/S2 (PRRAR↓S) של חלבון הספייק. [102] למרות שאתרים כאלה הם מאפיין נפוץ טבעי של וירוסים אחרים, [101] כולל חלק מחברי הסוג Beta-CoV וסוגים אחרים של וירוסים, [103] SARS-Cov-2 הוא ייחודי בין חברי תת-הסוג שלו לאתר כזה. [89]

נתוני רצף גנטי ויראלי יכולים לספק מידע קריטי לגבי האם סביר להניח שווירוסים המופרדים על ידי זמן ומרחב יהיו קשורים אפידמיולוגית. [104] עם מספר מספיק של גנומים מסודרים, ניתן לשחזר עץ פילוגנטי של היסטוריית המוטציות של משפחת נגיפים. עד 12 בינואר 2020, חמישה גנומים של SARS-CoV-2 בודדו מווהאן ודווחו על ידי המרכז הסיני לבקרת מחלות ומניעתן (CCDC) ומוסדות אחרים [96] [105] מספר הגנומים גדל ל-42 ב-30 ינואר 2020. [106] ניתוח פילוגנטי של אותן דגימות הראה שהן "קשורות מאוד עם לכל היותר שבע מוטציות ביחס לאב קדמון משותף", מה שמרמז שהזיהום האנושי הראשון התרחש בנובמבר או בדצמבר 2019. [106] בדיקת הטופולוגיה של העץ הפילוגנטי בתחילת המגיפה מצאו גם קווי דמיון גבוהים בין בידודים אנושיים. [107] נכון ל-7 במאי 2020, [עדכון] 4,690 גנומים SARS-CoV-2 שנדגמו בשש יבשות היו זמינים לציבור. [108] [ נדרשת הבהרה ]

ב-11 בפברואר 2020, הוועדה הבינלאומית לטקסונומיה של וירוסים הודיעה כי על פי הכללים הקיימים שמחשבים יחסים היררכיים בין וירוסים על בסיס חמישה רצפים שמורים של חומצות גרעין, ההבדלים בין מה שנקרא אז 2019-nCoV לבין הנגיף מ-SARS 2003 ההתפרצות לא הספיקה להפריד בין מינים ויראליים. לכן, הם זיהו את 2019-nCoV כווירוס של וירוס קורונה הקשור לתסמונת נשימתית חריפה. [109]

ביולי 2020, מדענים דיווחו כי גרסה מדבקת יותר של SARS-CoV-2 עם וריאנט חלבון ספייק G614 החליף את D614 כצורה הדומיננטית במגיפה. [110] [111]

גנומים ותת-גנומים של וירוס קורונה מקודדים שש מסגרות קריאה פתוחות (ORFs). [112] באוקטובר 2020, חוקרים גילו גן חופף אפשרי בשם ORF3d, בגנום SARS-CoV-2. לא ידוע אם החלבון המיוצר על ידי ORF3d יש תפקיד כלשהו, ​​אבל הוא מעורר תגובה חיסונית חזקה. ORF3d זוהה בעבר, בגרסה של נגיף הקורונה שמדביק פנגולינים. [113] [114]

עץ פילוגנטי

עץ פילוגנטי המבוסס על רצפי גנום שלם של SARS-CoV-2 וקורונה קשורים הוא: [115] [116] [117]

Pangolin SARSr-COV-GX, 89% ל-SARS-COV-2, מאניס ג'ווניקה, הוברח מדרום מזרח אסיה [120]

Pangolin SARSr-COV-GD, 91% ל-SARS-COV-2, מאניס ג'ווניקה, הוברח מדרום מזרח אסיה [121]

גרסאות

ישנן אלפים רבים של גרסאות של SARS-CoV-2, אותן ניתן לקבץ לקלידים הגדולים בהרבה. [123] הוצעו כמה מינוחי קלאד שונים. Nextstrain מחלק את הגרסאות לחמישה קלידים (19A, 19B, 20A, 20B ו-20C), בעוד ש-GISAID מחלק אותם לשבע (L, O, V, S, G, GH ו-GR). [124]

מספר גרסאות בולטות של SARS-CoV-2 הופיעו בסוף 2020. ארגון הבריאות העולמי הכריז כעת על ארבע גרסאות של דאגה, שהן כדלקמן: [125]

  • אלפא: שושלת B.1.1.7 הופיעה בממלכה המאוחדת בספטמבר 2020, עם עדויות להעברה מוגברת וארסיות. מוטציות בולטות כוללות N501Y ו-P681H.
    • נצפתה מוטציה של E484K בכמה ויוריונים של שושלת B.1.1.7, והיא מלווה גם על ידי סוכנויות בריאות ציבוריות שונות.

    גרסאות בולטות אחרות כוללות 6 גרסאות אחרות שהוגדרו על ידי ארגון הבריאות העולמי בחקירה ואשכול 5, שהופיעו בקרב מינק בדמרק והביאו למסע המתת חסד מינק שגרם לו כמעט להיכחד. [126]

    מִבְנֶה

    קוטר כל SARS-CoV-2 הוא 50-200 ננומטר. [74] כמו נגיפים אחרים, ל-SARS-CoV-2 יש ארבעה חלבונים מבניים, הידועים כחלבונים S (ספייק), E (מעטפת), M (ממברנה) ו-N (נוקלאוקפסיד) חלבון N מחזיק את גנום ה-RNA, וכן חלבוני S, E ו-M יוצרים יחד את המעטפת הוויראלית. [127] חלבוני Coronavirus S הם גליקופרוטאין המחולקים לשני חלקים פונקציונליים (S1 ו-S2). [91] ב-SARS-CoV-2, חלבון הספייק, אשר צולם ברמה האטומית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני קריוגני, [128] [129] הוא החלבון האחראי לאפשר לנגיף להיצמד ולהתמזג עם הממברנה של תא מארח [127] באופן ספציפי, תת-יחידת ה-S1 שלו מזרזת התקשרות, היתוך תת-יחידת S2. [130]

    גנום

    ל-SARS-CoV-2 יש גנום RNA ליניארי, בעל חוש חיובי, חד-גדילי באורך של כ-30,000 בסיסים. [91] לגנום שלו יש הטיה נגד נוקלאוטידים ציטוזין (C) וגואנין (G) כמו נגיפים אחרים. [131] לגנום יש את ההרכב הגבוה ביותר של U (32.2%), ואחריו A (29.9%), והרכב דומה של G (19.6%) ו-C (18.3%). [132] הטיית הנוקלאוטידים נובעת ממוטציה של גואנינים וציטוזינים לאדנוזינים ואורצילים, בהתאמה. [133] ההערכה היא שהמוטציה של דינוקלאוטידים CG מתעוררת כדי להימנע ממנגנון ההגנה של תאים הקשור לחלבון אנטי-ויראלי של אצבע האבץ, [134] ולהוריד את האנרגיה לניתוק הגנום במהלך שכפול ותרגום (צמד בסיסים של אדנוזין ואורציל באמצעות שני מימן קשרים, ציטוזין וגואנין דרך שלושה). [133] הדלדול של דינוקלאוטידים CG בגנום שלו הוביל את הנגיף להטיה בולטת לשימוש בקודונים. לדוגמה, לששת הקודונים השונים של ארגינין יש שימוש יחסי בקודונים נרדפים של AGA (2.67), CGU (1.46), AGG (.81), CGC (.58), CGA (.29) ו-CGG (.19). [132] מגמה דומה של הטיית שימוש בקודונים נראית בנגיפים אחרים הקשורים ל-SARS. [135]

    מחזור שכפול

    זיהומים וירוסים מתחילים כאשר חלקיקים ויראליים נקשרים לקולטנים התאיים על פני השטח המארח. [136] ניסויי מודלים של חלבון על חלבון הספייק של הנגיף העלו עד מהרה כי ל-SARS-CoV-2 יש זיקה מספקת לאנזים הממיר אנגיוטנסין קולטן 2 (ACE2) בתאים אנושיים כדי להשתמש בהם כמנגנון של כניסת תאים. [137] עד ה-22 בינואר 2020, קבוצה בסין שעבדה עם הגנום המלא של הנגיף וקבוצה בארצות הברית המשתמשת בשיטות גנטיקה הפוכה באופן עצמאי וניסיוני הוכיחה כי ACE2 יכול לשמש כקולטן ל-SARS-CoV-2. [17] [138] [139] [140] מחקרים הראו של-SARS-CoV-2 יש זיקה גבוהה יותר ל-ACE2 האנושי מאשר לנגיף ה-SARS המקורי. [128] [141] SARS-CoV-2 עשוי להשתמש גם ב-basigin כדי לסייע בכניסה לתאים. [142]

    תחול חלבון ספייק ראשוני על ידי פרוטאז טרנסממברני, סרין 2 (TMPRSS2) חיוני לכניסה של SARS-CoV-2. [23] החלבון המארח נורופילין 1 (NRP1) עשוי לסייע לנגיף בכניסה לתא מארח באמצעות ACE2. [143] לאחר חיבור של נגיף SARS-CoV-2 לתא מטרה, ה-TMPRSS2 של התא חותך את חלבון הספייק של הנגיף, חושף פפטיד היתוך בתת-יחידת S2 ואת הקולטן המארח ACE2. [130] לאחר היתוך, נוצר אנדוזום סביב הנגיף, המפריד אותו משאר התא המארח. הוויריון בורח כאשר ה-pH של האנדוזום יורד או כאשר קתפסין, ציסטאין פרוטאז מארח, מבקע אותו. [130] לאחר מכן הוויריון משחרר RNA לתוך התא ומאלץ את התא לייצר ולהפיץ עותקים של הנגיף, אשר מדביקים תאים נוספים. [144]

    SARS-CoV-2 מייצר לפחות שלושה גורמי ארסיות המעודדים נשירה של נגיפים חדשים מתאי מארח ומעכבים תגובה חיסונית. [127] האם הם כוללים הפחתת ויסות של ACE2, כפי שניתן לראות בנגיפים דומים, עדיין בבדיקה (נכון למאי 2020). [145]

    בהתבסס על השונות הנמוכה המוצגת בין רצפים גנומיים ידועים של SARS-CoV-2, רשויות הבריאות ככל הנראה זיהו את הנגיף תוך שבועות לאחר הופעתו בקרב האוכלוסייה האנושית בסוף 2019. [19] [146] המקרה המוקדם ביותר של זיהום הידוע כיום מתוארך עד 1 בדצמבר 2019, אם כי מקרה מוקדם יותר יכול היה להתרחש ב-17 בנובמבר 2019. [147] [148] על ידי ניתוח tMRCA הוערך התפרצות המגיפה שהתרחשה לפני סוף דצמבר 2019, אך מסקנות סטטיסטיות אלו אינן מספקות הוכחה חותכת של זמן המוצא. [77] הנגיף התפשט לאחר מכן לכל מחוזות סין וליותר מ-150 מדינות אחרות ברחבי העולם. [149] העברה מאדם לאדם של הנגיף אושרה בכל האזורים הללו. [150] ב-30 בינואר 2020, SARS-CoV-2 הוגדר כמצב חירום לבריאות הציבור של דאגה בינלאומית על ידי ארגון הבריאות העולמי, [151] [12] וב-11 במרץ 2020 הכריז ארגון הבריאות העולמי על מגיפה. [13] [152]

    בדיקות רטרוספקטיביות שנאספו בתוך מערכת המעקב הסינית לא גילו אינדיקציה ברורה למחזור לא מזוהה משמעותי של SARS-CoV-2 בווהאן במהלך החלק האחרון של 2019. [153]

    מטא-אנליזה מנובמבר 2020 העריכה את מספר הרבייה הבסיסי (R 0 >) של הנגיף בין 2.39 ל-3.44. [20] משמעות הדבר היא שכל זיהום מהנגיף צפוי לגרום ל-2.39 עד 3.44 זיהומים חדשים כאשר אף אחד מחברי הקהילה אינו חסין ולא ננקטים אמצעי מניעה. מספר ההתרבות עשוי להיות גבוה יותר בתנאים של אוכלוסיה צפופה, כמו אלה שנמצאים על ספינות שייט. [154] ניתן להשתמש בצורות רבות של מאמצי מניעה בנסיבות ספציפיות כדי להפחית את התפשטות הנגיף. [112]

    היו כ-96,000 מקרים מאושרים של זיהום בסין היבשתית. [149] בעוד ששיעור הזיהומים שגורר מקרים מאושרים או התקדמות למחלה הניתנת לאבחון עדיין לא ברור, [155] מודל מתמטי אחד העריך ש-75,815 אנשים נדבקו ב-25 בינואר 2020 בווהאן בלבד, בתקופה שבה מספר המקרים המאושרים ברחבי העולם היה רק ​​2,015. [156] לפני ה-24 בפברואר 2020, למעלה מ-95% מכלל מקרי המוות כתוצאה מ-COVID-19 ברחבי העולם התרחשו במחוז הוביי, בו שוכנת ווהאן. [157] [158] נכון ל-20 ביוני 2021, האחוז ירד ל-0.083%. [149]

    נכון ל-20 ביוני 2021, היו בסך הכל 178,333,628 מקרים מאושרים של זיהום SARS-CoV-2 במגיפה המתמשכת. [149] המספר הכולל של מקרי המוות המיוחסים לנגיף הוא 3,862,271. [149]


    חומרים ושיטות

    בעלי חיים וקווי תאים

    נקבות ICR, עכברי hACE2, 6-8 שבועות, נרכשו מהמרכז לחיות ניסוי רפואיות של האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (בייג'ינג, סין). בעלי חיים אלו הוחזקו במתקני החיות של האקדמיה הסינית למדעי הרפואה בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים. מחקרים על בעלי חיים הכוללים SARS-CoV-2 זן WH-09 בוצעו במתקן ביו-בטיחות בבעלי חיים ברמה 3 (BASL3) באמצעות מבודדים מסוננים HEPA והנהלים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (מספר פרוטוקול IACUC: ZH20005) של המכון למדעי בעלי חיים במעבדה, Peking Union Medical College (BLL20001). מחקרים על בני אדם ללא זיהום ויראלי אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האקדמיה הסינית למדעי הרפואה. קו תאי מקרופאג של עכברים Raw264.7, קו תאי מונוציטי אנושי THP-1, ותאי קו תאי כליות קוף-Vero E6 נרכשו ממרכז סין לאוסף תרבות סוג (בייג'ינג, סין) ותורבתו במדיום DMEM או RPMI-1640 ( Gibco, ארה"ב) עם 10% FBS.

    ריאגנטים

    Chloroquine, Z-VAD-FMK, Jasplakinolide, Lipopolysaccharides ו- Cytochalasin D נרכשו מ-Sigma-Aldrich (MO, ארה"ב). IL-4 של עכברים רקומביננטיים, IFN-γ ו-IL-4 של בני אדם רקומביננטיים, IFN-γ נרכשו מ-PeproTech (NJ, ארה"ב). Clodronate Liposomes נרכשו מ- FormuMax (CA, ארה"ב). Latrunculin A נרכש ממיליפור (MA, ארה"ב).

    בידוד של מקרופאגים מכתשי ראשוני ותאי אפיתל מכתשית מסוג II

    מקרופאגים מכתשיים ראשוניים בודדו מנוזל שטיפה ברונכואלוואולרי עכברי (BALF). בקצרה, העכברים הורדמו מיד לפני השטיפה וקנה הנשימה נותח. הריאות נשטפו חמש פעמים עם 1 מ"ל של PBS וה-BALF שנשמר עבר צנטריפוגה ב-600× ז למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. הגולה שנקטפה הושעתה מחדש במדיום שלם RPMI 1640 והודגרה על צלחת תרבית למשך 2 שעות. לאחר שעתיים, תאים לא נדבקים הוסרו על ידי כביסה עדינה עם PBS. תאי אפיתל מכתשית ראשיים (AT2) בודדו מעכברי hACE2 כפי שדווח בעבר 45 . בקצרה, עכברים הוזרמו עם 10 מ"ל PBS קר דרך החדר הימני. הריאות מולאו ב-2 מ"ל דיספאזה (BD Bioscience, ארה"ב) ואגרוז טמפרטורת ג'ל נמוכה (Sigma Aldrich, ארה"ב) לפני שרקמות הריאה הודגרו עם 2 מ"ל דיספאז ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר מכן, שפשפו רקמות הריאה והתרחיץ סונן דרך רשתות ניילון בגודל 70 מיקרומטר ו-40 מיקרון (JETBIOFIL, סין). התרחיף הסלולרי הודגרה עם אנטי-CD45 (Biolegend, שיבוט 30-F11, קטגוריה 103104), אנטי-CD16/32 (BD Pharmingen™, שיבוט 2.4G2, קטגוריה 553143), אנטי-CD31 (Biolegend, שיבוט MEC13) .3, Cat. 102504), נוגדנים אנטי-TER119 (Biolegend, שיבוט TER119, Cat. 116104) ואנטי CD104 (Biolegend, שיבוט 346–11A, Cat. 12603) ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן MyOneads® חרוזים מגנטיים TM streptavidin T1 (Thermo Fisher Scientific, Cat. 65601) נוספו לתרחיף התא כדי לא לכלול לויקוציטים, מונוציטים/מקרופאגים, תאי NK, נויטרופילים, תאי אנדותל ותאי אריתרואידים. מבחר שלילי של פיברובלסטים בוצע על ידי הדבקה על לוחות פלסטיק לא מצופים. טוהר התא הוערך באופן שגרתי על ידי ציטומטריית זרימה.

    אימונופלואורסצנטי

    תאים היו מקובעים ב-4% פרפורמלדהיד וחוללו עם 0.2% Triton X-100. תאים קבועים נחסמו ב-5% BSA והודגרו עם חלבון אנטי-Lamp2 (Abcam, Cat. ab25339, 1:200) נוגדן אנטי-SARS נוקלאוקפסיד (Abcam, Cat. Ab273434, 1:200), אנטי-Rab7 (Abcam, Cat. ab137029, 1:200) נוגדן או anti-Rab5 נוגדן (Abcam, Cat. ab18211, 1:200) ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, התאים נשטפו והודגרו עם נוגדנים משניים למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. לבסוף, השקופיות נצבעו נגדי עם DAPI והותקנו לניתוח קונפוקאלי. עוצמת האימונופלואורסצנטי נותחה על ידי תוכנת Image J 9.0.

    צביעה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימית

    רקמות הריאה מעכברים נקבעו ב-10% פורמלין, הוטמעו בפרפין וחתכו לצביעה של H&E. על פי שינויים מורפולוגיים לאחר זיהום ב-SARS-CoV-2, רקמות הריאה דורגו כקלות (1), בינוניות (2), חמורות (3) או מסכנות חיים (4). מומחה לפתולוגיה שסווור מהניסוי נתן ציון המבוסס על חדירת תאי דלקת, דלקת ריאות פרנכימאלית, דימום מכתשית ואקסודאט לומינלי או מכתשי ברונכיולרי/סימפונות.צביעה אימונוהיסטוכימית בוצעה על פי פרוטוקול כפי שתואר קודם 46 . בקצרה, קטעי הרקמות המוטבעות בפרפין הודגרו עם נוגדן אנטי-F4/80 (Santa Cruz Biotechnology, Cat. SC-52664, 1:500), anti-mucin 1 (1:200, Abcam, Cat. ab45167) , נוגדן אנטי-מוצין 5a (1:200, Abcam, Cat. ab24071), anti-mucin 5b (1:200, Abcam, Cat. ab77995) או חלבון נוקלאוקפסיד נגד SARS (Abcam, Cat. ab273434, 1:1000). ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר מכן, השקופיות הודגרו ברצף עם שני נוגדנים משניים מצומדים ב-HRP למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. השקופיות הודגרו עם ANO Reagent PPD520 או PPD570 באמצעות ערכת PANO 4-plex IHC (Panovue, סין) לפי הוראות היצרן, ולאחר מכן צביעה נגדית עם DAPI (Thermo, ארה"ב) ולבסוף הרכבה לצורך ניתוח. קטעי הריאה המוכתמים נסרקו ועברו דיגיטליות באמצעות TissueFaxs Plus System שצורפו למיקרוסקופ Zeiss Axio Imager Z2 או מיקרוסקופ קונפוקאלי של Nikon A1. עוצמת הצביעה החיובית נותחה על ידי תוכנת Image J 9.0.

    PCR בזמן אמת

    RNA כולל הוצא מתאי באמצעות Trizol (Invitrogen) והועתק ל-cDNA באמצעות ערכת שעתוק לאחור של cDNA בעלת קיבולת גבוהה (Applied Biosystems, CA). רצפי הפריימר מוצגים כדלקמן: GAPDH, 5'-ACAACTTTGGTATCG TGGAAGG-3' (חוש) ו-5'-GCCATCACGCCACAGT TTC-3' (אנטי-חוש) Gapdh, 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3' (חוש) ו-5'-TGTAGACCATGTAGTTGA GGTCA-3' (אנטי-סנס) SARS-CoV-2 פריימר1 (ORF1ab): 5'-CCCTGTGGGTTTTAC ACTAA-3' (חוש) ו-5'-ACGATTGTGCA TCAGCTGA-3' (אנטי-חוש) SARS-CoV-2 פריימר2 (נוקלאופרוטאין): 5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3' (חוש) ו-5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3' (אנטי-חוש) ACE2, 5'-CAAGAGCAAACG GTTGAACAC-3' (חוש) ו-5'-CCAGAGCCTCTCATTGTAGTCT-3' (אנטי-חוש) מס' 2, 5'-GATGTTGAACTATGTCCTATCTCC-3' (חוש) ו-5'-GAACACCACTTT CACCAAGAC-3' (אנטי-חוש) ארג1, 5'-CAAGACAGGGCTCCTTTCAG-3' (חוש) ו-5'-TGGCTTATGGTTACCCTCCC-3' (אנטי-סנס). PCR בזמן אמת בוצע באמצעות ABI QuantStudio 3 (Applied Biosystems, CA, ארה"ב). הערכים הם ממוצעים ± SD משלושה ניסויים עצמאיים שבוצעו בכפולות. השוואות סטטיסטיות בין קבוצות בוצעו באמצעות תלמיד ט-מִבְחָן. ערכים של כל הפרמטרים נחשבו מובהקים סטטיסטית בערך של פ < 0.05.

    הכלאה של RNA באתרו (RNA-ISH)

    RNA-ISH בוצע על מקרופאגים מכתשי ראשוניים שגדלו על גבי כיסויי זכוכית או קטעי רקמת ריאה בגודל 5 מיקרומטר מוטבעים בפרפין באמצעות RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v2 בהתאם להוראות היצרן (Advanced Cell Diagnostics, ארה"ב). בקצרה, תאים נקבעו ב-4% פרפורמלדהיד והודגרו עם מי חמצן ב-RT למשך 10 דקות ו-1:15 פרוטאז III מדולל ב-RT למשך 10 דקות. קטעי רקמת ריאה עברו שחרור מפראפין עם קסילן והוסרו מחדש עם אתנול מדורג, הודגרו במי חמצן ולאחר מכן הורתחו במשך 15 דקות במאגר של Target Retrieval, ולאחר מכן דגירה עם Protease Plus למשך 15 דקות ב-40 מעלות צלזיוס. השקופיות הוכלאו עם בדיקות SARS-CoV-2 בתנור הכלאה ב-40 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, והאותות הפלורסנטים הוגברו לפי פרוטוקול היצרן. התאים שגדלו על גבי כיסויי זכוכית וחלקי ריאות מוכתמים נסרקו ועברו דיגיטליות באמצעות מערכת TissueFaxs Plus שצימודה למיקרוסקופ Zeiss Axio Imager Z2. עוצמת הקרינה וקצב התאים החיובי נותחו על ידי תוכנת Image J 9.0.

    מדידת pH ליזוזומלית

    LysoSensor TM Yellow/Blue DND-160 (Thermo Fisher, ארה"ב) שימש כדי לכמת את ה-pH של ליזוזומים מקרופאגים על פי הנחיות היצרן, המציג את ספקטרום העירור הכפול תלוי-ה-pH בתאים חיים. ל- LysoSensor TM Yellow/Blue DND-160 יש קרינה צהובה בעיקרה בסביבות חומציות וקרינה כחולה בסביבה בסיסית. בקצרה, תאים טופלו ב-5 מיקרומטר LysoSensor TM Yellow/Blue DND-160 במדיום שחומם מראש למשך 5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה פעמיים עם PBS קר, התאים המסומנים הודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם 10 מיקרומטר מומנסין ו-10 מיקרומטר ניגיריצין בתמיסת הדמיה של תאים חיים (תרמו פישר, ארה"ב). עוצמת הפלורסנט נמדדה ב-Ex-330/Em-550 ו-Ex-380/Em-550. העקומה הסטנדרטית של ערך ה-pH בוצעה על ידי ערכת מאגר pH Intracellular pH (Thermo Fisher, ארה"ב). עבור החומציות היחסית של הליזוזום, מקרופאגים הודגרו עם 5 מיקרומטר LysoSensor TM Green DND-189 (Thermo Fisher, ארה"ב) למשך 30 דקות בתנאי צמיחה מתאימים. לאחר מכן הוחלף תמיסת הטעינה במדיום טרי והתאים המוכתמים נצפו ודיגיטליים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי של Nikon A1. העוצמה היחסית נותחה על ידי תוכנת Image J 9.0.

    זיהוי חומציות אנדוזומלית

    לאיתור החומציות האנדוזומלית, נעשה שימוש ב-pHrodo TM דקסטרן אדום (Thermo Fisher, ארה"ב), בעל פליטת פלואורסצנטי רגישה ל-pH העולה בעוצמתה עם עליית החומציות ובעיקרו אינו פלואורסצנטי בסביבה החוץ-תאית. בהתאם להנחיות היצרן, AMs או PAECs תורבו עם 50 מיקרוגרם/מ"ל pHrodo TM דקסטרן אדום בתמיסת הדמיה של תאים חיים למשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר שטיפה עם מדיום שחומם מראש פעמיים, התאים נותחו על ידי ציטומטריית זרימה והצטלמו על ידי מיקרוסקופ קונפוקאלי של Nikon A1 עם מסנן מתאים.

    ניסויים בבעלי חיים ופרוטוקול טיפול

    עכברי hACE2 נדבקו ב-SARS-CoV-2 (1 × 10 5 TCID50) במתן תוך קנה הנשימה ולאחר מכן מטופל עם בקרת כלי רכב (H2O או ליפוזום בקרה), CQ (35 מ"ג/ק"ג, i.p.) או CQ בשילוב עם Clodronate Liposomes (50 μL במתן תוך קנה הנשימה ו-100 μL בהזרקה לווריד, פעם אחת בלבד) פעם ביום למשך 5 ימים (נ = 4 עכברים/קבוצה). לאחר 5 ימי טיפול, עכברים הורדמו ורקמות ריאה נאספו לבדיקת PCR בזמן אמת ולצביעה היסטולוגית ואימונוהיסטוכימית.

    זיהוי כדאיות תאים

    כדי להעריך את כדאיות התא של AMs נגועים ב-SARS-CoV-2, נעשה שימוש בערכת CellTiter-Glo ® Luminescent Cell Viability Assay Assay (Promega, ארה"ב) בהתאם להוראות היצרן. בקצרה, 1 × 10 5 /well AMs הונחו בצלחות 24-בארות והודבקו ב-10 5 TCID50 SARS-CoV-2 למשך 4 שעות. לאחר מכן, התאים עברו lysed עם ריאגנט Dual-Luciferase Reporter Assay System ואות הלוציפראז נקבע על ידי luminometer microplate.

    כימות וניתוח סטטיסטי

    כל הניסויים בוצעו לפחות שלוש פעמים. התוצאות מבוטאות כממוצע ± SD כפי שצוין ומנתח על ידי סטודנטים דו-זנביים ט-מבחן או ANOVA חד כיווני ואחריו מבחן בונפרוני או מבחן Kruskal–Walis. ה P-ערך < 0.05 נחשב מובהק סטטיסטית. הניתוח בוצע באמצעות תוכנת Graphpad 8.0.


    מבוא

    נגיף הקורונה, הנקרא על שם המשטח המחוצץ דמוי הכתר שלהם, מגוונים מבחינה גנטית ויכולים להדביק מינים רבים של בעלי חיים, כולל עטלפים, חזירים, חתולים, מכרסמים ובני אדם [1]. נגיפים מחולקים ל-4 סוגים: אלפא, בטא, גמא ודלתא. ידוע כי רק נגיף קורונה אלפא ובטא מדביק בני אדם, וכתוצאה מכך פתולוגיה הנעה מתסמינים בדרכי הנשימה העליונות האופייניות להצטננות ועד למחלה מסכנת חיים בדרכי הנשימה התחתונה. נגיף הקורונה 229E ו-OC43 שגורמות הצטננות נפוצות התגלו לראשונה באמצע שנות ה-60, עם 2 נגיפים נוספים, NL63 ו-HKU1, שזוהו ב-2004 וב-2005, בהתאמה. כולם פתוגנים אנושיים בכל מקום [2]. משנת 2003 ועד אמצע 2019, 2 נגיף קורונה בטא ממקור זואונוטי גרמו להתפרצויות של מחלות נשימה חמורות: Corona Virus תסמונת נשימה חריפה (SARS-CoV) ותסמונת הנשימה המזרח התיכון קורונה (MERS-CoV). SARS-CoV הופיע באסיה בפברואר 2003 והתפשט ל-26 מדינות לפני שההתפרצות הוכלה [3,4]. למעלה מ-8,000 אנשים נדבקו בשיעור מוות של כ-10% [5]. MERS-CoV הופיע לראשונה בשנת 2012 עם מקרים מוקדמים שנבעו מסעודיה וירדן. זיהומים עדיין מתרחשים ודווחו ב-27 מדינות, כאשר רוב המקרים מבודדים לחצי האי ערב [6]. בעוד שהעברת MERS-CoV מאדם לאדם היא נדירה, שיעור התמותה במקרה גבוה מ-30% [3,7].

    בדצמבר 2019 דווח על התפרצות של חום ומחלות בדרכי הנשימה של סיבה לא ידועה בווהאן, סין [8], ועד אמצע ינואר 2020, הגורם האטיולוגי זוהה כנגיף בטא נוסף שהופיע לאחרונה, תסמונת הנשימה החמורה Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) [9,10]. בעוד שרבים הנגועים ב-SARS-CoV-2 הם א-סימפטומטיים או מפתחים מחלה קלה, עבור אחרים, ל-COVID-19 עשויות להיות תופעות המשך ארוכות טווח ובאוכלוסיות פגיעות כמו קשישים ואלה עם מצבים רפואיים בסיסיים, זה עלול לגרום לתחלואה משמעותית ולתוצאה במצוקה נשימתית קשה, אשפוז ואף מוות [11]. מאז, SARS-CoV-2 התפשט ברחבי העולם, מה שגרם לארגון הבריאות העולמי (WHO) להכריז על מחלת הקורונה החדשה, מחלת נגיף הקורונה 2019 או COVID-19, כמגיפה במרץ 2020. תוך 12 חודשים בלבד, הנגיף יש הביא למשבר בריאות עולמי גדול עם למעלה מ-81 מיליון מקרי COVID-19 ב-190 מדינות, למעלה מ-1,777,000 מקרי מוות, ושיעור מוות מוערך של כ-2.6% [12].

    מלבד התרופה האנטי-ויראלית הניתנת תוך ורידי remdesivir בחולים עם מחלת COVID-19 חמורה, אין תרופות טיפוליות המאושרות לטיפול בזיהום או במחלה של SARS-CoV-2 [13]. הערכה רב-מרכזית של 4 תרופות אנטי-ויראליות חוזרות (remdesivir, hydroxychloroquine, lopinavir ו-interferon β 1a) שדווחה על ידי WHO לא ציינה כל השפעה על תחילת התמותה הכוללת של הנשמה ומשך האשפוז [14]. ניתוחי משנה עדכניים העלו כי שימוש מוקדם בגלוקוקורטיקואידים בחולים עם רמות גבוהות באופן ניכר של חלבון C-reactive (≥20 מ"ג/ד"ל) היה קשור להפחתה משמעותית בתמותה או בהנשמה מכנית, בעוד שטיפול בגלוקוקורטיקואידים בחולים עם רמות נמוכות יותר של חלבון C-reactive. היה קשור לתוצאות גרועות יותר [15]. ככל שמגפת ה-SARS-CoV-2 נמשכת, יש צורך דחוף בפיתוח תרופות אפקטיביות להגבלת התפשטות נוספת. ניסיונות מוקדמים לזהות תרופות אפקטיביות ל-COVID-19 התמקדו בעיקר במאמצי שימוש מחדש בתרופות, שבהם תרופות קיימות מתקדמות קלינית או משווקות נבדקות לאיתור פעילות אנטי-ויראלית נגד SARS-CoV-2 במבחנה במערכות זיהום תאי. בעוד שמסכים כאלה הניבו להיטים מסקרנים, התעוררו שאלות סביב הרלוונטיות הפיזיולוגית והפתולוגית של הדבקת שורות תאים מונצחות שמקורן במקורות שאינם ריאתיים או במערכת העיכול. שאלות ספציפיות התעוררו סביב מנגנוני התקשרות וכניסה ויראלית לתאים אנושיים אשר עשויים להשתנות בתאים ממקורות רקמה שונים. בנוסף, לשורות הסקר עשויות להיות מכונות תוך-תאיות מוגבלות, כגון אנזימים מקטבולים, שהם מרכיב מפתח בתא הזיהום העיקרי בחולים אנושיים. לכן ישנה חשיבות עליונה לשפר את ההבנה שלנו לגבי האינטראקציות המולקולריות והתאיות המרכזיות הכרוכות בזיהום SARS-CoV-2 על מנת לפתח כלים מתאימים במבחנה לתמיכה במאמצי גילוי תרופות נוכחיים ועתידיים.

    היקף/ביקורות קודמות

    מטרת מאמר זה היא לסקור היבטים מרכזיים של הביולוגיה של SARS-CoV-2, לרבות גורמים הקובעים של כניסת וירוסים למספר שורות תאים ומערכות המתירות לצמיחת וירוסים, טרופיזם של רקמות וגנים מארח המשפיעים על כניסה, התפשטות וייבוא ​​וייבוא ​​פרו-תרופות נוקלאוטידים. והמרה ל-SARS-CoV-2, במטרה להקל ולאפשר מאמצי גילוי תרופות.

    לסקירה מקיפה יותר של מנגנוני כניסה ועיבוד פרוטאזות בנגיף קורונה, הקורא מופנה למאמרים אחרונים אחרים [16-19]. סקירות מקיפות זמינות על מעכבי MERS-CoV [20], SARS-CoV [21,22] ו-SARS-CoV-2[19]. אנו דנים במסכי SARS-CoV-2 לשימוש חוזר בסעיף "מנגנוני כניסה ופרוטאזות".

    מנגנוני כניסה ופרוטאזות

    עד כה, בדיקה ראשונית לזיהוי תרופות אנטי-וירוסיות מסוג SARS-CoV-2 השתמשה במידה רבה בקו תאי הכליה של הקוף הירוק האפריקאי Vero E6 כתא המארח למבחני עיכוב אפקט ציטופטי (CPE). בנוסף לחסר בביטוי של אנזים הממיר אנגיוטנסין 2 (ACE2) ו-TMPRSS2, מנגנוני ספיגה לא-ספציפיים של נגיפים אנדוציטים אחראים לכניסה ויראלית ל-Vero E6 ולמגוון סוגי תאים אחרים [23-26]. לפיכך, נמצא כי מגוון רחב של מולקולות המווסתות מסלולי התבגרות אנדוזומלית-ליזוזומלית ואוטופגיה מפגינות פעילות אנטי-ויראלית חזקה בתאי Vero E6, שאולי לא תתורגם לתאי אפיתל ריאות ראשוניים. זה מעלה את האפשרות שהעיכוב האנטי-ויראלי שמפגין רבות מהתרכובות הללו נגד SARS-CoV-2 במסכי Vero E6 עשוי להיות פעילות חוץ גופית ספציפית לתאים אנדוציטיים מאוד וייתכן שלא תהיה רלוונטית או ניתנת לתרגום כתרופות טיפוליות של SARS-CoV-2. כפי שיפורט בהמשך, הוכח כי נגיף SARS-CoV-2 מספק RNA ויראלי ישירות על פני קרום הפלזמה ללא מעורבות משמעותית של קליטה אנדוציטית.

    זיהום של תאי אפיתל ריאות יונקים על ידי SARS-CoV-2, כמו גם על ידי נגיפים אחרים, מתחיל בקשירה של הנגיף דרך חלבון הספייק שלו לקולטן ספציפי על פני התא. הקולטן הסלולרי ל-SARS-CoV-2, ולנגיף SARS-CoV הקשור, הוא ACE2 [16,27,28] אנושי, המתבטא על תאי אפיתל של הריאה והמעי, ובמידה פחותה, ב- כליות, לב, שומן ורקמות רבייה של זכר ונקבה כאחד [29-35]. הקישור לקולטן מלווה בהפעלה של חלבון הספייק באמצעות ביקוע פרוטאוליטי על ידי פרוטאז מארח ליד המפגש בין תחומי S1 ו-S2 שלו [17,36]. החדרת ה-N-terminus של תחום S2 שזה עתה שוחרר לתוך קרום התא מובילה לאיחוי של הממברנות הנגיפיות והתאיות, וכתוצאה מכך העברה של ה-RNA הנגיפי לתוך הציטופלזמה של התא המארח, שם יכולה להתרחש שכפול ויראלי [17,36].

    בעוד שהשלבים המתוארים לעיל נחשבים חיוניים להדבקה של תאי מארח על ידי נגיף קורונה, תיאור זה משמיט היבטים מרכזיים של תהליך הכניסה הנגיפי, דהיינו אופי הפרוטאזות המארח האחראיות להפעלת (או הכנה) של חלבון הספייק לאיחוי. המיקום הסלולרי של אירוע ההיתוך עצמו. עבודה על נגיפים מרובים במהלך 20 השנים האחרונות, ואושרה במידה רבה עבור SARS-CoV-2 במהלך החודשים האחרונים, מראה כי נגיפים חודרים לתאי מארח דרך 1 מתוך 2 מסלולים נפרדים: (i) מסלול פני התא לאחר הפעלה על ידי פרוטאזות סרין כגון TMPRSS2 או (ii) המסלול האנדוציטי בתוך התאים האנדוזומליים-ליזוזומליים כולל עיבוד על ידי קתפסינים ליזוזומליים (איור 1) [16-18]. מחקר חדש טוען שנגיף הקורונה משתמש במסלול אקסוציטוזיס ליזוזומלי לשחרור [37]. התרומה של כל מסלול בסוג תא נתון תלויה במידה רבה בביטוי של פרוטאזות, בפרט TMPRSS2. כאשר TMPRSS2 (או פרוטאזות סרין אחרות כגון TMPRSS4 או פרוטאז דמוי טריפסין בדרכי הנשימה [HAT]) בא לידי ביטוי, מסלול הכניסה המוקדם עדיף, בעוד שבהיעדר פרוטאז זה, הנגיף מסתמך על המסלול המאוחר הכולל אנדוציטוזיס והפעלה על ידי cathepsin L (CTSL) [27,38].

    חלבון ספייק מעיל ויראלי נקשר ל-ACE2, ובמקרים מסוימים, אולי NRP1, על תאים מגיבים. חלבון ספייק נגיף מעובד על ידי TMPRSS2 ופרוטאזות סרין אחרות המאפשרות כניסת פני תאים או עובר אנדוציטוזה לאנדוזומים שבהם ספייק מעובד על ידי CTSL בליזוזום. RNA ויראלי המשוחרר מכניסה מתווכת TMPRSS2 או שחרור אנדוזום משוכפל כעותקי גנום חלקיים ושלמים ומתורגם במיון ליצירת ויריון SARS-CoV-2 חדשים. עיבוד של חלבון ספייק על ידי פורין מתרחש לפני שחרור נגיפים חדשים לסביבה החוץ-תאית. ACE2, אנזים הממיר אנגיוטנסין 2 CTSL, cathepsin L ER, reticulum אנדופלזמי NRP1, Neuropilin 1 SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה קשה וירוס קורונה 2.

    ההבנה של איזה מסלול כניסה ויראלי נפוץ בסוגי תאים ספציפיים היא חיונית לא רק להבנת ביולוגיה של נגיף הקורונה, אלא גם לפרשנות נכונה של בדיקות גנטיות ומולקולות קטנות מבוססות תאים. עד כה, מסכים שמטרתם לזהות תרופות משווקות או מתקדמות קלינית למטרות חוזרות פוטנציאליות לטיפול ב-COVID-19 הסתמכו על שימוש בשורות תאי אפיתל כליות מונצחות כמו Vero E6 (קוף ירוק אפריקאי) ו-293T (אדם עוברי) [39] –42]. מסכים כאלה הניבו מספר כניסות הידועים כחוסמות או פוגעות באנדוציטוזיס או בהבשלה אנדוזומלית [39,40,42,43]. זה לא מפתיע מכיוון שתאי Vero E6 ו-293T אינם מבטאים את פרוטאז פני התא TMPRSS2, לכן, זיהום נגיף הקורונה בתאים אלה תלוי בנתיב הכניסה המאוחר בתיווך האנדוציטי/קתפסין. לפיכך, חומרים המפריעים למסלול זה, לרבות מעכבי קתפסין, גורמים המונעים חומצה אנדוזומלית (בה הקטפסינים תלויים בפעילותם), ומעכבי התבגרות אנדוזומלית (למשל, מעכב PIKfyve apilimod) יכולים לחסום כניסה ויראלית לתאים אלו [ 38,44,45]. חשוב לציין, ביטוי הטרולוגי של TMPRSS2 בתאי Vero E6 ו-HeLa מבטל את היעילות הפרמקולוגית של מעכבי cathepsin על ידי הפעלת מסלול הכניסה הנגיפי של פני התא [38,46]. באופן דומה, הפעלה מוקדמת של הנגיף עם טריפסין פרוטאז סרין מאפשרת גם את מסלול הכניסה של פני התא, אפילו בתאים שאינם מבטאים TMPRSS2 [45,47,48]. בהתאם לתצפיות אלו, תאים המבטאים TMPRSS2 באופן אנדוגני, כולל תאים שמקורם באפיתל הריאה והמעי, רגישים גם לכניסת נגיף קורונה דרך מסלול פני התא. בתאים אלו מעכבי קתפסין יעילים רק באופן חלקי, מעכבי TMPRSS2 כגון camostat ו-nafamostat יעילים משמעותית יותר, ושילוב של 2 סוגי מעכבי פרוטאז יעיל באופן מקסימלי במניעת הידבקות בקורונה [27,38,49-52]. נתונים אלה מצביעים על כך שנגיף קורונה יכול להיכנס לתאים אלה באמצעות שני המסלולים, עם העדפה למסלול פני התא.

    למרות הנתונים הסלולריים הללו, זה עדיין עניין של ויכוח אם עיכוב אינדיבידואלי של פני התא או מסלולים אנדוציטיים יספקו תועלת טיפולית נגד COVID-19. SARS-CoV-2 מדביק מגוון רחב של סוגי תאים [46,53,54], אם כי נראה הגיוני לשער שתאי אפיתל של דרכי הנשימה והעיכול הם מהראשונים לפגוש את הנגיף בסביבה קלינית. מחקרים in vivo עם נגיף הקורונה הקשור SARS-CoV תומכים ברעיון שמעכבים של מסלול הכניסה לפני השטח של התא עשויים להיות מגנים לפחות חלקית. חסימה גנטית [55] ותרופתית [56] של TMPRSS2 סיפקה הגנה חלקית מפני SARS-CoV במודלים של זיהום של עכברים.במחקר האחרון, מעכב הקתפסין הרחב SMDC256160 לא סיפק שום תועלת, לא לבד ולא בשילוב עם קמוסטט. מחקרים נוספים יידרשו, במיוחד במודלים של זיהום SARS-CoV-2, כדי להגדיר עוד יותר את התרומה של כל מסלול כניסה ויראלי לפתולוגיה של COVID-19. יש לציין כי לאחרונה הוצע כי חסימת כניסה של SARS-CoV-2 עשויה לדרוש עיכוב הן של פני התא והן של המסלולים האנדוציטיים [57].

    TMPRSS2 ופורין בכניסה למשטח התא

    הגן TMPRSS2 מקודד לסוג II טרנסממברנלי סרין פרוטאז (TTSP) שהתגלה במקור לפני יותר מ-2 עשורים [58] ולאחר מכן הוכח כמווסת על ידי אנדרוגן ומתבטא מאוד באפיתל הערמונית [59]. TMPRSS2 ממוקם לממברנת הפלזמה באמצעות סליל טרנסממברני במעבר יחיד ליד קצה ה-N שלו. האנזים יכול גם לעבור חיתוך אוטומטי ב- Arg255 ויוצר צורה מופרשת של 32 kDa של הפרוטאז [60]. עכברים חסרי הפרוטאז המקודד TMPRSS2 (TMPRSS2[-/-]) לא מראים פנוטיפ חריג מובחן, מה שמצביע על כך שהפרוטאז אינו ממלא תפקיד חיוני לא מיותר [61], תצפית שאפשרה חקירה מאוחרת יותר של תפקידו של TMPRSS2 במודלים של עכברים של נגיף קורונה. מַחֲלָה.

    ההבנה הנוכחית שלנו לגבי הקשר בין TMPRSS2 וזיהום SARS-CoV-2 ראתה התקדמות מהירה בחודשים הראשונים מאז הופעת SARS-CoV-2. חלק גדול מההתקדמות הזו נבנה על יותר מעשור של מחקרים החל מהראיה הראשונה שביטוי TMPRSS2 מתאם עם זיהום SARS-CoV ברקמת הריאה ומוביל להפעלה של חלבון הספייק, המאפשר היתוך ממברנה [62]. מחקרים המשתמשים במבחני היתוך תאים הצביעו על כך שביטוי TMPRSS2 על תאי מטרה, במקום תאים מייצרים וירוסים, הוא קריטי להפעלת חלבון ספייק, תומך באילוצים מרחביים וזמניים על פעולת TMPRSS2 בממברנת הפלזמה במהלך השלבים המוקדמים של כניסה ויראלית משטח התא. שני אתרי מחשוף על ספייק SARS-CoV - R667, הממוקם באתר המחשוף S1/S2, ו-R797, הממוקם באתר המחשוף של S2' - הוצעו להיות אתרי פעולה רלוונטיים של TMPRSS2, כמו גם פרוטאזות סרין אחרות שיכולים לקדם את חלבון הספייק בתרבית תאים, כגון טריפסין ו- HAT. מוטציה של R797 ב-S2' מבטלת את ההפעלה התלויה ב-TMPRSS2 של חלבון הספייק, ואתר זה שמור מאוד על פני נגיפים, מה שמצביע על כך שהוא רלוונטי מבחינה תפקודית לכניסת פני תא תלוי TMPRSS2 ב-SARS-CoV-2.

    פרו-חלבון convertase פורין ידוע מזה זמן רב כממלא תפקיד בכניסה ויראלית, ונתונים עדכניים תומכים בתפקיד של אנזים זה, במיוחד בכניסה משטח התא בתיווך TMPRSS2. עיבוד של חלבון הספייק על ידי פורין באתר המחשוף S1/S2 מתרחש לאחר שכפול ויראלי בתא הביניים של הרשת האנדופלזמית Golgi (ERGIC) [63]. מדגיש את התפקיד המורכב של פורין בהיתוך וכניסה ויראלי, אתר ביקוע פורין S1/S2 קיים ב-SARS-CoV-2 ו-MERS אך לא ב-SARS-CoV [64]. יתר על כן, אתר SARS-CoV-2 furin S1/S2 אובד במהירות עם מעבר בתאי Vero E6 [65], והוכח כי מבודד זן SARS-CoV-2 מתון יותר ZJ01 איבד גם אתר זה [30]. פורין יכול גם לבקע את חלבון הספייק בהיתוך המפעיל את אתר S2' במהלך ביוגנזה ב-MERS-CoV ו-SARS-CoV [30,36,65-67]. בסך הכל, נתונים זמינים עדכניים תומכים במודל סביר לעיבוד ספייק SARS-CoV-2, שבו מחשוף בתיווך פורין באתר S1/S2 מקדם את חלבון הספייק במהלך הביוגנזה, ומקל על הפעלה לאחר מכן לאיחוי ממברנה על ידי אירוע חיתוך שני ב-S2 על ידי TMPRSS2 בעקבות קישור קולטן ACE2 לתאי מטרה [46,50].

    לאחרונה הוכח שהקולטן ל-VEGF-A Neuropilin 1 (NRP1) הוא קולטן של גורם מארח לפפטיד SARS-CoV-2 ספייק מפוצל בפורין [68-71]. חסימה של NRP1 מפחיתה את הזיהום והכניסה, ושינוי באתר הפורין מוביל לאובדן התלות ב-NRP1. מחיקה של פפטיד הפורין בספייק מובילה לשכפול מופחת ב-Calu3, לשכפול מוגבר ולשיפור הכושר ב-Vero E6, ולמחלה מוחלשת במודל של מחלת פתוגנזה של אוגר [70].

    לאחרונה, עדויות in vivo לרלוונטיות של TMPRSS2 במודלים של עכברים לזיהום SARS-CoV ו-MERS-CoV סופקו מעכברי TMPRSS2(-/-) שהראו חומרת מחלה מופחתת [55]. מחקרי נוק-דאון של TMPRSS2 shRNA מספקים ראיות לתפקיד ספציפי ולא מיותר בזיהום SARS-CoV-2 [72].

    קתפסינים ליזוזומליים ואנדוציטוזיס

    בעוד שהעדויות המתוארות לעיל מבהירות את תפקידם של TMPRSS2 ופרוטאזות סרין אחרות בהפעלת חלבון ספייק הקורונה עבור היתוך ממברנות פלזמה, מחקרים במבחנה באמצעות מערכות שונות של תרבית תאים הדגימו מסלול חלופי אנדוזומלי-ליזוזומלי לכניסה ויראלית. מחקרים מוקדמים הדגימו את הרגישות של שכפול SARS-CoV בתרבית תאים לחומרים ליזוזומוטרופיים, ולאחר מכן מחקרים נוספים המנתחים את תפקידם של קתפסינים לעיבוד והפעלת הספייק לאיחוי ממברנה. הזמינות של מעכבי קתפסין חזקים וספציפיים בעלי מולקולה קטנה הייתה המפתח לניתוח האירועים המולקולריים המעורבים במסלול זה ולייחס ההשפעה התפקודית הרלוונטית ל-CTSL, 1 מתוך 11 קתפסינים בבני אדם [73,74]. מחקרים נוספים מיקמו את האתר של מחשוף CTSL על חלבון ספייק SARS-CoV ל-T678, 11 חומצות אמינו קצה קרבוקסי ל-R667 של אתר המחשוף פורין. התצפית כי אתר הביקוע של ה-CTSL ממוקם 120 חומצות אמינו במעלה הזרם של אתר S2' המבקע על ידי TMPRSS2 חושפת פער בהבנתנו את האירועים המולקולריים המעורבים במסלול הכניסה האנדוזומלי. מחקרים קודמים הציעו אפשרות של פרוטאז אחר שעשוי להתפצל ב-S2' בסביבת ה-pH הנמוכה של אנדוזומים/ליזוזומים כדי להפעיל באופן מלא את פוטנציאל היתוך הממברנה של הספייק [36], או לחילופין, הבדלים בהרכב השומנים בין ממברנות הפלזמה ואנדוזומליות. ממברנות ליזוזומליות עשויות להפוך את האחרון לנגיש יותר לאיחוי ויראלי [75]. למרות הפער הזה בהבנה הנוכחית שלנו של כניסה ויראלית אנדוציטית, ברור שנגיף קורונה בכלל, ו-SARS-CoV-2 בפרט, מסוגלים לבסס זיהום חזק באמצעות כניסה אנדוזומלית במערכות נפוצות של תרבית תאים במבחנה.

    טרופיות/ביטוי של קו תאים

    עם המורכבות של מנגנוני כניסה מרובים של SARS-CoV-2, הבחירה של שורת תאים אופטימלית להערכת וסריקה של תרכובות היא הכרחית, במיוחד במחקרים המחפשים מנגנוני פעולה אנטי-ויראליים רחבים מעבר לעיכוב של החלבונים הלא-מבניים הנגיפיים. לשם כך דווחו מחקרים כדי להבין טוב יותר את הטרופיזם התאי של הנגיף. וירוס פסאודוטיפוס של וירוס סטומטיטיס (VSV) הנושא חלבון ספייק SARS-CoV-2 או חלבון ספייק SARS-CoV ופאנל של קווי תאים מאופיין היטב של בני אדם ובעלי חיים שימש כדי לקבוע את הטרופיזם הרחב יותר של הנגיף [46]. הספקטרום של שורות תאים הרגישות לזיהום בנגיף היה דומה עבור חלבון ספייק SARS-CoV ו-SARS-CoV-2 עם כניסה נתמכת ב-A549, BEAS-2B, Calu-3, H1299, 293T, Huh7, Caco-2, Vero E6, וסוגי תאים MDCK2 [27]. מאמצים נוספים להבנת הטרופיזם הנגיפי כללו ניטור הדבקות של הנגיף במשך 120 שעות עם ריבוי של 0.1 זיהום (MOI) של SARS-CoV-2 HKU-001a על פני פאנל של 9 קווי תאים אנושיים ו-11 קווי תאים לא אנושיים [53]. בדומה לתוצאות שנצפו עם וירוס פסאודוטיפוס, הזיהום החזק ביותר מבין שורות התא האנושיות נצפה עבור תאי Calu-3 (ריאתי) ו-Caco-2 (מעיים) עם זיהום שנצפה גם ב-Huh7 (כבד), 293T (כלייתי) , ובמידה פחותה, תאי U251 (נוירונים). בין 11 סוגי התאים שנמצאו מתירים לזיהום במחקר, CPE נצפה 120 שעות לאחר הדבקה רק ב-Vero E6 ו-FRhK4 (כליות רזוס), עם נזקים הכוללים עיגול תאים, ניתוק, ניוון ויצירת סינציטיום. אפילו עד 7 ימים לאחר ההדבקה, CPE לא נצפה בתאי Calu-3, Caco 2, LLCMK2, PK-15 ו-RK-13 ​​עם SARS-CoV-2.

    ב-MOI גבוה יותר של אחד, מחקר של שינויים קינטיים של פרוטאומיקה בזיהום הראה גם שכפול ויראלי וגם CPE בתאי Caco-2 [76]. על ידי ניטור רמות ביטוי החלבון, מחברי המחקר הזה הבחינו שזיהום מביא לעיצוב מחדש של מסלולים תאיים מרכזיים, כגון תרגום, שחבור, חילוף חומרים של פחמן ומטבוליזם של חומצות גרעין. בדיקה זו שונה על ידי הורדת ה-MOI מ-1 ל-0.01 והגדלת זמן הדגירה מ-24 ל-48 שעות כדי לאפשר מספר מחזורים של שכפול ויראלי כדי לסנן לאנטי-ויראלים במבחן הדמיה בעל תוכן גבוה [77]. ממסך של 5,632 תרכובות כולל יותר מ-3,400 מועמדים קליניים, המחברים הדגישו 6 תרכובות שדווחו בעבר כפעילות נגד SARS-CoV-2, SARS-CoV או MERS במבחנים אנטי-ויראליים ב-Vero E6, Calu-3, או תאי BHK21 (פיברובלסט של כליות אוגר), כאשר דפוס העיכוב מתאים יותר לתוצאות בתאי Calu-3 אנושיים מאשר בתאי Vero E6 ו-BHK21 שאינם אנושיים. לדוגמה, camostat ו-nafamostat, מעכבי TMPRSS2, הממלאים תפקיד במסלול פני התא לכניסה תאית ויראלית, נמדדו כחזקים פי 100 מול SARS-CoV-2 בתאי Caco-2 מאשר בתאי Vero E6. עם זאת, תרכובות כמו remdesivir, lopinavir ו-mefloquine היו עקביות יחסית בין סוגי התאים.

    תוך התוויית המנגנונים השונים המעורבים בכניסה ובזיהום של SARS-CoV-2, Dittmar ועמיתיו יישמו מבחן הדמיה בעל תוכן גבוה כדי להשוות את הפעילות האנטי-ויראלית של פאנל של כ-3,000 תרכובות [39]. פחות מ-1% זיהום נצפה במספר סוגי תאים כולל A549, Calu-1, Huh7, HepG2, HaCaT, IMR90, NCI-H292, CFBE41o ו-U2OS, אולם, זיהום חזק נצפה בקו תאי הפטוציטים האנושיים Huh7.5 , תאי Calu-3 שמקורם בריאה ותאי Vero CCL81. בין 3 סוגי התאים, תרכובות עם מנגנוני פעולה שונים נצפו בעלות פעילות אנטי-ויראלית משתנה. לדוגמה, מעכבי כניסה אנדוזומליים, כגון מעכב cathepsin Z-FA-FMK ו-PIKfyve inhibitor apilimod, היו פעילים בתאי Huh7.5 ו-Vero E6 אך לא בתאי Calu-3. לעומת זאת, camostat, מעכב של פרוטאז קרום הפלזמה TMPRSS2, היה פעיל בתאי Calu-3 אך לא בתאי Huh7.5 ו-Vero E6, מה שמדגיש עוד יותר את החשיבות של הבנת יכולת התרגום של מודל תאי של זיהום.

    טרופיזם ויראלי של SARS-CoV-2 עבור סוגי תאים שונים משקף ככל הנראה ביטוי דיפרנציאלי של חלבוני מארח מפתח המעורבים בהתקשרות וכניסה נגיפית. טבלה 1 מסכמת את נתוני הביטוי הזמינים לציבור עבור הקולטן הסלולרי SARS-CoV-2 ACE2 ועבור 5 פרוטאזות המעורבים בהיתוך וכניסה ויראלי (פורין, TMPRSS2, CTSL, אלסטאז וטריפסין). בעוד ש-CTSL מתבטא בכל הקווים שנבדקו, רמות ACE2 ו-TMPRSS2 משתנות, מה שמסביר את השימוש בביטוי הטרולוגי של גנים אלה במחקרים קודמים של Vero E6 וקווי תאים אחרים.

    ייבוא ​​והמרה של נוקלאוטידים/צדדים

    סקר שורות תאים להערכת תרופות פרו-נוקלאוטידים ונוקלאוזידים כמעכבים של RNA פולימראז ויראלי תלוי RNA (RdRp) חייבת לשקול את יכולתם לייבא ולהמיר תרכובות למטבוליטים פעילים של נוקלאוזיד טריפוספט (NTP) [78]. Remdesivir [79-81] היא תרופת פרוטיד פוספורמידאט [82] הדורשת ייבוא ​​והמרה בתאי מארח כדי לעכב את שכפול SARS-CoV-2 RdRp החיוני.

    קליטה תאית של נוקלאוזידים מותאמים תלויה במידה רבה בביטוי של טרנספורטרי ממברנה מרוכזים (cNTs) או טרנספורטרי קרום שיווי משקל/מקל (ENTs) [83,84]. המרה תוך תאית לנוקלאוזידים לנוקלאוטידים מתווכת על ידי זרחון קינאז תאי, וביטוי לקוי יכול להפחית את העוצמה האנטי-ויראלית [39,85,86].

    כמה תרופות פרו-תרופות דורשות ביטוי והמרה אנזימטית על ידי אסטראזות וקתפסין A ליזוזומלי.

    לכן, בדקנו 5 שורות תאים על יכולת זרחן אדנוזין ריבונוקלאוזידים MK-0608 ו-GS-441524 (נוקלאוזיד אב של remdesivir) בהשוואה ל-remdesivir prodrug GS-5734 והדגמנו כי לתאי מארח יש יכולת דיפרנציאלית להפעלת תרופה (איור 2). שורות תאים Hepatocyte HepG2 ו-Huh7 הציגו הפעלה טובה יותר באופן משמעותי של תרופת מונופוספט פוספורמידיט GS-5734 מאשר תאי כליה Vero E6 של קוף ירוק אפריקאי, תאי כליה חתוליים של Crandell-Rees (CRFK), או תאי ריאה Calu-3 אנושיים עקב ביטוי מוגבר בקתפסין A. הפטוציטים בהשוואה לתאים חוץ-כבדיים [87].

    ריכוז ה-NTP התוך תאי של 24 שעות של מובילים לתרופה אנטי-ויראלית של אדנוזין (MK-0608, Gilead Sciences remdesivir prodrug GS-5734, ו-Gilead Sciences remdesivir נוקלאוזיד אב GS-441524) לאחר דגירה ב-1 מיקרומטר עם מחסור בתאים E6 של Verparent ממחיש את החסר של תא Verparento. להמרה לצורת הטריפוספט הפעילה בהשוואה לשורות תאים אחרות שנחקרו. NTP, נוקלאוזיד טריפוספט.

    תאים ראשוניים/מערכות מודל

    קווי סלולרי מספקים שיטה מהירה למסך ולאסוף נתונים בצורה תפוקה גבוהה, אך ישנן מגבלות ביכולת התרגום שלהם. מערכות תרבית תאים ראשוניות עשויות לדגמן בצורה מדויקת יותר את הפיזיולוגיה התאית הרלוונטית. תובנות לגבי מהלך הזיהום של SARS-CoV-2 נלקחו באמצעות תוצאות ריצוף תאים בודדים מהאטלס האנושי (אנשים לא נגועים) כדי לזהות ביטוי תעתיק של קולטנים ויראליים. צביעת חלבון של קולטנים אלה היא אינדיקטור טוב יותר לביטוי פני השטח בפועל, אך נתונים כאלה דלילים כיום. ניתוח של RNA מדגימות רקמה של חולה נגוע מספק תמונת מצב בזמן שלעתים קרובות איננו יודעים את העיתוי של תחילת הזיהום. מערכות מודל במבחנה ראשוניות מאפשרות בדיקת השערות ברקמות אנושיות ומאפשרות לנו לאסוף מידע זמני על ביטוי גנים/חלבון.

    מחקרים רבים דיווחו על רמות גבוהות של ביטוי משותף של ACE2 ו-TMPRSS2 בתאי AT2 בריאות תוך שימוש בנתונים ממאגרי מידע ציבוריים וכריתות ריאות [29,88,89]. תרביות ממשק אוויר-נוזל ריאות (ALI) שמקורן באזורים שונים של הריאה מאנשים בריאים הראו את הביטוי המשותף הגדול ביותר של ACE2 ו-TMPRSS2 בתאי הפרשה חולפים של ענפי הסימפונות. כמו כן, הוכח כי קיים ביטוי משולש של ACE2, TMPRSS2 ו-FURIN כאשר מסתכלים על פני רקמת ריאה, עם העדפה לביטוי משותף של לפחות 2 מהקולטנים [29]. במחקר שנערך לאחרונה, נעשה שימוש ברצף RNA של תא בודד (sc) כדי לעקוב אחר RNA ויראלי על בסיס כל תא לאורך מהלך זמן של תאי אפיתל נגועים בסימפונות (מודל ALI) ומצא שהמטרה העיקרית של SARS-CoV- 2 בדרכי הנשימה העליונות הם תאי ריאה ריסים, התאים האחראים על הסרת ריר וחלקיקים זרים מהריאה. ככל שההדבקה מתקדמת, הנגיף הדביק לאורך זמן תאי בסיס ותאי מועדון, מה שהם אישרו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים. בנוסף, נצפתה ויסות-על של אינטרפרונים מסוג I ו-Typ III (IFNs), IL-6, והכימוקינים CXCL9, CXCL10 ו-CXCL11 (חשוב לגיוס של תאי T/NK) בתאים נגועים ואינטרפרון רחב. ויסות עלייה של גנים (ISG) בתאים נגועים כמו גם בתאי אורח [90]. בעוד שנתוני רצף תאים בודדים וריצוף גרעין בודד מספקים פרטים רבים על הביטוי של תעתיקי RNA, מחקר ישן יותר מאשר צביעה משותפת של חלבון ACE2 ו-TMPRSS2 במקטעי ריאות על ידי אימונוהיסטוכימיה [91].

    לעומת זאת, אחרים דיווחו כי לתאי אפיתל באף יש את הביטוי הגבוה ביותר של ACE2 בדרכי הנשימה. בנוסף, על ידי סירוק של מאגרי מידע זמינים לציבור, נמצא שלדרכי הנשימה העליונות יש את הביטוי הגבוה ביותר של גנים המתואמים ACE2, וגנים עם תפקוד חיסוני מולד מיוצגים באופן לא פרופורציונלי [92]. באופן ספציפי, הם דיווחו כי לתאי גביע האף יש את הביטוי הגבוה ביותר של הגנים החיסונים הללו.

    בעוד שתרביות ALI ריאות מייצגות מודל ראשוני רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית בשל חשיפת הממברנה האפיקאלית לאוויר, לאורגנואידים של הריאות יש שימוש בחקר SARS-CoV-2. בדומה לתרביות ALI ריאות, אורגנואידים של הריאה מופקים מתאי גזע בסיסיים של הריאה (בוגרים) או תאי גזע פלוריפוטנטיים (עובריים) וגדלים במטריצה ​​תומכת תלת מימדית [93]. היתרון בשימוש בתרביות אורגנואידיות הוא שניתן להפיץ את תאי הגזע ברציפות ולאחר מכן להתמיין סופנית לסוגי תאים בוגרים יותר של האפיתל, מה שמאפשר התרחבות והתמיינות מהירה יותר של תאים ראשוניים למספרים גבוהים מספיק כדי לתמוך בהקרנת תפוקה גבוהה יותר בהשוואה לתרביות ALI. , שלוקח 21 עד 28 ימים להגיע לבשלות. קבוצה אחת דיווחה על שימוש באורגנואידים ריאות כדי לסנן בהצלחה את ספריית התרופות של Prestwick שאושרה על ידי מינהל המזון והתרופות (FDA) עם פסאודו-וירוס SARS-CoV-2 המביע לוציפראז [94]. בנוסף, הם אישרו 3 מתוך 4 פגיעות באורגנואידים של המעי הגס שמקורם ב-hPSC.

    בעוד שהמשטח הרירי הוא ככל הנראה אתר הכניסה של SARS-CoV-2, בדיקה של רקמות אחרות גילתה שרמות גבוהות של ביטוי משותף של ACE2/TMPRSS2 קיימות באנטרוציטים של המעי הגס והמעי הגס, והמעיים עשויים להיות בעלי ביטוי גבוה יותר. של קולטנים אלה מאשר הריאה [30,31]. התצפית שחלק מחולי COVID-19 סובלים ממצוקה במערכת העיכול לפני התפתחות תסמינים נשימתיים וכן במהלך התקדמות המחלה עשויה להצביע על נתיב העברת צואה-פה [95,96] עדויות התומכות בכך נסקרו לאחרונה [97,98]. באופן דומה, זיהום/מצוקה במערכת העיכול נצפתה בעבר עבור נגיף הקורונה SARS ו-MERS הקשורים קרובים [99,100]. נתוני התמלול נתמכים על ידי דגימות אנדוסקופיות של חולה COVID-19 (ושט, קיבה, תריסריון ופי הטבעת) שהציגו צביעה של הקולטן ACE2 בתאי האפיתל של מערכת העיכול, אך לא באפיתל הוושט [101].

    מחקרים קשרו את הפנוטיפ של מערכת העיכול שנצפה לביטוי של תאי ACE2+/TMPRSS2+ במעיים, עם רמות הביטוי הגבוהות ביותר במעי, ואחריו המעי הגס. באופן חד משמעי יותר, הדבקה של אורגנואידים במעי עם SARS-CoV-2 הצליח, והם תמכו בשכפול של הנגיף כאשר אנטרוציטים הם סוג התאים העיקרי הממוקד [31]. מעניין לציין כי IFN מסוג III, אך לא IFN מסוג I, היה מווסת עלייה בעקבות זיהום של קולונואידים עם SARS-CoV-2, מה שמרמז על כך שציטוקין זה עשוי למלא תפקיד מגן בזיהום זה [102].

    המודל האורגני של המעי אפשר אפיון נוסף של כניסה ויראלית. באמצעות Pseudovirus VSV-SARS-CoV-2 (המבטא את חלבון הספייק SARS-CoV-2), הוכח ש-TMPRSS2 ו-TMPRSS4 נחוצים שניהם לכניסה fusogenic לתוך enterocytes התריסריון [103]. בנוסף, המחברים צפו בזיהום מועדף של הממברנה האפיקאלית של האנטוציטים, והדמיה הציעה הרכבה ויראלית מקוטבת ושחרור מהממברנה האפיקלית. נתונים אלה מדגימים כיצד ניתן לנתח עוד יותר נתונים מתאי/רקמה ראשוניים כאשר משוכפלים במערכת מודל ראשוני רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.השימוש במערכות מודל ריאות ומעי ראשוניות מתגלה כרלוונטי מאוד למחקר עבור SARS-CoV-2 מכיוון שהם משכפלים בצורה מדויקת יותר את ביטוי הקולטן ואולי את התגובות הפיזיולוגיות שנראו in vivo.

    יש לציין כי מערכות ex vivo אחרות, כגון השתלות רקמות, שימשו לחקר זיהומים נגיפיים בדרכי הנשימה וסביר להניח שניתן להשתמש בהן לחקר SARS-CoV-2. מודלים מרובי מינים in vivo גם מפותחים במהירות כדי להבין טוב יותר את תגובות המארח לנגיף זה. מודלים in vivo ו-ex vivo שהיו או נמצאים בפיתוח נסקרו לאחרונה, כולל מודלים של בעלי חיים של עכברים, חמוסים, אוגרים ובעלי חיים לא אנושיים [104,105].

    תאי חיסון מולדים

    תפקוד לקוי של מערכת החיסון אופיינה בהרחבה בחולי COVID-19, כגון חוסר ויסות של תאי T, תאי B ותאי חיסון מולדים [106,107]. באופן ספציפי, שכיחות והפעלה מוגברת של תאי חיסון מולדים נצפתה בחולי COVID-19 עם מחלה קשה [108]. מעניין לציין כי ישנם הבדלים מורפולוגיים ותפקודיים משמעותיים במונוציטים שמקורם בחולי COVID-19 בהשוואה לתורמים אנושיים בריאים [109]. ניתוחים שלאחר המוות של איברים לימפואידים משניים מחולי COVID-19 אישרו את הביטוי של קולטן ACE2 ואת הנוכחות של נוקלאופרוטאין SARS-CoV-2 במקרופאגים CD169+ [110]. עם זאת, לא ברור אם SARS-CoV-2 יכול להדביק ולהשתכפל בתאי חיסון מולדים.

    דרגות שונות של כניסה ושכפול ויראלי נצפו בתאי חיסון מולדים ראשוניים הנגועים ב-SARS-CoV-1, MERS-CoV, HCoV-OC43 ו-HCoV 229E [111]. ביטוי מינימלי של קולטני מפתח הנדרשים לכניסת SARS-CoV-2, כולל ACE2 ו-TMPRSS2 בתאי חיסון מולדים כגון מונוציטים ומקרופאגים, דווח לאחרונה בפרימטים לא אנושיים [112] ובבני אדם [30]. בנוסף, מונוציטים יכולים לבטא רמות גבוהות של CD147 [113], קולטן פוטנציאלי לכניסת SARS-CoV-2 [114].

    שני פרסומים אחרונים זיהו שמונוציטים ראשוניים של CD14+ מתורמים אנושיים בריאים רגישים בקלות לזיהום SARS-CoV-2. פונטלי ועמיתיו הדגימו זאת על ידי הדבקת מונוציטים אנושיים ראשוניים ex vivo ב-SARS-CoV-2 ומדידת אנטיגנים ויראליים וישויות dsRNA בתאים נגועים [115]. הם הבחינו בירידה משמעותית בכניסה לנגיף כאשר מונוציטים נדבקו בנוכחות אמוניום כלוריד, מה שהצביע על כך שסביר להניח שהמסלול האנדוציטי חשוב. באופן דומה, Codo ועמיתיו צפו בזיהום של SARS-CoV-2 במונוציטים אנושיים ראשוניים בהתבסס על מדידה של תעתיקים ויראליים על ידי qPCR [116]. יתר על כן, הם הבחינו כי זיהום SARS-CoV-2 במונוציטים גורם להשראת גליקוליזה ולעלייה ברמות התעתיק של מספר גנים, כולל הקולטן העיקרי לכניסה נגיפית ACE2.

    בהתחשב בביטוי המינימלי של קולטן ACE2 במונוציטים, תצפיות אלה מפתיעות למדי. ניתוחים וירולוגיים מעמיקים יותר של שכפול פרודוקטיבי במונוציטים יחזקו מאוד את התצפיות בשני הפרסומים הנ"ל. יתר על כן, דרושים מחקרים נוספים כדי להבין טוב יותר אם (i) מונוציטים/מקרופאגים נחשפים ל-SARS-CoV-2 באמצעות זיהום ישיר באמצעות קישור ACE2 או באמצעות phagocytosis (ii) ACE2 מושרה במונוציטים נגועים ותאי אורח דרך הפרשת מתווכים דלקתיים ו-(iii) ביטוי של קולטני כניסה נוספים למארח כגון CD147 ו-Neuropilin-1 עשוי להתבטא במונוציטים כדי להקל על זיהום באופן בלתי תלוי ב-ACE2 [69].

    הערכה מתמשכת של הרגישות של תאי חיסון מולדים ל-SARS-CoV-2 תשפר מאוד את ההבנה הנוכחית שלנו לגבי אינטראקציות SARS-CoV-2-מארח, כמו גם את האימונופתוגנזה שנצפתה בחולי COVID-19.

    הערות לסיום

    בדיקה פנוטיפית לזיהוי מעכבים חדשים למחלות זיהומיות היא מאמץ יקר וגוזל זמן. ההחלטות החשובות ביותר הן הבחירה של קו תאים או מערכות מודל שבהן לערוך את המסך וזמינותם של מסכים משניים רלוונטיים כדי לבטל כניסות לא רלוונטיות ולתעדף את אלה שיש להם עניין פוטנציאלי. בהקשר זה, הערכת העוצמה האנטי-ויראלית לשכפול ויראלי SARS-CoV-2 צריכה לקחת בחשבון את השיקולים המרכזיים הבאים. ביטוי של קולטן ACE2 ופרוטאזות מארח מפתח ישפיעו על אופי הפגיעה שזוהו [117]. מסכים בתאי Vero E6 זיהו סוכנים המשפיעים על המסלול האנדוציטי כבעלי פעילות אנטי-ויראלית, אך ייתכן שתידרש חסימה של מסלולי כניסה ויראליים אנדוציטים ופני התאים בהקשר של זיהום קליני. בנוסף להבנת מסלולי הכניסה הנגיפים בהם משתמש SARS-CoV-2 בסוגי התאים הספציפיים המשמשים להקרנה, יש לקחת בחשבון את מידת ההפעלה והזרחון של נוקלאוטידים פרו-תרופתיים שנצפו במערכת ההקרנה החוץ גופית, כפי שברור. הפגינו לאחרונה [39]. מערכות מודל מתפתחות, כולל ALI ותרבויות אורגנואידיות, מבטיחות מערכות מימטיות מארחות להערכת מועמדים, אם כי יש להן מגבלות משלהן. לבסוף, התפקיד הפוטנציאלי של תאי חיסון מולדים בזיהום הוא שיקול חשוב נוסף. בחירת מערכות מודל חוץ גופיות מתאימות המשקפות היבטים מרובים של הביולוגיה של SARS-CoV-2 תהיה חיונית כדי לייעל את ההצלחה במאמצי גילוי תרופות נוכחיים ועתידיים.


    מידע תומך

    S1 איור. ניתוח פילוגנטי של מבודדי SARS-CoV-2 שנוצרו במחקר זה.

    ניתוח פילוגנטי של רצפים שנגזרו מ-14 מבודדי SARS-CoV-2 P2, יחד עם רצפי SARS-CoV-2 מ-Alm et al. [26] המייצגים מגוון ויראלי ברחבי אזור אירופה של ארגון הבריאות העולמי באותה מסגרת זמן. ווהאן/WH04/2020 (EPI_ISL_406801), השייכת לכיתה 19B, נבחרה כקבוצת החוץ. העץ צבעוני על בסיס חיפויי SARS-CoV-2 Nextstrain, עם עיגולים המציינים את מיקומם של 14 מבודדים של SARS-CoV-2 שנוצרו במחקר זה. סרגל הסולם מציין את מספר החלפות הנוקלאוטיד לאתר. SARS-CoV-2, תסמונת נשימתית חריפה קשה וירוס קורונה 2.

    איור S2. אפיון של מבודדים נבחרים של SARS-CoV-2 בתאי Vero-E6.

    (א) תאי Vero-E6 הודבקו במבודדי SARS-CoV-2 המצוינים ב-MOI של 0.01 PFU/תא. הסופרנטנטים נקצרו בזמנים שצוינו לאחר ההדבקה, וטיטר SARS-CoV-2 נקבעו על ידי בדיקת פלאק. הנתונים מייצגים ממוצעים וסטיות תקן מ-3 ניסויים עצמאיים, כאשר כל ניסוי מבוצע תוך שימוש בבאר בודדת אחת. הקו המקווקו חוצה את ציר ה-y ב-10 2 PFU/mL מציין את LoD הבדיקה. (ב) ערכי AUC עבור נתוני שכפול הנגיף המוצגים ב-(A), מנורמלים לטיטר חיסון של הבידוד המתאים. הנתונים מייצגים ממוצעים וסטיות תקן משלושת הניסויים הבלתי תלויים. ANOVA חד כיווני בוצע על נתונים שעברו טרנספורמציה של log2 כדי לבדוק הבדלים משמעותיים בין המבודדים הבודדים (ע' < 0.0001). כדי לבדוק מובהקות סטטיסטית מול BavPat1, לא מזווג ט נעשה שימוש בבדיקה על נתונים שעברו טרנספורמציה של log2 (**ע' < 0.005 ***ע' & lt 0.0005). לנתונים הבסיסיים, ראה S1 נתונים. AUC, אזור מתחת לעקומת LoD, מגבלת זיהוי MOI, ריבוי זיהום PFU, יחידה יוצרת פלאק SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה קשה וירוס קורונה 2.

    S3 איור. אפיון ואימות של תרבויות BEpC אנושיות ראשוניות.

    (אבמהלך התמיינות BEpC אנושית ראשונית (תורם 1) לאפיתל מדומה של דרכי אוויר ב-ALI, TEER נמדד מדי שבוע. הנתונים מייצגים ערכי TEER ממוצעים וסטיות תקן מ-3 בארות עצמאיות בכל נקודת זמן. (ב) BEpCs מובדל מתורם 1 נקבעו ונצבעו עבור תאים ריסים (ציאן β-טובולין), צמתים הדוקים (ZO-1 מגנטה) וגרעינים (כחול DAPI). סרגל קנה המידה מייצג 25 מיקרומטר. (ג) BEpCs מובדל מתורם 1 הודבקו מהצד האפיקלי ב-6,000 PFU של כל מבודד SARS-CoV-2 (ראה איור 2B). בזמנים שצוינו לאחר ההדבקה, נקצרו דגימות בזולטרליות, וטיטר נגיפים נקבעו על ידי בדיקת פלאק. הנתונים מייצגים ממוצעים וסטיות תקן מ-2 שכפולים עצמאיים. הקו המקווקו חוצה את ציר ה-y ב-10 2 PFU/mL מציין את LoD הבדיקה. לנתונים הבסיסיים, ראה נתונים S1. ALI, ממשק אוויר-נוזל BEpC, LoD של תא אפיתל הסימפונות, מגבלת זיהוי PFU, יחידה יוצרת פלאק SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה חמורה Coronavirus 2 TEER, התנגדות חשמלית טרנספיתל ZO-1, Zona occludens חלבון 1.

    איור S4. אפיון של מבודדים נבחרים של SARS-CoV-2 בתורמי BEpC אנושיים ראשוניים נוספים.

    (א' ו-ג') BEpCs מובדל מהתורמים 2 (A) ו- 3 (C) נדבקו ב-6,000 PFU של הבידוד המצוין SARS-CoV-2 מהצד האפיקלי. בזמנים שצוינו לאחר ההדבקה, נקצרו שטיפות אפיקאליות, וטיטר הנגיפים נקבעו על ידי בדיקת פלאק. הנתונים מייצגים ממוצעים וסטיות תקן מ-3 שכפולים עצמאיים. הקווים המקווקוים החוצים את צירי ה-Y ב-10 2 PFU/mL מציינים את LoD הבדיקה. (ב' ו-ד') ערכי AUC עבור נתוני שכפול הנגיף המוצגים ב-(A ו-C), מנורמלים לטיטר חיסון של הבידוד המתאים. הנתונים מייצגים ממוצעים וסטיות תקן משלושת הניסויים הבלתי תלויים. ANOVA חד כיווני בוצע על נתונים שעברו טרנספורמציה של log2 כדי לבדוק הבדלים משמעותיים בין המבודדים הבודדים (נ.ס. עבור תורם 2 ע' < 0.0001 עבור תורם 3). כדי לבדוק מובהקות סטטיסטית מול BavPat1 (D), לא מזווג ט נעשה שימוש בבדיקה על נתונים שעברו טרנספורמציה של log2 (*ע' & lt 0.05 **ע' < 0.01). יש לציין כי BavPat1 הציג פנוטיפ מוחלש בלתי מוסבר ב-BEpCs מתורם 2 (B), פנוטיפ לא מזווג ט נעשה שימוש במבחן על נתונים שעברו טרנספורמציה של log2 כדי לבדוק מובהקות סטטיסטית מול IMV3 (*ע' & lt 0.05 **ע' < 0.01). (ה) ייצוג Boxplot של ערכי AUC עבור נתוני שכפול הנגיף משלושת התורמים העצמאיים (נתונים מ-B ו-D ואיור 2C), מנורמלים לטיטר חיסון של המבודד והתורם המתאימים. מוצג חציון וסטיית תקן. המשולשים האדומים מייצגים נתונים שהתקבלו מתורם 1. לנתונים הבסיסיים, ראה נתונים S1. AUC, אזור מתחת לעקומה BEpC, LoD של תא אפיתל הסימפונות, מגבלת זיהוי PFU, יחידה יוצרת פלאק SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה קשה וירוס קורונה 2.

    S5 איור. צביעה אימונופלואורסצנטית עקיפה של תאים נגועים ב-SARS-CoV-2 ותאים ריסים ב-BEpCs מתורם 2.

    BEpCs מובדל מתורם 2 נדבקו מהצד האפיקלי ב-6,000 PFU של הבידוד המצוין SARS-CoV-2. ב-72 שעות שלאחר ההדבקה, תאים נקבעו, חולרו ונצבעו עבור נוכחות של תאים נגועים (dsRNA magenta) ותאים ריסים (ציאן β-טובולין). גרעינים נצבעו ב-DAPI (כחול). חיצים מציינים לוקליזציה משותפת. פסי קנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר עבור הגדלות של 20× ו-8 מיקרומטר עבור הגדלות של 100×. מוצגות תמונות הקרנה מקסימליות של z-stacks מניסוי אחד. BEpC, PFU של תאי אפיתל הסימפונות, יחידה יוצרת פלאק SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה חמורה וירוס קורונה 2.

    S6 איור. צביעה אימונופלואורסצנטית עקיפה של תאים נגועים ב-SARS-CoV-2 ותאי גביע ב-BEpCs מתורם 2.

    BEpCs מובדל מתורם 2 הודבקו מהצד האפיקלי ב-6,000 PFU של הבידוד המצוין SARS-CoV-2. ב-72 שעות שלאחר ההדבקה, תאים נקבעו, חולרו ונצבעו לנוכחות של תאים נגועים (dsRNA magenta) ותאי גביע (MUC5AC ציאן). גרעינים נצבעו ב-DAPI (כחול). חיצים מציינים לוקליזציה משותפת. פסי קנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר עבור הגדלות של 20× ו-8 מיקרומטר עבור הגדלות של 100×. מוצגות תמונות הקרנה מקסימליות של z-stacks מניסוי אחד. BEpC, PFU של תאי אפיתל הסימפונות, יחידה יוצרת פלאק SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה חמורה וירוס קורונה 2.

    S7 איור. צביעה אימונופלואורסצנטית עקיפה של תאים נגועים ב-SARS-CoV-2, תאי מועדון ותאי בסיס ב-BEpCs מתורם 2.

    BEpCs מובדל מתורם 2 נדבקו מהצד האפיקלי ב-6,000 PFU של הבידוד המצוין SARS-CoV-2. ב-72 שעות לאחר ההדבקה, תאים נקבעו, חולרו ונצבעו לנוכחות של תאים נגועים (dsRNA magenta), תאי מועדון (ציאן אוטרוגלובין) ותאי בסיס (צהוב P63). גרעינים נצבעו ב-DAPI (כחול). חיצים מציינים לוקליזציה משותפת. פסי קנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר עבור הגדלות של 20× ו-8 מיקרומטר עבור הגדלות של 100×. מוצגות תמונות הקרנה מקסימליות של z-stacks מניסוי אחד. BEpC, PFU של תאי אפיתל הסימפונות, יחידה יוצרת פלאק SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה חמורה וירוס קורונה 2.

    S8 איור. צביעה אימונופלואורסצנטית עקיפה של תאים נגועים ב-SARS-CoV-2 ותאים ריסים ב-BEpCs מתורם 3.

    BEpCs מובדל מתורם 3 נדבקו מהצד האפיקלי ב-6,000 PFU של הבידוד המצוין SARS-CoV-2. ב-72 שעות שלאחר ההדבקה, תאים נקבעו, חולרו ונצבעו עבור נוכחות של תאים נגועים (dsRNA magenta) ותאים ריסים (ציאן β-טובולין). גרעינים נצבעו ב-DAPI (כחול). חיצים מציינים לוקליזציה משותפת. פסי קנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר עבור הגדלות של 20× ו-8 מיקרומטר עבור הגדלות של 100×. מוצגות תמונות הקרנה מקסימליות של z-stacks מניסוי אחד. BEpC, PFU של תאי אפיתל הסימפונות, יחידה יוצרת פלאק SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה חמורה וירוס קורונה 2.

    S9 איור. צביעה אימונופלואורסצנטית עקיפה של תאים נגועים ב-SARS-CoV-2 ותאי גביע ב-BEpCs מתורם 3.

    BEpCs מובדל מתורם 3 נדבקו מהצד האפיקלי ב-6,000 PFU של הבידוד המצוין SARS-CoV-2. ב-72 שעות שלאחר ההדבקה, תאים נקבעו, חולרו ונצבעו עבור נוכחות של תאים נגועים (dsRNA magenta) ותאי גביע (MUC5AC ציאן). גרעינים נצבעו ב-DAPI (כחול). חיצים מציינים לוקליזציה משותפת. פסי קנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר עבור הגדלות של 20× ו-8 מיקרומטר עבור הגדלות של 100×. מוצגות תמונות הקרנה מקסימליות של z-stacks מניסוי אחד. BEpC, PFU של תאי אפיתל הסימפונות, יחידה יוצרת פלאק SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה חמורה וירוס קורונה 2.

    S10 איור. צביעה אימונופלואורסצנטית עקיפה של תאים נגועים ב-SARS-CoV-2, תאי מועדון ותאי בסיס ב-BEpCs מתורם 3.

    BEpCs מובדל מתורם 3 נדבקו מהצד האפיקלי ב-6,000 PFU של הבידוד המצוין SARS-CoV-2. ב-72 שעות לאחר ההדבקה, תאים נקבעו, חולרו ונצבעו לנוכחות של תאים נגועים (dsRNA magenta), תאי מועדון (ציאן אוטרוגלובין) ותאי בסיס (צהוב P63). גרעינים נצבעו ב-DAPI (כחול). חיצים מציינים לוקליזציה משותפת. פסי קנה מידה מייצגים 50 מיקרומטר עבור הגדלות של 20× ו-8 מיקרומטר עבור הגדלות של 100×. מוצגות תמונות הקרנה מקסימליות של z-stacks מניסוי אחד. BEpC, PFU של תאי אפיתל הסימפונות, יחידה יוצרת פלאק SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה חמורה וירוס קורונה 2.

    טבלה S1. ערכי Ct, ותוצאות הצלחה/כישלון של ניסיונות בידוד וירוסים, מ-67 דגימות של חולים שהיו חיוביות ל-PCR עבור SARS-CoV-2.

    Ct, סף מחזור SARS-CoV-2, תסמונת נשימתית חריפה קשה וירוס קורונה 2.

    טבלת S2. וריאנטים של רצף SARS-CoV-2 שזוהו על ידי NGS בחומר המטופל ומעבר 2 של בידודי וירוסים.

    NGS, הדור הבא של רצף SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה חמורה וירוס קורונה 2.

    טבלת S3. גרסאות של רצף SARS-CoV-2 שזוהו על ידי NGS במלאי עבודה (מעבר 3) של בידודי וירוסים.

    NGS, הדור הבא של רצף SARS-CoV-2, תסמונת נשימה חריפה חמורה וירוס קורונה 2.

    נתוני S1. ערכים מספריים בודדים העומדים בבסיס נתוני הסיכום המוצגים בלוחות האיורים.


    דִיוּן

    המגיפה הגלובלית המהירה של SARS-CoV-2 כבר היוותה איום גדול על בריאות האדם, מערכת הבריאות החברתית, הכלכלה הגלובלית ואפילו הממשל הגלובלי, והשפעות אלו עשויות להימשך ככל הנראה למשך זמן רב יותר. אנחנו צריכים ללמוד את ההיגיון המגיפה של SARS-CoV-2 וללמוד את הנגיפים הלא ידועים שנושאים על ידי חיות בר בטבע מראש כדי לתת אזהרה מוקדמת. ייתכן שתהיה התפרצות הנגרמת על ידי סוגים אחרים של וירוסים בפעם הבאה מלבד SARS-CoV-2. ניתן להתייחס לחוויות לימוד ושיעורים על וירוסים שונים זה לזה.

    הבנה מספקת של ההבדלים בין חלבונים מבניים ולא מבניים בין SARS-CoVs וקורונווירוסים אחרים עשויה לסייע לפיתוח תרופות לטיפול בזיהום SARS-CoV-2. החלבונים הלא מבניים של נגיף הקורונה שיכולים להדביק בני אדם דומים יחסית למבנה SARS-CoV-2. מלבד חלבון S, רוב החלבונים המבניים, כגון חלבון E וחלבון M, לא הראו הבדל משמעותי בארכיטקטורת החלבון בין SARS-CoV-2 לבין CoVs אנושיים ידועים אחרים. חלבון S של CoVs אחראי לקשירת הקולטן לפני השטח של התא המארח במהלך כניסת התא המארח. CoVs שונים מזהים קולטן משטח התא שונה. לדוגמה, MERS-CoVs מזהים את הקולטן dipeptidyl peptidase 4. עם זאת, SARS-CoV ו-SARS-CoV-2 מזהים את הקולטן ACE2. זו עשויה להיות הסיבה לכך שלCoVs שונים יש מנגנון כניסת מארח שונים. בנוסף, ל-SARS-CoV-2 RBD יש זיקה קשירה ל-hACE2 גבוהה יותר מזו של SARS-CoV RBD, התומך בכניסה יעילה לתאים. בניגוד ל-SARS-CoV, הכניסה של SARS-CoV-2 מופעלת מראש על ידי פרופרוטאין convertase פורין, מה שמפחית את התלות שלו בפרוטאזות של תאי המטרה לכניסה. הזיקה הקישורית הגבוהה ל-hACE2 של ה-RBD והפעלת הפורין מראש של הספייק מאפשרים ל-SARS-CoV-2 לשמור על כניסה יעילה לתאים תוך התחמקות ממעקב חיסוני. תכונות אלו עשויות לתרום להתפשטות הרחבה של הנגיף.

    בשל הידע המוגבל על SARS-CoV-2 כיום, אין תרופות או חיסונים טיפוליים מאושרים זמינים לטיפול ב-COVID-19. ככל שהמגיפה העולמית מחמירה, חיסונים יעילים ובטוחים, נוגדנים ותרופות ספציפיות נגד SARS-CoV-2 זקוקים בדחיפות. נוגדנים מנטרלים צפויים להיות יעילים עבור זיהום ב-SARS-CoV-2, אך העלויות, קנה המידה של הייצור ושיעורי הכיסוי שלהם הם עדיין שאלות. פיתוח חיסונים מתמודד גם עם קשיים כמו עמידה בזמנים וחוסר יעילות עקב תכנון לא מתחשב של חיסון ו/או מוטציה בנגיף.

    בניגוד לחיסון שיש לו מנגנון ומסלול ברורים יחסית בפיתוח, תרופות אנטי-ויראליות בעלות עוצמה גבוהה ובטיחות גבוהה עשויות להיות קשה יותר לפתח כיום בגלל ההבנה הלא מלאה שלנו על עולם הנגיפים וההיענות של המארח. ייתכן שזו הסיבה לכך שאין תרופה אנטי-ויראלית אחת מספקת עד כה. הפוטנציאל in vivo השפעה רעילה של תרופה אנטי-ויראלית הנטענת יעילה בַּמַבחֵנָה עשוי להציף באופן מאכזב את מחיאות הכפיים התרופתיות שלו. דרושים רעיונות ומסלולים חדשים ובלתי שגרתיים של עיצוב ופיתוח תרופות אנטי-ויראליות כדי להתגבר על החסרונות של מחקר התרופות המבוסס על רדוקציוניזם הנוכחי.בהיבט זה, ניתן לשקול את הרפואה הסינית המסורתית המבוססת על ההוליזם, במיוחד פורמולות הצמחים הרפואיים הסיניים, אשר הוכחו כיעילות במאבק נגד COVID-19 בסין (Ang etਊl., 2020 Luo etਊl., 2020 Ren et& #xa0al., 2020 Zhang et al., 2020a Zhong etਊl., 2020), אם כי יש צורך במחקרים מכניסטיים נוספים וניסויים קליניים בקנה מידה גדול.

    לאחרונה, מדינות רבות בעולם הגדילו את ההשקעה שלהן במחקר ופיתוח של תרופות אנטי-ויראליות, נוגדנים וחיסונים. האצת הפיתוח של חיסונים היא כנראה דרך המפתח הנוכחית לפתרון האסון העולמי הזה. באמצעות מאמצים משותפים ברחבי העולם, אנשים יכולים לפתח טכנולוגיות אנטי-SARS-CoV-2 יעילות, בתקווה בעתיד הקרוב.


    תוצאות

    שפע פרוטאומים ויציבות תרמית לאחר זיהום SARS-CoV-2

    מכיוון שפתוגנים ויראליים צריכים לחטוף מכונות חלבון מארח אנדוגני לצורך שכפולם, הנחנו כי TPP יהיה אמצעי רב עוצמה לחשוף שינויים רלוונטיים תפקודית במהלך הדבקה ב-SARS-CoV-2 (Savitski et al, 2014). כדי ליצור פרופילי יציבות תרמית רחבי פרוטאום בזרימת עבודה טיפוסית של TPP, מנות תאים נתונים לעשר טמפרטורות שונות כדי לקדם באתרו התפתחות חלבון. לאחר מכן מעבדים תאים, חלבונים בלתי מסיסים מוסרים, ושבריר החלבון המסיס הנותר בכל טמפרטורה נאסף ומנתח עם פרוטאומיקה כמותית מבוססת ספקטרומטריית המונים (בכר et al, 2016, 2018). כדי להבטיח תאימות עם סביבת עבודה BSL3, התאמנו תחילה את פרוטוקול ה-TPP הסטנדרטי שלנו (Franken et al, 2015) על ידי החלפת שלבי צנטריפוגה - שבדרך אחרת יכולים להוביל ליצירת אירוסולים המכילים פתוגנים הנישאים באוויר - בשלב סינון הנעזר בוואקום להסרת אגרגט חלבון שניתן לבצע בתוך ארון זרימה למינרית מסוננת HEPA (איור 1A ראה חומרים ושיטות לפרטים). אישרנו ששלב זה היה יעיל כמו הליך הצנטריפוגה הקודם (נספח איור S1A ו-B).

    איור 1. הערכה גלובלית של שפע מארח ושינויי יציבות תרמי במהלך זיהום SARS-CoV-2

    1. מונו-שכבות Caco-2 המורכבות מ-1.5e 6 תאים לדגימה הודבקו ב-SARS-CoV-2 ב-MOI של 0.5 (ראה חומרים ושיטות). שלושה שכפולים בלתי תלויים ביולוגית נאספו בכל נקודת זמן. דגימות הועברו ל-2D-TPP מבוסס סעפת ואקום. לאחר הסרת חלבונים בלתי מסיסים, השברים המסיסים הנותרים סומנו בתגי מסה איזובריים (TMTpro) כדי לאפשר כימות חלבון. דגימות שולבו בפריסת 2D-TPP על מנת להשוות יציבות תרמית חלבון ושפע לאורך כל מהלך זמן ההדבקה (בכר et al, 2018). הלא נגוע (ט−1) נקודת הזמן שימשה כהתייחסות לחישוב שינויים בקפלים (FC). שינויים משמעותיים בחלבונים (שפע ויציבות תרמית) מיוצגים כחלקות מעגל לחלבונים בודדים, כפי שתואר קודם לכן (בכר et al, 2018). המעגל הפנימי מתאים לשפע חלבון והמעגל החיצוני מתאים לשינויי יציבות תרמית (נ = 3).
    2. תאי Caco-2 הודבקו ב-SARS-CoV-2 לפי (A). תאים נשטפו, קבועים והוצבעו ב-DAPI (כחול) כדי להמחיש את גרעיני התא והודגרו עם נוגדן אנטי-N-חלבון (אדום) כדי להמחיש תאים נגועים ב-SARS-CoV-2. פס קנה מידה מציין 10 מיקרומטר.
    3. שיעורי ההדבקה חושבו באמצעות תוכנת הדמיה אוטומטית (ראה חומרים ושיטות) שחושבו משישה שדות ראייה לכל נקודת זמן לכל שכפול ביולוגי. נקודת הנתונים מציינת את אמצעי המדגם והשגיאה חוסמת את השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (SEM) (נ = 3).
    4. SARS-CoV-2 זוהה חלבונים משורטטים כפונקציה של זמן כאשר כל נקודת נתונים מציינת שכפול שונה (נ = 3).

    לאחר מכן יישמנו את זרימת העבודה המותאמת של TPP כדי ללמוד כיצד זיהום SARS-CoV-2 משנה את היציבות והשפע התרמית של פרוטאום המארח. תאי Caco-2, המתירים לזיהום SARS-CoV-2 (Stanifer et al, 2020 Bojkova et al, 2020), הודבקו בשלושה עותקים ב-SARS-CoV-2 בריבוי זיהום (MOI) של 0.5 למשך שעה אחת, לאחר מכן הוסרו חלקיקים ויראליים לא קשורים ודגימות נקצרו ב-1, 2, 4, 7, 12, 24 ו-48 שעות לאחר זיהום (איור 1A). ארבע שעות לאחר הוספת הנגיף

    5.2% מהתאים נדבקו, כאשר שיעורי הזיהום בתאים הגיעו לשיא של כ-18% עד 24 שעות (איור 1B ו-C). בכל נקודת זמן, דגימות נקצרו ועובדו באמצעות הסרת אגרגט מבוסס ואקום כמתואר לעיל ונותחו על ידי פרוטאומיקה כמותית מבוססת ספקטרומטריה (איור 1A).

    זיהינו 7,414 חלבונים עם לפחות שני פפטידים ייחודיים. זה כלל שלושה חלבונים ויראליים: ה-Spike glycoprotein (S), הנוcleoprotein (N) ו-Orf9b. שינויים בשפע של שלושת החלבונים הללו לאורך זמן שיחזרו במידה רבה את תצפיות המיקרוסקופיה לשכפול ויראלי (איור 1D). קינטיקה של התפשטות SARS-CoV-2 וכיסוי החלבון הנגיפי היו דומות לאלו שדווחו בעבר בתאי Caco-2 (Bojkova et al, 2020). לאחר מכן חישבנו שינויים בשפע ביחס לבקרה הלא נגועה עבור 5,564 חלבונים (זוהה בשתי הטמפרטורות הנמוכות ביותר לפחות בשני שכפולים), ושינויי יציבות תרמית עבור 4,076 חלבונים (זוהה בשתי הטמפרטורות הנמוכות ביותר לפחות בשני שכפולים ובסך הכל זוהה בעשר טמפרטורות לפחות מערך נתונים EV1 ראה חומרים ושיטות לפרטים). מתוכם, 350 חלבונים הראו שינויים משמעותיים בשפע (|ז-ציון| > 1.96 ו ש-ערך < 0.05 ראה חומרים ושיטות לפרטים) ו-278 חלבונים הראו שינויים ביציבות התרמית בנקודת זמן אחת לפחות (Dataset EV1, נספח איור S2). בהתאם לתצפיות קודמות, רוב השינויים בשפע החלבון היו תוצאה של ויסות מטה (62.9% מהשינויים בשפע הכוללים 220 חלבונים בסך הכל) (Bouhaddou) et al, 2020), בעוד ששינויי יציבות נשלטו על ידי אי יציבות חלבון (61.9% משינויי היציבות התרמית הכוללים: 172 חלבונים בסך הכל) (איור 2A ונספח איור S2). לדוגמה, ראינו עלייה מוקדמת בשפע של חלבונים לתעתוק מארח וחלבונים הקשורים לתרגום (כולל תהליכים הקשורים לנגיפים), במיוחד בשעה הראשונה של ההדבקה, בעוד ששינויי יציבות תרמי של תהליכים אלה נשמרו בעיקר לאורך כל מהלך זמן ההדבקה ( איור 2B ומערך נתונים EV2). חלבונים הקשורים לתרגום מיטוכונדריאלי השתנו רק בשפע ב-2 השעות הראשונות של ההדבקה, וחלבונים הקשורים לעיצוב ציטושלד וקיפול חלבונים השתנו רק ביציבות התרמית בעיקר לקראת שלבי ההדבקה המאוחרים יותר (איור 2B ו-Dataset EV2). פגיעות הקשורות לקיפול חלבונים היו בעיקר תוצאה של חוסר יציבות תרמי וחלבוני היצמדות תא-תא היו בעיקר מיוצב תרמית (נספח איורים S3 ו-S4, ו-Dataset EV2). לסיכום, אנו חושפים מפה עשירה ודינמית של שפע חלבון המארח ושינויי יציבות תרמית לאחר זיהום ב-SARS-CoV-2 שעשויות לייצג מטרות רלוונטיות טיפולית חדשות.

    איור 2. שפע חלבון גלובלי ויציבות תרמית משתנים לאחר זיהום ב-SARS-CoV-2

    1. המספר הכולל של חלבונים בעלי ויסות גבוה או מטה באופן משמעותי (|ז-ציון| > 1.96, ש-ערך < 0.05) לנקודת זמן של תאי Caco-2 הנגועים ב-SARS-CoV-2 כמתואר באיור 1A. חלבונים ששונו באופן משמעותי בשפע (משמאל) וביציבות תרמית (ימין) מחולקים בתת-קבוצות לפי הורדת ויסות/התייצבות (אדום) או ויסות/ייצוב כלפי מעלה (טורקיז).
    2. Gene Ontology (GO) תהליך ביולוגי והעשרת מסלולים של מסלולים נבחרים. ראה ערכת נתונים EV2 להעשרה של תהליך ביולוגי של מונח GO ומסלול.

    שינויים ביציבות תרמית הנגרמות על ידי SARS-CoV-2 מתכנסים ל-PPIs ויראלי מארח וויסות פוספוסיטים

    לאחר מכן, שאלנו האם חלבונים המשתנים בשפע או ביציבות תרמית במהלך זיהום ב-SARS-CoV-2 משתתפים גם ב-PPI של מארח ויראלי ו/או בעלי פוספוסיטים המווסתים באופן דיפרנציאלי לאחר זיהום ב-SARS-CoV-2 (Bouhaddou). et al, הדפסה מוקדמת 2020: Samavarchi-Tehrani et al, 2020 גורדון et al, 2020ב). לשם כך, השווינו את רשימת החלבונים הזו למערכי נתונים שנרכשו בעבר ברחבי פרוטאום המתארים PPIs של SARS-CoV-2-מארח וויסות פוספוסיטים לאחר זיהום (Bouhaddou et al, 2020 גורדון et al, 2020ב). מצאנו חפיפה של 30 חלבונים ששינו את השפע או היציבות התרמית והוכחו בעבר כבעלי אינטראקציה פיזית עם פיתיונות ויראליים בניסויים בספקטרומטריית מסה טיהור זיקה (AP-MS) (Gordon) et al, 2020b נספח איור S5A) ו-204 חלבונים בניסויי BioID (הדפסה מוקדמת: Samavarchi-Tehrani et al, 2020) (נספח איור S5B). בנוסף, 107 מהחלבונים עם שפע שונה או יציבות תרמית הפגינו גם מצבי זרחון משתנים במהלך זיהום SARS-CoV-2 (נספח איור S5C Bouhaddou et al, 2020). לפיכך, חלבונים המציגים שינויים מרובים בשפע, יציבות תרמית ו/או מצב האינטראקציה או הזרחון שלהם מספקים תמיכה מולקולרית נוספת לתפקידם התפקודי במהלך זיהום SARS-CoV-2. חשוב לציין, רוב החלבונים המשתנים ביציבות התרמית היו ייחודיים לניסוי ה-TPP. כפי שנדון להלן, חלק מהפגיעות הללו הן מטרות ישירות של תרופות מעכבות SARS-CoV-2, מה שמצביע על כך ש-TPP מספק מידע אורתוגונלי על הביולוגיה של זיהום SARS-CoV-2.

    כדי להבין כיצד שינויים ביציבות תרמית קשורים לשינויים בתהליכים התאיים של המארח, השתמשנו בחלבונים בעלי יציבות תרמית שונה כדי לזרוע רשת שהופצה לאחר מכן באמצעות חלבוני מארח שהוכחו בעבר כמקיימים אינטראקציה עם חלבוני SARS-CoV-2 או מפגינים הפרעות בוויסות הפוספוסיטים במהלך זיהום SARS-CoV-2 (Bouhaddou et al, 2020 גורדון et al, 2020b איור 3A). לאחר התפשטות הרשת, בוצע אשכול לפיצול הרשת למודולים המכילים חלבונים עם פונקציות ביולוגיות קשורות. ניתוח מסלול ביולוגי חשף התכנסות בולטת של ויסות פרוטאום המארח (יציבות תרמית או פוספוסיט) ואינטראקציות פיזיות (PPIs ויראלי-מארח) בתוך תהליכי ליבה תאיים, כולל חלבונים המעורבים בוויסות מחזור התא, ארגון מיקרוטובוליות וויסות שחבור mRNA (איור 3A ו-B). יש לציין שחלבונים המעורבים בחבור RNA (מודול M-3) (למשל SNRNP70, SNRPGP15, SRSF10, SNRPG, SRSF1, SRSF7, SRRM1 ו-LUC7L3) היו מעורערים תרמית בעקביות שעתיים לאחר ההדבקה (איור 3C). הפרעות במכונות שחבור ה-RNA תואמות לדיווחים האחרונים המדגימים שינויים בשפע (Bojkova et al, 2020) ומצבי זרחון (Bouhaddou et al, 2020) של חלבונים הקשורים לחבורת RNA במהלך זיהום SARS-CoV-2. חשוב לציין, הדרישה התפקודית לתפקוד spliceosome בזיהום SARS-CoV-2 הוכחה בעבר באמצעות מעכב spliceosome, pladienolide B, אשר דיכא את שכפול ה-SARS-CoV-2 (Bojkova et al, 2020). מעניין לציין שחלבון SARS-CoV-2 nsp16 משבש אירועי שחבור mRNA באמצעות קישור של תחומי זיהוי ה-mRNA U1/U2 snRNAs, ובכך מונע תרגום של מוצרי גנים אנטי-ויראליים (Boudreault et al, 2019 מרנון et al, 2020 בנרג'י et al, 2020 ).

    איור 3. ניתוח רשת של מערכי נתונים משולבים של SARS-CoV-2

    1. רשת של חלבונים המשתנים או ממוקדים בדרך כלל במהלך זיהום SARS-CoV-2. חלבונים המציגים שינויים משמעותיים ביציבות התרמית שימשו כזרעים לבניית הרשת. זיהום ב-SARS-CoV-2 מווסת פוספוסיטים והקינאזות החזויות שלהם במעלה הזרם, כמו גם אינטראקציות חלבון-חלבון בין פיתיונות ויראליים וחלבוני טרף מארח שימשו להפצת הרשת. לאחר התפשטות הרשת, בוצע אשכול לפיצול הרשת למודולים (ראה חומרים ושיטות). העשרה במונחי GO עבור כל מודול מוצגות מימין למטה. נתוני היציבות התרמית של חלבון הם ממחקר זה, ואילו ויסות זרחון/קינאז (Bouhaddou et al, 2020) ואינטראקציה ויראלית-אנושית חלבון-חלבון (Gordon et al, 2020b ) נתונים נרכשו מעבודות קודמות ושימשו להפצת להיטי ה-TPP שגרמו לרשת זו. כל פגיעות היציבות התרמית של TPP לכל מודול מוצגות.
    2. לאחר מכן בוצעו שתי בדיקות סטטיסטיות ברשת שנוצרה מ- (A). ראשית, כדי להעריך אם המודולים מועשרים ב-TPP (מבחן פישר), ושנית, כדי לקבוע אם הם קיבלו כמות משמעותית של אות התחלה (מבחן KS). קו אדום מקווקו מייצג סף מובהקות (פ-adj < 0.05).
    3. מפת חום המציגה את נקודת הזמן שבה נמצאות פגעי TPP בתוך כל מודול המוגדר ב-(A). אריח ירוק מצביע על שינויים משמעותיים ביציבות התרמית.

    יתר על כן, צפינו בשינויים בולטים ביציבות התרמית של מרכיבים מבניים של דסמוזומים המעורבים בהיצמדות תא-תא desmoplakin (DSP) היה מעורער תרמית בין 7 ל-24 שעות של זיהום בעוד desmoglein-2 (DSG2) ו-plakophilin-2 (PKP2) ) הראה ייצוב תרמי לקראת נקודות זמן מאוחרות יותר (איור 3A, ו-Dataset EV1). עשויות להיות לכך השלכות על התפשטות SARS-CoV-2, שכן הוכח כי וירוסים אחרים מכוונים לחלבוני צומת תא-תא כדי להקל על התפשטותם לתאים שכנים (Mateo et al, 2015 ).

    זיהינו חוסר יציבות חזק של אינוזין-5'-מונופוספט דהידרוגנאז 2 (IMPDH2) החל מ-4 שעות לאחר ההדבקה (איור 4A). IMPDH2 מזרז את ההמרה של אינוזין 5'-פוספט (IMP) ל-xanthosine 5'-פוספט (XMP), שהוא שלב מגביל קצב של דה נובו ביו-סינתזה של גואנין. עיכוב של IMPDH2 עם ריבאווירין האנטי ויראלי הוכח בעבר כמדכא את שכפול SARS-CoV-2 (Bojkova et al, 2020), וכך גם הביטול הגנטי שלו (Gordon et al, 2020א). תוצאות אלו מספקות הוכחה נוספת לכך ש-IMPDH2 משתנה פונקציונלית במהלך זיהום, אולי על ידי אינטראקציה ישירה עם nsp14, ומספקות תובנה מולקולרית נוספת מדוע עיכוב תרופתי של IMPDH2 מדכא ביעילות את שכפול SARS-CoV-2.

    איור 4. שינויים ביציבות תרמית בחלבוני מארח ממוקדי SARS-CoV-2

    1. IMPDH2 היה מעורער בעקביות מ-4 שעות לאחר זיהום SARS-CoV-2. הוכח בעבר כי IMPDH2 יוצר אינטראקציה חלבון-חלבון עם nsp14 (קו ירוק) (גורדון et al, 2020b) ולהיות גורם מכריע בתמיכה בשכפול SARS-CoV-2 (גורדון et al, 2020א). ל-SARS-CoV-1 nsp14 תפקיד כפול בתיקון חוסר התאמה של זוג בסיסים וסינתזה של ה-5′ כובע עשיר בגואנין של RNA ויראלי (Chen et al, 2009 Smith & Denison, 2013 Smith et al, 2015). יציבות תרמית מעגלית וחלקות שפע הן מתאי Caco-2 הנגועים ב-SARS-CoV-2 כמתואר באיור 1A (ראה גם איור 1A לאגדת העלילה). כוכבית מציינת ויסות משמעותי (ראה חומרים ושיטות).
    2. ערעור תרמי של UGDH ו-PAAF1 חופפים זמנית, ושניהם הראו בעבר אינטראקציה עם חלבוני SARS-CoV-2 nsp6 (UGDH), ו-M (UGDH ו-PAAF1) (הדפסה מוקדמת: Samavarchi-Tehrani et al, 2020). PAAF1 מווסת לרעה את הפרוטאזום על ידי שליטה בהרכבה/פירוק שלו (Park et al, 2005) ונקשר בעבר לתעתוק של HIV-1 (Lassot et al, 2007 נאקאמורה et al, 2012). שינויים משמעותיים בחלבונים (שפע ויציבות תרמית) מיוצגים כחלקות מעגל לחלבונים בודדים, כפי שתואר קודם לכן (בכר et al, 2018). המעגל הפנימי מתאים לשפע חלבון והמעגל החיצוני מתאים לשינויי יציבות תרמית (נ = 3). כוכבית מציינת ויסות משמעותי (ראה חומרים ושיטות).
    3. שפע הפוספופפטיד של SAFB משתנה במהלך זיהום SARS-CoV-2. נתוני פוספופפטיד של תאי Vero מ- (Bouhaddou et al, 2020). נתונים שנרכשו בעבר מתאי Vero נגועים ב-SARS-CoV-2 (Bouhaddou et al, 2020). S604 פוספוסיט החופף זמנית עם ערעור תרמי של SAFB (הדפסה מוקדמת: פוטל et al, 2020). מוצגים מעל עלילת הקו הם פרופילי היציבות והשפע של SAFB בתאי Caco-2 נגועים ב-SARS-CoV-2 כמתואר באיור 1A (נ = 3). כוכבית מציינת ויסות משמעותי (ראה חומרים ושיטות).
    4. פרופיל יציבות תרמית עבור כל פפטידי SAFB ללא שינוי (ירוק) וה-S604 הפוספוריל (pS604) (סגול) בתאי HeLa. נתונים מפוטל et al (הדפסה מוקדמת: פוטל et al, 2020 ).

    מצאנו שחלבון הביוסינתזה של גליקוזאמינוגליקן UDP-glucose 6-dehydrogenase, UGDH ומעכב 26S פרוטאזומלי, PAAF1, היו שניהם מעורערים בזיהום SARS-CoV-2 (איור 4B). חשוב לציין, גם UGDH וגם PAAF1 נדרשים עבור זיהום SARS-CoV-2 (הדפסה מוקדמת: Wang et al, 2020), ו-nsp6 נמצא בעבר כמקיים אינטראקציה פיזית עם UGDH, והגליקופרוטאין M של הממברנה הנגיפית עם UGDH ו-PAAF1 בניסויים BioID (הדפסה מוקדמת: Samavarchi-Tehrani et al, 2020) (איור 4B). נתונים אלו מצביעים על כך שחוסר יציבות תרמי של UGDH ו-PAAF1 במהלך זיהום SARS-CoV-2 לוכד שינויים רלוונטיים מבחינה תפקודית במצבם הביו-פיזי המשפיעים על התפשטות SARS-CoV-2.

    דיווחנו בעבר שזרחון חלבון, במקרים מסוימים, מתאים לשינויים ביציבות התרמית של החלבון (הדפסה מוקדמת: פוטל et al, 2020). שמנו לב שכמה אירועי זרחון שצפינו בעבר (Bouhaddou et al, 2020) במהלך זיהום ב-SARS-CoV-2 חל באופן זמני עם שינויים ביציבות התרמית של החלבון, במיוחד בנקודות זמן מוקדמות יותר. לדוגמה, זרחון של S604 על גורם ההתקשרות של גורם התעתיק B1 (SAFB), עלה בקנה אחד עם חוסר היציבות שלו שהתחיל ב-1 hpi והגיע למשמעות ב-2 hpi (Bouhaddou et al, 2020 איור 4C). הוכחנו בעבר שזרחון של S604 קשור עם ערעור תרמי של SAFB (הדפסה מוקדמת: פוטל et al, 2020 איור 4D), המציע כי זיהום ב-SARS-CoV-2 מקדם ערעור תרמי של SAFB על ידי זרחון ב-S604. בהתאם לתפקיד של S604 בוויסות תפקוד SAFB, שפע החלבון של גני המטרה של SAFB FBL, RPS15 ו-TAF15 עלה במקביל לרמות S604 (נספח איור S6A). יש לציין כי מוצר גן המטרה SAFB LARP1 נמצא בעבר כמקיים אינטראקציה עם החלבון SARS-CoV-2 N, וגן המטרה neuroguidin (NGDN) עם החלבון SARS-CoV-1 nsp9 (Gordon et al, 2020 א , 2020 ב ). המאשר את הרלוונטיות התפקודית עבור SARS-CoV-2, לאחרונה הוכח כי NGDN נדרש עבור התפשטות SARS-CoV-2 (הדפסה מוקדמת: Wang et al, 2020). ממצאים אלה מרמזים על משחק גומלין זמני פוטנציאלי בין SARS-CoV-2 ו-SAFB, לפיו זרחון של S604 על SAFB גורם לביטוי של חלבונים הממוקדים ישירות על ידי SARS-CoV-2 במהלך זיהום.

    למספר מלווים מארח היו שינויים עמוקים ביציבות התרמית במהלך זיהום SARS-CoV-2.לדוגמה, מרכיבי הליבה של קומפלקס הצ'פרונים האנושיים (TRiC/CCT) התייצבו בצורה קלה תרמית בשלב מוקדם של ההדבקה, בעוד שהם היו מעורערים מאוד בשלבי הדבקה מאוחרים יותר (נספח איור S6B). קומפלקס זה נדרש לשכפול וירוס השפעת, שם הוכח שהוא יוצר קומפלקס חלבון עם תת-יחידת המשנה של RNA פולימראז ויראלית PB2 (Fislová) et al, 2010). בנוסף, מספר מלווים של הלם חום מארח היו מעורערים תרמית (למשל HSP90AB1, HSP90AA1, HSPB1, HSPA8), שחלקם מכילים גם פוספוסיטים מווסתים דיפרנציאלית לאחר זיהום SARS-CoV-2 (Bouhaddou) et al, 2020). לדוגמה, ערעור תרמי של HSPB1 היה קשור עם זרחון מוגבר של S15, S78 ו/או S82 (נספח איור S6C). בפרט, S78 ו/או S82 פועלים כמתג קונפורמטיבי אשר ממלא תפקיד חשוב בוויסות היווצרות דימר HSPB1 ומקדם פעילות מלווה (Choi et al, 2019). ביחד, ממצאים אלה מוכיחים ש-TPP מספק תובנה מולקולרית נוספת לגבי מסלולים שהיו מעורבים בעבר בזיהום ב-SARS-CoV-2, כמו גם מרמזים על מסלולים חדשים בזיהום ב-SARS-CoV-2.

    ההשפעות האנטי-ויראליות של מלווה הלם חום ומעכבי ציטוכרום P450

    חקרנו האם יציבות תרמית או שינויים בשפע יכולים לחשוף חלבוני מארח רלוונטיים מבחינה תפקודית שניתן לנצל כמטרות תרופות פוטנציאליות לחסימת שכפול של SARS-CoV-2. בהתבסס אך ורק על היכולת שלנו למצוא תרכובות המווסתות באופן סלקטיבי את הפעילות של חלבוני המארח ששונו משמעותית בנתונים שלנו, הרשמנו ידנית שבעה חלבוני מטרה מארח שניתן לסמים בהם, אשר מצאנו שהם מציגים שפע שונה (CYP1A1: מעוכב על ידי rhapontigenin) או יציבות תרמית (CAPN1) : PD-150606, IMPDH1/2: ribavirin וחומצה מיקופנולית, HSP90: tanespimycin, PTRG1: חומצה אצטילסליצילית ודיקלופנק, CTSV: E64d ו-CA-074-Me) לאחר זיהום ב-SARS-CoV-2. כדי לתת את הדעת על ההשפעות של התרכובות הן על כניסת הנגיפים והן על שכפול, תאים טופלו מראש בתרכובות ואלה נשמרו לאורך כל הניסוי. היכולת של התרכובות שנבדקו לעכב שגשוג SARS-CoV-2 הוערכה על ידי כימות כמות ה-RNA הנגיפי הדו-גדילי לאחר 20-24 שעות לאחר ההדבקה והשפעותיהן על כדאיות התא נבדקו במקביל על תאים לא נגועים. שתיים מהתרכובות שנבדקו דיכאו את התפשטות SARS-CoV-2 (איור 5) (נדון להלן). התרכובות האחרות לא הראו כל השפעה על התפשטות SARS-CoV-2 בטווח הריכוזים שנבדק (נספח איור S7A-H), זה לא שולל שהן יכולות להיות פעילות בשילוב עם תרופות אחרות או במערכות תאים שונות, כמו גם מקרה עבור ribavirin (Bojkova et al, 2020) ומעכב CAPN1 (Ma et al, 2020 ).

    איור 5. שינויים בשפע ויציבות 2D-TPP חושפים מטרות מארח רלוונטיות מבחינה תפקודית במהלך זיהום ב-SARS-CoV-2

    1. חלבוני הלם חום, HSP90AA1 ו-HSP90AB1, היו מעורערים תרמית במהלך זיהום SARS-CoV-2 של תאי Caco-2 (חלקות מעגליות, צד שמאל (נ = 3) ראה איור 1A לאגדת עלילה מעגלית). שינויים משמעותיים בחלבונים (שפע ויציבות תרמית) מיוצגים כחלקות מעגל לחלבונים בודדים, כפי שתואר קודם לכן (בכר et al, 2018). המעגל הפנימי מתאים לשפע חלבון והמעגל החיצוני מתאים לשינויי יציבות תרמית (נ = 3). כוכבית מציינת ויסות משמעותי (ראה חומרים ושיטות).
    2. מעכב HSP90 המקביל, Tanespimycin, דיכא ביעילות את התפשטות SARS-CoV-2 (נ = 2). תאי Calu-3 הודגרו מראש עם התרכובת, ולאחר מכן הוספת SARS-CoV-2 ולאחר מכן דגירה משותפת בנוכחות התרכובת למשך 20-24 שעות. עומס נגיפי כמתה במקביל באמצעות זיהוי מבוסס נוגדנים של RNA דו-גדילי (כתום). רעילות התרכובת בתאי Calu-3 הוערכה (סגול) שטופלה בתרכובת לבדה במשך 20-24 שעות.
    3. הידרוקסילאז פחמימני אריל (CYP1A1) עלה בשפע בין 4 ל-12 שעות לאחר ההדבקה ולאחר מכן הופחת בין 24 ל-48 שעות לאחר ההדבקה (חלקה מעגלית, משמאל, (נ = 3) ראה איור 1A לאגדת עלילה מעגלית). חלקות מעגליות המוצגות כמתואר בלוח A. כוכבית מציינת ויסות משמעותי (ראה חומרים ושיטות).
    4. מעכב CYP1A1 דיכא שגשוג SARS-CoV-2 (נ = 2). עקומות מינון-תגובה בוצעו כמתואר באיור 4A. ראה נספח איור S7 לתרופות נוספות שנבדקו. הנתונים המוצגים כמתואר ב-(ב).

    ערעור היציבות התרמי הרחב והעקבי של מלווים המעורבים בקיפול חלבון פרוש הצביע על שינוי עולמי במעורבותם בחלבוני לקוח לא מקופלים (איור 2B). זה יכול לנבוע מהעלייה הדרסטית בתפוסת המלווה עם כמויות גדולות של מצעי חלבון ויראלי לא מקופל, מה שעשוי לתרגם לשינוי שניתן לזהות ביציבות התרמית של המלווה. אימתנו את הרלוונטיות התפקודית של אי-יציבות תרמית של HSP90AA1 ו-HSP90AB1 (איור 5A) באמצעות המעכב הסלקטיבי tanespimycin, אשר דיכא ביעילות שכפול ויראלי בריכוזים מיקרומולריים נמוכים (EIC50

    2 מיקרומטר) שלא היו רעילים לתאים האנושיים (איור 5B). בנוסף, זיהינו עלייה בולטת בשפע ה-CYP1A1 בין 4 ל-12 שעות לאחר ההדבקה, ולאחר מכן נרשמה ירידה חזקה בין 24 ל-48 שעות לאחר ההדבקה (איור 5C). מעניין שטיפול במעכב CYP1A1 הסלקטיבי, rhapontigenin, דיכא שגשוג SARS-CoV-2 בטווח המיקרומולרי (EIC50

    יחד, תוצאות אלו מוכיחות ששינויים בשפע החלבון או ביציבות התרמית יכולים להציע מטרות מולקולריות לעיכוב שכפול ויראלי. זה מראה את התועלת של TPP לחשיפת מסלולי מארח רלוונטיים לזיהום, שיכולים לזרז את הזיהוי של טיפולים אנטי-ויראליים פוטנציאליים.


    הפניות

    קורנליה סי ברגמן, et al. (2006) זיהום בנגיף הקורונה של מערכת העצבים המרכזית: התמודדות מארח וירוס. טבע ביקורות מיקרוביולוגיה. 4, 121-132.
    פול ס. מאסטרס. (2006) הביולוגיה המולקולרית של קורונה. מחקר וירוסים. 66, 193–292.
    סטנלי ג'י סוויקי, (2007) השקפה עכשווית של תמלול קורונה. J Virol. 81(1): 20–29.
    איזבל סולה, et al. (2011) אינטראקציות RNA-RNA ו-RNA-חלבון בשכפול ותעתוק נגיף הקורונה. RNA Biol. 8(2): 237–248.


    צפו בסרטון: 2019 Novel Coronavirus - SARS CoV 2 (אוֹקְטוֹבֶּר 2022).